感染性疾病的分子诊断

1、DNAmRNA蛋白质转录反转录 翻译 核酸分子杂交 基因结构异常基 因 表 达 异 常PCR DNA测序 核酸分子杂交 实时荧光定量PCR 反转录PCR 蛋白质芯片 ELISA 蛋白组织化学染色 Western-blot 基因芯片 基因诊疗技术和方法第1页第2页 第四代：分子诊疗（1978年始） 病因学诊疗 分子诊疗第3页第4页基因病类型1、感染性疾病： 病原生物侵入如流感、肝炎、艾滋病2、遗传性疾病： 如苯丙酮尿症、血友病等3、复杂性疾病，如肿瘤、原发性高血压 第5页第6页感染性疾病的分子诊断严永敏 基础医学与医学技术学院第7页第一节诊疗策略及诊疗方法标本处理病毒基因检测病原菌基因检测第8页

2、普通性检出策略和方法 针对特异性核酸序列进行核酸分子探针杂交，或者利用常规PCR技术直接检出微生物DNA/RNA，判断有没有感染和是何种病原体感染。完整检出策略和方法 按照诊疗分型亚型耐药性检测思绪，利用各种基因诊疗伎俩对感染性病原体进行分析。一、分子诊疗策略第9页二、分子诊疗方法1.信号放大技术（bDNA杂交捕捉系统）支链DNA（bDNA）技术第10页杂交捕捉系统特点：稳定性、重复性、特异性好第11页二、分子诊疗方法2.靶分子扩增技术（PCR/TAS/LCR）转录依赖扩增系统（TAS）第12页连接酶链反应（LCR）特点：简单、快速、灵敏度高第13页1.标本选择选择标准：符合疾病发病机制，反应

3、病程标本类型：血浆、血清、全血或白细胞核酸类型：DNARNAmiRNA三、标本处理2.标本量、抗凝剂3.标本保留、传送4.标本预处理第14页1.阴性结果注意：灵敏度,核酸提取及扩增效率.四、结果解释2.阳性结果3.定性检测结果4.疾病情况判断注意：特异性,可能污染.注意：病情缓解患者.第15页1.填补血清学诊疗缺点注意：窗口期,灵敏度,部分特殊病例.五、应用及评价2.不能培养或生长迟缓微生物3.监测疾病状态4.耐药性及分型检测第16页第二节 病毒基因检测乙型肝炎病毒（HBV）、人乳头瘤病毒（HPV）：其DNA能够使用点杂交、PCR方法直接检出。丙型肝炎病毒（HCV）、人免疫缺点病毒（HIV）：

4、其RNA能够使用RT-PCR方法直接检出。第17页HBV基因组结构pre-s1pre-s2SPCpre-cX乙 肝pre-S1 pre-S1蛋白pre-S2 pre-S2蛋白S HBsAgpre-C HBeAgC HBcAgP DNAPX HBxAg乙型肝炎病毒基因结构模式分子诊疗：信号放大技术；PCR法；耐药性检测第18页1.填补血清学检测结果,诊疗HBV临床意义2.缩小窗口期,快速诊疗3.定量检测,指导病情4.检测耐药,指导用药第19页丙型肝炎(HCV)基因诊疗实例丙型肝炎为RNA病毒，9500mer，编码3011-3033个氨基酸，含有高变异性。基因组组成：E1NS2NS3NS43-NC

5、RCNS1/E2NS5B5-NCR高变异区（编码衣壳和包膜蛋白）（NCR: 非编码区） 5-NCR为保守区域，将引物设计在该区域，进行RT-PCR, 可特异性扩增HCV。第20页分子检测方法：1.HCVRNA定性及定量检测 RT-PCR, 巢式PCR,定量PCR,转录依赖 扩增系统（如TAS）,分支DNA(bDNA) 2. HCV基因分型判定测序、real-time PCR等 第21页第22页第23页1.监测临床疗效临床意义2.缩小窗口期,快速诊疗3.定量检测4.免疫缺点补充检测第24页H1N1甲型流感第25页 试验室检验外周血象：白细胞总数普通不高或降低。重症患者多有白细胞总数及淋巴细胞降低

6、，并有血小板降低；血清学诊疗：可使用间接ELISA、抗原捕捉ELISA、荧光免疫法等； 分子诊疗？第26页分子诊疗策略第27页第三节 病原菌基因检测耐药菌株监测: 结核分支杆菌耐药基因rpoB金黄色葡萄球菌耐药基因MRSA第28页确认归于此次暴发最早病例：9月1日至年2月22日，发觉651例，来自43个州，死亡8例病例-对照调查：与花生酱相关，尤其一些花生酱饼干流行病学和试验室调查发觉源头为一个工厂生产花生酱和花生糊，这些产品同时也是多家食品生产厂家中间材料。花生酱污染造成鼠伤寒沙门菌沙门菌暴发，美国，-第29页确认归于此次暴发最早病例：9月1日至年2月22日，发觉651例，来自43个州，死亡

7、8例病例-对照调查：与花生酱相关，尤其一些花生酱饼干流行病学和试验室调查发觉源头为一个工厂生产花生酱和花生糊，这些产品同时也是多家食品生产厂家中间材料。花生酱污染造成鼠伤寒沙门菌沙门菌暴发，美国，-第30页冻肉、蛋品、乳品及其它加工食品鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其它未经加工食品前增菌法25gBPW225mL36 1 普通4h，干蛋品18h24h10mLMM（或TTB）100mL10mLSC100mL直接增菌法25g灭菌生理盐水25mL检样匀液25mL MM（或TTB）100mL检样匀液25mL SC100mLBSDHL（或HE、WS、SS）TSI（排除A/A H2S结果 ），靛基质，尿素，KCN，赖氨酸沙门氏菌血清学试验甘露醇 山梨醇H2S 靛 尿KCN 赖H2S 靛 尿KCN 赖/非如左述各种反应结果沙门氏菌血清学试验 ONPG 沙门氏菌非沙门氏菌42 18h24h36 1 18h24h42 18h24h36 1 18