复旦大学基因诊断与基金治疗教案10基因治疗的基本原理

1、第三章 基因治疗的策略基因治疗的策略从基因结构或功能缺陷到临床表现的出现，这其间涉及到许多过程，每一过程都可能成为疾病基因治疗的着眼点。广义的治疗包括了凡涉及到基因机构或功能缺陷及其后续缺陷而设计的所有治疗方法。狭义的基因治疗仅指针对基因结构或功能缺陷而设计的治疗方法。总体来说，基因治疗的策略分三种：1.药物调控基因表达；2.体细胞基因型改善；3.对基因进行操作。以下我们分别详述1 药物调控基因的表达1.1 慢性肉芽肿病的-干扰素治疗慢性肉芽肿病（chronic granulomatous disease，CGD。OMIM #306400）是一种X连锁的隐性遗传病，患儿表现为机体防御功能的障碍

2、而致严重的、反复发作性、致死性的感染。病理研究表明，患者的吞噬细胞虽然具有吞噬外来病原体的能力，却失去杀灭被吞微生物的能力。CGD基因定位于Xp21.1，与DMD基因位点相邻，编码了细胞色素b的重链，而细胞色素b是氧化酶的重要组成成分。在疾病状态下，CGD基因不能有效地形成细胞色素b，使患者吞噬细胞中的氧化酶不能产生超氧（O2-），（O2-是吞噬细胞杀灭细菌的成分之一），从而不能有效地杀灭细菌而发生感染。-干扰素是一种可以增强正常吞噬细胞氧化酶活性的生物因子。Ezokowitz等曾给4名CGD患儿试用-干扰素，结果显示4名患儿都出现了细胞色素b量、O2-产物的增加，吞噬细胞对金黄色葡萄球菌（s

3、taphylococcus aureus）的杀灭能力增强。这一现象显示，-干扰素具有促进细胞色素b表达的作用，通过这一作用，增强了氧化酶的活性而达到治疗目的。1.2 镰状细胞贫血的羟化尿素治疗由于编码血红蛋白珠蛋白链的基因突变而引起的镰状细胞贫血症，患者常因为异常血红蛋白S（HbS）的积聚而引起溶血性贫血。另一方面，人们知道胎儿血红蛋白-HbF（22）也是胎儿出生后输送氧气的良好载体，如果诱使在成年期不表达的基因表达应该是治疗镰状细胞贫血的思路之一。羟化尿素（hydroxyurea）是一类抗肿瘤药，已证明具有刺激珠蛋白合成的作用。一些研究表明患者在试用羟化尿素后，HbF的量明显增高，溶血现象显

4、著减少，显示出这一治疗方法的潜在价值。2 体细胞基因型的改善就一般意义而言，体细胞基因型的改善是通过器官、组织或细胞移植来实现的。被移植的细胞保留有供体的基因组，所以受者成了遗传上的嵌合体。利用细胞移植来进行遗传性疾病的治疗有2个一般性的特征：一是受者机体某一种蛋白质遗传性缺陷，通过供者移植细胞的基因表达可以得到补偿；二是遗传病患者的某一器官功能衰竭，通过器官移植来补偿该器官的功能（如1-抗胰蛋白酶缺陷症患者的肝硬化），在这种情况下，原有的器官需被切除。右图：体细胞基因疗法之Ex vivo法。从病人处收集细胞，将这些细胞在体外培养并导入重组基因，然后将这些在遗传上加工的细胞作为自体移植物重新植

5、回病人体内，达到体细胞基因型的改善。以下就骨髓移植、肝移植和其他细胞的移植三方面做一介绍。2.1 骨髓移植骨髓移植（Bone marrow transplantation）是20世纪50年代逐渐发展起来的医疗技术，是指把骨髓细胞从一个人体内移植（一般通过静脉输入）到另一个人体内。造血干细胞移植是应用超大剂量化疗和放疗以最大限度杀灭患者体内的白血病细胞，同时全面摧毁其免疫和造血功能，然后将正常人造血干细胞通过静脉输注到患者体内，重建造血和免疫功能，达到治疗疾病的目的。骨髓移植是各种血液肿瘤、再生不良性贫血症、重度地中海型贫血症以及一些先天性免疫缺乏症或代谢性疾病救命的根本治疗方法。近年来世界上接

6、受骨髓移植的病患逐年增加，显示骨髓移植已经成为目前治疗的趋势；而因骨髓移植所带来的病人长期存活率也大大的增加，各种血液疾病如再生不良性贫血症与慢性骨髓性白血病，如有适当的供髓者，骨髓移植已有百分之八十至九十的长期存活率，而在成人急性白血病亦可以达到百分之五十左右的治愈率。2.2 肝移植肝细胞移植(hepatocyte transplantation, hct)是将正常成年肝细胞、不同发育阶段的肝细胞、肝潜能细胞、修饰型肝细胞以及相关生长刺激因子,通过不同途径移植到受体适当的靶位,使之定居、增殖、重建肝组织结构,并发挥正常肝功能的肝组织工程学手段。肝细胞体内移植技术于1993年至今已先后在美国和

7、日本开展，具有支持人体肝功能时间长，能够完成肝脏的合成、代谢及解毒功能，纠正凝血酶原活动度、低蛋白血症和抗胰蛋白酶缺乏，稳定患者内环境的特点。1993年国际上第一次报道了肝细胞移植在治疗慢性重型肝炎中的应用。1998年美国通过了人类肝细胞体内移植可作为终末期肝病的一项有效的治疗技术，并于当年通过了美国FDA认证。肝细胞体内移植又称为肝细胞种植移植，就是对获得完整正常的肝脏或手术切下的部分肝组织，进行体外分离纯化，将分离纯化的肝细胞植入体内，恢复或重建肝功能，暂时性代谢性支持病人等待肝脏移植或自行恢复患者的疾病不需进行原位肝移植。肝细胞体内移植经过20余年的基础与临床应用研究，被证明是一项经济、

8、有效、微创的治疗终末期肝病和遗传性肝脏代谢性疾病的治疗措施。致命性终末期肝病经内科治疗无效者，以手术植入一个健康的肝脏，来获得肝功能的良好恢复，称肝脏移植。 切除病肝后，于原解剖位置上立即植入一个新的肝脏，称原位肝移植。 病肝连同肝后下腔静脉一并切除，植入肝与受体肝同名管道吻合，无肝期需建立静脉旁道转流，称为经典式原位肝移植。 切除病肝，保留肝后下腔静脉和肝静脉，利用供肝下腔静脉与受体肝静脉（一般为左、中共干支）或受体下腔静脉吻合，供肝肝下下腔静脉远端自行缝扎，移植毕，受者下腔静脉似背驮着新植的肝，故名背驮式原位肝移植。 目前，中国肝移植所面临的问题主要包括：脑死亡立法滞后、经济承受能力弱、手

9、术时机的把握、以及器官的合理配置和利用等方面。2.3 其他细胞的移植胰岛细胞移植治疗糖尿病越来越多的患者在接受胰岛细胞移植后已停止接受胰岛素注射。最新数据显示，80的糖尿病患者在接受胰岛细胞植入的一年后仍然无需接受胰岛素注射。这一成功率与全胰腺移植的成功率相同，而且比1998-2000年的统计数据提高了14。细胞移植治疗肺动脉高压特发性肺动脉高压(IPAH)是一类病因尚未完全清楚且预后极差的恶性肺血管疾病,其基本病理特点是肌型肺小动脉丛样病变，血管腔逐渐闭塞，肺动脉压进行性升高，导致右心衰竭。若未及时诊断并积极准确干预，患者一般在出现症状后23年内死亡。由于发病机制不清，IPAH的治疗仍较为棘

10、手。而细胞移植的出现，则为IPAH的治疗带来曙光。心肌细胞移植胚胎心肌细胞移植：1994年起，陆续有研究将大鼠胚胎心肌细胞移植到大鼠心梗区，发现移植的心肌细胞存活并完全分化成熟，且移植心肌细胞与相邻宿主细胞之间可产生明确的闰盘联系。虽在动物实验中得到肯定，但临床应用受到很大限制，其胚胎供体来源有限，并涉及伦理道德等多方面社会问题。自体同源心肌细胞移植：1999年有学者取下大鼠左心耳进行体外培养扩增心肌细胞，移植入左室壁人为冷冻坏死区，其心功能较对照组有明显提高。自体同源心肌细胞移植能改变左心室重构，防止左心室扩张，维持左心室厚度，减少冷冻坏死所致癜痕的扩展。其最大优点是避免了免疫排异反应，更具

11、临床应用潜力。3 基因操作3.1 原位修复 原位修复也称为基因修复（gene repair，gene correction）。有缺陷的基因，使其在质和量上均能得到正常表达。原位修复不破坏基因组结构，修复后基因仍然受自然调控因子调控。所用的小分子核苷酸片段可以避免病毒载体所引起的免疫反应。而且隐性和显性变异均可校正，无疑是进行基因治疗最理想的途径和目的，也是一种直接的基因疗法，但目前在技术上较难做到。因为要在人基因组的特异部位实施“手术”是一个复杂过程。现介绍一些还处在试验阶段的新技术、新方法。RNA/DNA嵌合分子（RDO）介导的高效基因修复技术这一技术是1996年开始发展起来的新技术，它通过

12、人工合成的双链开环RNA/DNA嵌合分子转染细胞而使特定基因靶位点产生单碱基改变，从而修复突变基因。这一技术高效（目前最高可达50以上）、特异性强、安全、无随机插入致变的危险、无免疫反应、无明显毒性，能够用于定点突变、基因敲除、动植物功能基因组学、药物遗传学等很多方面的研究，在不久的将来能够应用于人类基因治疗，具有很高的应用价值和医学前景。右图：RNA/DNA嵌合分子的基因修复三链形成寡核苷酸（TFO）单链 DNA 或 RNA 可以与富含嘌呤碱基的DNA 双链形成三链结构，后者可以阻止 DNA 与蛋白质结合，因而 TFO 被广泛用于反义抑制基因的复制及转录。近来有研究用它对DNA特定位点进行损

13、伤、促进重组、引入突变以及基因打靶，从而实现基因的原位修复。存在的问题：1. TFO 只能与基因组特定的富含嘌呤碱基的序列（需要 1530 个碱基）结合形成三链螺旋，虽然这样的序列在基因组每隔 1 kb 就有一个，但仍然限制了其应用。2. 寡核苷酸转入细胞的效率有待提高；3.寡核苷酸在细胞内的稳定性有待提高。4. 要设计TFO以增加它与基因组位点的亲和能力。单链寡核苷酸（ssODN）介导的基因修复与靶序列完全互补的ODN广泛用于反义核苷酸技术，但有学者在RNA/DNA嵌合分子实验中发现，仅用杂合分子中的全DNA单链ssODN（中央含有错配碱基）也可以修复质粒或基因组中的特定突变，而且合成简单、

14、费用低、效率稳定。使用ssODN已经对多种仅涉及少数碱基变异（碱基置换、移码突变、缺失、插入）的基因进行了修复，如：酪氨酸酶，新霉素，Rb-1，Cyc-1，HPRT 和 c-kit等。实验的可重复性较好。用 TFO、RDO 或 ssODN 分子可以进行体内外的基因修复，包括对点突变、移码突变或插入等基因突变进行修复，也可以在一定程度上修复 -地中海贫血、血友病、白化病、肌营养不良等多种病变的基因突变，而不影响基因组其它序列。尽管效率比病毒介导的基因增补要低，但由于它有望使修复的基因长期稳定地处于正常调控下，因而是实现基因治疗的一条理想途径。3.2 基因替代疗法 也称为基因手术（gene sur

15、gery，gene replacement）。对发生缺陷的基因进行切除，将有功能的正常基因转移到疾病细胞或个体基因组的被切去的部位上，以代替缺陷基因发挥作用。传统上的基因治疗实际上就指基因替代疗法。用基因替代等方法恢复和增加肿瘤抑制基因的功能 如将克隆的抑癌基因Rb、p53、p16等导入肿瘤细胞，可以逆转其恶性行为，诱导细胞“凋亡”。这类研究已从实验研究过液压到临床试验阶段，其中对p53基因的部分临床试验结果显示了其潜力。Roth等直接在瘤体内注射携公平野生型p53基因的重组腺病毒（Adp53）治疗头颈部鳞癌和非小细胞肺癌，结果绝大多数肿瘤组织可表达p53基因，肿瘤体积缩小，瘤体坏死和调亡等。

16、由英国、法国和意大利组织的国际临床合作小组直接将野生型p53基因表达质粒注射放肝癌瘤体内，未见明显毒副反应，8例患者中有1例完全缓解达19个月，3例肿瘤体明显缩小，此外还有报道称，将细胞周期抑制基因p21wafl导入p53缺失的肿瘤，效果比转导野生型p53更好。3.3 重新开放己关闭的基因 促使有类似功能的基因表达，以超过或代替异常基因的表达。3.4 基因抑制 导入外源基因以抑制原有的基因，目的在于阻断有害基因的表达。例如，向肿瘤细胞内导入肿瘤抑制基因Rb或p53等，以抑制癌基因的异常表达。癌基因拮抗疗法 肿瘤的发生与癌基因的激活和抑癌基因的失活有关，可以通地阻断癌基因的表达或恢复抑癌基因的功

17、能来抑制肿瘤的发展或恢复其正常表型。现在对癌症的治疗方法通常都是提高肿瘤抑制基因的活性，这种肿瘤抑制基因被称作p53基因，因为这种基因激活时产生的蛋白质的分子量为53000。p53是肿瘤的克星。当细胞核中的DNA受损时，p53或者阻止非正常细胞复制，直到DNA被修复，或者引导“细胞自杀”。大部分癌症都是缺陷基因引起的，p53变异是常见的基因缺陷。3.5 基因封闭反义（antisense）RNA能封闭mRNA，抑制基因的表达。核酶（ribozyme）实际上也是一种反义RNA，与靶细胞的mRNA结合后，能切割杂交分子，使之断裂，从而封闭或抑制癌基因的表达，使癌细胞失活。反义治疗在现阶段是较好的方向

18、，具有传统药物的使用方便、容易大量生产等优点，又有着比传统药物更高的作用特异性。反基因策略（antigene strategy）似乎又比反义治疗更进一步。反基因策略以DNA三螺旋模型为基础，通过寡核苷酸与双链DNA结合形成局部的三链结构来抑制基因的转录。从理论上讲，由15个核苷酸构成的反义寡核苷酸导入细胞后，即可通过碱基互补原则，封闭一个特定基因的表达。由于转录是遗传信息放大的过程，因此对于基因表达抑制来说，使用单链寡核苷酸（ssODN）的反基因策略（antigene strategy）可能要比使用反义RNA和核酶的反义治疗更为有效。右图：反义RNA工作原理3.6 引入特定基因以提高免疫力向肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）内导入TNF、IL一2、IL一4和一IFN等基因，用以提高细胞免疫力，加强TIL杀伤肿瘤细胞的能力。基因修饰TIL的过继免疫疗法将细