第一篇组成人体的细胞

1、第一篇组成人体的细胞第五章 细胞的功能细胞作为生物体的基本单位，具有多种多样的生理功能，不仅包括细胞形态的改变和维持，细胞内的物质代谢和能量代谢、内吞外排、免疫行为、细胞运动，而且还包括了细胞的增殖、分化和衰老，细胞对外界环境的反应、信息传递等等。研究和了解细胞的生理功能对于认识生命现象的本质是十分重要的。第一节 巨噬细胞的吞噬功能高等动物体内的巨噬细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞，具有吞噬的功能。它们广泛分布在组织和血液中，在机体的非特异免疫功能中起着重要的作用。当病原微生物或其它异物侵入机体时，能招引巨噬细胞，而巨噬细胞又具有趋化性，它通过产生活跃的变形运动，主动向病原体和异物移行聚集，首先把

2、异物吸附在细胞表面，随之，吸附区域的细胞膜向内凹陷，伸出伪足包围异物，并吞入胞质，形成吞噬泡，继而在细胞质中的初级溶酶体与吞噬泡融合，形成吞噬溶酶体，把病原体杀死，异物消化分解。 一、所需试剂及设备显微镜、高压灭菌锅、解剖盘、解剖剪、1ml注射器、吸管、载玻片、盖玻片；小鼠（体重20g左右），鸡血；6淀粉肉汤（含0.3台盼蓝） 二、操作步骤 1实验前2天，每天给小白鼠腹腔注射6淀粉肉汤（含台盼蓝）1ml。 2实验时，再往腹腔内注射1ml 1鸡红细胞悬液，并轻揉腹部，使鸡红细胞悬液分散。 32030in后，用脊椎脱臼法处死小鼠（右手抓住鼠尾，用力向后拉，左手拇指与食指同时按住鼠头，使脊髓与脑髓间

3、断开致死）。 4迅速剖开腹腔，用未装针头的注射器或吸管吸取腹腔液。 5取一张干净的载玻片，滴一滴腹腔液，盖上盖玻片，显微镜下检查。 观察时，将视野光线调暗。在高倍镜下，先分辨清鸡红细胞和巨噬细胞。鸡红细胞为淡黄色、椭圆形、有核的细胞。而数量较多、体积较大圆形或不规则的细胞，其表面有许多似毛刺状的小突起（伪足），胞质中有数量不等的蓝色颗粒（为吞入的含台盼蓝淀粉肉汤形成的吞噬泡）即为巨噬细胞。变换视野，仔细观察巨噬细胞吞噬鸡红细胞的过程。可见有的鸡红细胞（一至多个）紧贴附于巨噬细胞的表面；有的巨噬细胞已将1至数个红细胞部分吞入；有的巨噬细胞已吞入1个或几个红细胞在胞质中刚刚形成椭圆形的吞噬泡；有的

4、巨噬细胞内的吞噬泡体积缩小，并呈现圆形，这是与初级溶酶体发生融合，泡内物正在被消化分解。6绘图示出所观察到的小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的各种形态。7计算吞噬百分比，即每100个吞噬细胞中吞有鸡红细胞的吞噬细胞数。三、注意 1小鼠腹腔注射时注意不要刺伤内脏。 2腹腔内的细胞浓度过大，可用生理盐水稀释。 第二节 细胞膜的通透性细胞膜在不断变化的环境中，必须保持自身的稳恒状态，才能生存。细胞膜允许一些物质通透，又能降低甚至阻挡另一些物质的通透，所以细胞膜具有选择通透性。水分子可以自由通过细胞膜，当细胞处于低渗液环境时，水分子大量渗到细胞内，使细胞膨胀，进而破裂，血红蛋白释放到介质中，由不透明的红细

5、胞悬液变为红色透明的血红蛋白溶液，这就是溶血现象。溶血现象可作为测量物质进入红血细胞速度的一种指标。红细胞置于乙二醇、丙三醇（甘油）、葡萄糖等摩尔浓度的高渗液中，乙二醇等分子进入红血细胞，使细胞内的渗透性活性分子的浓度大为增加，继而导致水的摄入，使细胞膨胀，细胞膜破裂，发生溶血。溶血现象发生的快慢与进入细胞的物质的分子量大小有关。分子量大的进入细胞慢，发生溶血所需时间也长。非极性化合物易溶于脂溶剂，但在水中溶解度甚小。碳链越长，脂溶性越大。一种化合物在脂溶剂中的溶解度与其在水中溶解度之比，叫分配系数。各种非电解质溶液，只要单位面积中所含的分子数相同，就具有相同的渗透压。电解质溶液，如氯化钠与葡

6、萄糖分子数相等时，氯化钠产生的渗透压要大的多。具有相同渗透压的某非电解溶液与某电解质溶液浓度之比，叫等渗系数。用i来表示。 i= 葡萄糖的等渗摩尔浓度/ 氯化钠的等渗摩尔浓度 发生溶血者为低渗液，所以把发生溶血的前一管溶液的浓度近似视为红细胞等渗。 一、所需试剂及设备小烧杯、试管、试管架、刻度吸管、注射器、秒表；含适量肝素的兔血或鸡血；1M乙二醇水溶液、1M丙三醇水溶液、1M葡萄糖水溶液、3M甲醇、3M乙醇、3M丙醇、M/8、M/9、M/12、M/13葡萄糖溶液、M/8、M/9、M/12、M/13氯化钠溶液 二、操作步骤：（一）分子量大小对膜通透性的影响 1在编号的三支试管中，分别用吸管吸入2

7、ml 1M乙二醇，1M丙三醇，1M葡萄糖高渗液。 2先后分别用注射器滴加两滴血液，用手指按住管口，倒置一次。 3观察溶血时间，最长延至10min。 4记录实验结果。 溶液相对分子质量溶血时间lmol/L乙二醇62lmol/L丙三醇92lmol/L葡萄糖180（二）脂溶性大小对细胞膜透性的影响 1编号的三支试管分别加入2ml 3M的甲醇、乙醇、丙醇溶液。 2分别先后加入两滴血液，按住管口倒置一次。 3观察溶血时间。 4记录实验结果。 溶液相对分子质量分配系数溶血时间3mol/L甲醇32.040.00973mol/L乙醇46.070.0353mol/L丙醇58.00.156（三）电解质和非电解质溶

8、液对细胞膜透性的影响 1将试管编号，注明溶质名称及摩尔浓度。 2按编号分别加入不同浓度的葡萄糖及氯化钠溶液 2ml。 3每管各加入两滴血液，按住管口，倒置一次。 4室温放置15min ，观察发生溶血的浓度，确定等渗浓度。 5记录实验结果。 溶质物质的浓度/(lmol/L)1/8M1/9M1/12M1/13M葡萄糖NaCl6计算等渗摩尔系数。第三节细胞的迁移上皮细胞，成纤维细胞，癌细胞等，在生理状态下，常形成单层或者复层上皮。当病理状态下，比如创伤愈合，细胞迁移的时候，以侧向运动为主，细胞划痕实验很好的模拟了这种运动形式，是很好的模型。多年来，细胞划痕实验（Wound healing assay

9、s/scrape migration assay）一直被用来检测不同细胞的迁移能力。在单层培养细胞中，通过针或枪尖划痕使小片细胞损伤脱落，进而借助显微镜对细胞再次迁入并填充缺口处进行适时观察。根据细胞类型、培养条件及划痕大小的不同，迁移时间也会有所差异。一、细胞划痕实验（一）、所需试剂及设备：6孔细胞培养板、marker笔、直尺、20微升枪头、无血清培养基、PBS（二）、操作步骤：1先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀划横线，每隔0.51cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。2在空中加入约2106个Rat-1细胞。3次日用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾

10、斜。4用PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基。5放入37 5% CO2培养箱，培养。按0，6，12，24小时取样，拍照。第四节Transwell实验Transwell是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，根

11、据实验需要，可有不同选择。其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孔径大小有0.112.0m，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。 将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进

12、行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。一、Transwell侵袭实验（一）、所需试剂及设备： Transwell小室； 上层培养液：上层培养液采用无血清培养基，为维持渗透压，需加入0.05%-0.2% BSA； 细胞：值得注意的是，有侵袭能力的细胞才可用于Transwell侵袭实验。另外，为了让实验结果更明显，可先撤血清让细胞饥饿1224h，再进行实验；下层培养液：下层常用含5%10% FBS的培养基，具体浓度根据细胞侵袭力而定，侵袭力弱的细胞可适当提高FBS浓度； HYPERLINK /Search.asp?Field=Title&ClassID=&keyword=细胞培养

13、 细胞培养板：常用于Transwell侵袭实验的 HYPERLINK /Search.asp?Field=Title&ClassID=&keyword=细胞培养 细胞培养板有6孔板、12孔板、24孔板等，以24孔最常用。 HYPERLINK /Search.asp?Field=Title&ClassID=&keyword=细胞培养 细胞培养板没什么特殊要求，普通的细胞培养板就可以。但要注意，细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套；此外，膜的下室面可涂上纤维粘连蛋白(fibronectin，FN，Sigma有售)，这样做的目的是使穿过膜的细胞更好地附着在膜上，也可用胶原（collag

14、en）或明胶（gelatin）。（二）、操作步骤：1有基质胶的Transwell小室制备将小室放入培养板中，在上室加入300l预温的无血清培养基，室温下静置1530min，吸去培养液。2制备细胞悬液（1）制备细胞悬液前可先以无血清培养基洗涤细胞。（2）消化细胞：终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗12遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至110105。3接种细胞（1）取细胞悬液100200l加入Transwell小室。24孔板小室一般200l。（2）24孔板下室加入500l含FBS或趋化因子的培养基，注意避免出现气泡。（3）培养细胞：常规培养1248h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。时

15、间点的。选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。4结果统计检测穿过的细胞数有两种方法：（1）直接计数法A、“贴壁”细胞数：这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去。通过细胞染色，可在镜下计数细胞。用棉签擦去基质胶和上室内的细胞；染色：常用的染色方法有结晶紫染色、台肦蓝染色、Giemsa染色、苏木精染色、伊红染色等。本实验采用0.1%结晶紫染色；细胞计数：使用正置显微镜进行观察和拍照，把Transwell小室反过来底朝上就可清楚看到小室底膜上下室侧附着的细胞。也可用手术刀将膜切下后染色，再贴在玻片上，滴二甲苯，再盖上盖玻片，就可以长期保存。 随机选取5个视野计数细胞个数。B、“非贴壁”细胞计数由于某些细胞自身的原因或某些膜的关系，有时细胞在穿过膜后不能附着在膜上，而是掉进下室。可以收集下层培养液，用流式细胞仪计数细胞量，