2017-临床检验主管技师全化学讲义

1、酶催化活性浓度和代谢物浓 度酶法检测技术一、酶活性的定义及酶活性指酶催化反应的能力即酶促反应速度。表示常用国际。1min 能转化 1 微摩尔底物（mol）的酶量为一个国际（molmin）。用 SI 制表示的酶活性为 Katal（催量）。每秒钟转化 1 个摩尔底物的酶量为 1Katal（mol/sec）常用国际为Katal 或 nKatal。和 Katal 间关系为：1U1molmin16.67nmols16.67nKatal1.连续监测法中酶活性浓度的计算：连续检测法指的是在酶反应过程中，用仪器监测某一反应产物或底物浓度随时间的变化所发生的改变，通过计算求出酶反应初速度。连续监测法优点之一是计

2、算方便，不需作标准曲线或标准管，用分光光度计监测酶反应过程时，很容易求出反应体系中每分钟吸光度变化，根据摩尔吸光系数可求出A。为微摩尔（线性）吸光体系A 为吸光度变化 为标本体积（ml）V 为反应体系体积（ml）L 为光径（cm）后面几项皆为常数，叫做酶浓度测定转化因子：常数K 值设置应是测定酶的判断值或参考值上限，应保证这些值测定的可靠。临床酶催化活性浓度测定的校准由于临床酶催化活性浓度测定受测定方法和条件的影响，国际医学检验量值溯源测定的参考方法，采用与仪器和试剂相配套的有溯源校准的校正测定系统，是发展趋势。了常用酶二、测定酶活性浓度的两大类方法（一）固定时间法（取样法）先让酶与底物在一定

3、温度底物和产物的变化。用一段固定的时间，然后停止酶反应，加人试剂进入化学反应呈色测出用这类方法测酶活性浓度，必须保证酶和底物在所选定的温度误差。该法最基本的一点是停止反应后才测定底物或产物的变化。（二）连续监测法用时间要很精确，否则将引起较大连续监测法具有众多的优点，随着科学技术的发展，自动生化仪的使用，正在逐步取代“固定时间法”。实际工作中，测酶活性浓度常用酶耦联法。最简单的酶耦联反应为以下模式：A：底物B：待测酶产物（不能直接测定） C：指示酶产物（可以直接测定）Ex：待测酶 Ei：代表指示酶三、酶反应动力学原理（影响酶反应的）酶反应动力学主要研究酶催化反应的过程与速率，以及各种影响酶催化

4、速率的，定量时的观察对象是总时间内底物的减少或产物增加的量。影响酶作用的包括底物的浓度、酶反应的最适 pH、最适温度、酶的抑制作用，另外还包括试剂中表面活性剂的作用等1.底物浓度的影响：。检测试剂中底物浓度、辅因子、活化剂、复构剂的种类和浓度均对酶的测定种类和浓度最为重要。其中以底物的遵循方程：VSKmS当底物浓度远远小于 Km，增加底物浓度，反应速度增加.当底物SKm 时，公式近似为V，反应速度不再增加，故此时反应速度为最大反应 V。从理论上说只有测定的是酶最大反应 V，反应速度才和酶量成正比。底物的种类若所测的酶专一性不强，可作用于多种底物，Km 最小的底物往往是此酶的生理底物。如该酶测定

5、主要用于临床工作，则首先应考虑有效价值的底物。选择 Km 小的底物测定酶还有一个优点，就是在最大反应速度时所需底物浓度也将最低。在实际工作中可能意味着试剂成本可能较低，不易出现底物难溶解的。确定底物种类后，重要的是选择底物的合适浓度。方程对选择酶测定的底物浓度有重要的指导作用，计算出某一酶的 Km 后就可以计算出不同底物浓度和 Km 间的比值。反应体系的最适 pH、缓冲液的种类和浓度：测定酶活性浓度时一定要选择在最适 pH。因为此处酶反应速度最大。pH 对酶还有一个重要的作用，就是影响酶的稳定。温度的控制：温度对酶活性影响的双重性。首先化学速度随温度升高而加快，酶反应也不例外。一般地说，在 2

6、5 35，温度每增加 10，酶促反应速度增加 12 倍。温度超过一定范围，反应速度下降，应选最适反应温度。到目前为止常规工作越来越多的使用 37。四、代谢物浓度酶法测定酶法分析的优点是特异性高，它在准确性、精密度、灵敏度和线性测定范围等方面都优于传统的化学法。酶的作用有特异性，成分复杂的等体液样品往往不需进行预处理，简化了实验程序。酶的本质是蛋白质，没自动分析。性，这样就避免了环境污染。酶促反应的条件温和，制成试剂盒可适用于（一）代谢物酶促终点法测定在代谢物酶促反应中，随着时间的延续，待测物逐渐减少，产物逐渐增多，一定时间后待测物全部转化为产物，反应趋于平衡。测定反应完全后（反应达到平衡时）待

7、测物或产物变化的总量，即终点法，又称平衡法。代谢物浓度酶促终点法测定的基本条件是：待测物浓度S应远小于其常数 Km，此时任何时刻的反应速度VSKm，呈一级反应动力学；反应配方中所用酶量应足够大，而 Km 应小，以保证有较快的反应速度完成测定。一步法：如果待测物与产物在理化性质上有便于检测的差异，如吸收光谱不同则可直接测定待测物或产物本身信号的改变来进行定量分析，这种是最简单的底物法测定。酶促耦联法：如果酶促反应的底物或产物没有可直接检测的成分，则可将反应某一产物耦联到另一个酶促反应中，而达到检测的目的。一般把第一步反应称为辅助反应，所用工具酶叫辅助酶，耦联的反应称为指示反应，指示反应所用的工具

8、酶叫指示酶。在临床生化测定中，最常用的耦联指示系统有两个：终点法测定的实验设计中，应考虑以下问题：所用工具酶的特异性：在酶促反应中，要求指示酶要有更高特异性，这样测定所受的干扰会更小。例如，己糖激酶法测定血糖，所用己糖激酶（HK）能催化除葡萄糖以外的六碳糖磷酸化，但因耦联的指示酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶只作用于主反应的产物葡萄糖-6-磷酸，而使葡萄糖 HK 法测定具有特异性。酶对待测物的亲和力：即 Km 的大小要合适。在保证测定线性的前提下，Km 要尽量小。酶的用量：酶促终点法测定代谢物的酶用量要足够大，以保证反应能在临床化学检验可接受的较短的时间里（一般为 13 分钟）达到终点。工具酶中的杂酶

9、应低于允许限。反应平衡点：反应应朝正反应方向进行，如果反应的平衡常数太低，为使反应朝正反应方向进行，主要有增加底物浓度、耦联反应移去生成物、改变反应 pH 等方法。对于试剂中的附加剂（如稳定剂、防腐剂、赋形剂）加入后，应不抑制酶的活性，不影响试剂的稳定性，不与底物和体液中的物质作用。（二）动力学法测定（kineticassay）总时间内底物减少或产物增加的量根据方程和 Lambert-Beer 定律可推得：A 为t2-t1 期间反应体系吸光度的变化，为消光系数，L 为光径。从此式可以看出，在 t2-t1 时间内吸光度的变化与所测物质浓度成正比。实际操作中，测定两个固定时间的吸光度差值，只要此期

10、间待测物消耗5%，就可以采用标准浓度对照法计算样本浓度，所以动力学法有时又称为固定时间法。与终点法相比，动态法测定中待测物无须完全转化，故工具酶的用量较少，为了保证有足够的测定线性，所用酶的 Km 应足够大。如所用工具酶 Km 太小，可在反应体系中加入竞争性抑制剂，以加大 Km。例如在尿素酶促紫外动力学法测定中加羟基脲，在碳酸氢盐酶测定中加硫酸盐等。不管是以脱氢酶为指示系统的酶促终点法测定，还是动力学法测定，有一个共同的缺陷是酶促反应受到内源性脱氢酶及其底物干扰（如乳酸脱氢酶和乳酸酸）。为了消除内源性脱氢酶，主要是乳酸脱氢酶的干扰，在反应设计时一般采用加人乳酸脱氢酶的抑制剂的方法来解决。终点法

11、还受到乳糜、黄疸和溶血的影响，测定时需设定样品空白。【习题】在酶反应过程中，用仪器监测某一反应产物或底物浓度随时间的变化所发生的改变，通过计算求出酶反应初速度，属于哪种检测方法A.一点法 B.两点法 C.浊度法 D.双波长法E.连续监测法正确E【习题】SI 制的酶Katal 的含义每秒钟能催化 1mol 底物的酶量为 1Katal每分钟能催化 1mol 底物的酶量为 1KatalC.每秒钟能催化 1 个D.每分钟能催化 1 个的底物的酶量为 1Katal的底物的酶量为 1KatalE.每秒钟能催化 1mol 的底物的酶量为 1Katal正确E【习题】对于单底物酶促反应，当底物浓度S小于酶的反应速度最大反应速度随底物浓度增加而加快 C.增加底物浓度反应速度不受影响 D.反应速度随底物浓度增加而减慢 E.酶促反应呈零级反应正确 B常数 Km 时，反应速度的变化为【习题】下列说法错误的是A.最常用的耦联指示系统有两个：一个是脱氢酶系统，另一个为氧化酶系统B.以脱氢酶为指示酶的系统测定的是（NAD+）或（N浓度+）在 540nm 处的吸光度增高来计算出被测物的C.可利用脱氢酶的逆反应，将 N浓度）H 变为 N），测定 340nm 处吸光度的下降来计算被测物的D.终点法受到