第章 植物组织培养技术

1、PAGE 第 PAGE 44 页 共 NUMPAGES 44 页第2章 植物组织培养技术第二节 植物组织培养概述一、授课章节第二节 植物组织培养概述。二、学时时安排2学时时。三、教学学目标1掌握握植物组组织培养养的含义义。2了解解植物组组织培养养的类型型划分。3理解解植物组组织培养养的应用用原理。4掌握握植物组组织培养养的特点点和应用用。四、教学学重点、难点分分析重点：植物组织织培养的的含义、特点和和应用。难点：植物组织织培养的的应用原原理。五、教具具电化教学学设备，植物组组织培养养试管苗苗。六、教学学方法讲授法，多媒体体课件。七、教学学过程.导入入前面我们们学习了了有关植植物育种种的一些些知

2、识，今天，请看我我给同学学们看一一样东西西(教师师拿出试试管苗)，问同同学们这这是什么么呢？这这就是我我们要学学的植物物组织培培养。II.新新课一、植物物组织培培养的含含义植物组织织培养是是指在无无菌条件件下，将将离体的的植物器器官、组组织、细细胞以及及原生质质体培养养在人工工培养基基上，给给予适宜宜的培养养条件，使其长长成完整整植株的的过程。由于培培养物脱脱离母株株在试管管内培养养，故又又称离体体培养、试管培培养。二、植物物组织培培养的类类型植物组织织培养由由于分类类依据不不同可划划分为不不同的类类型。植株培养：对幼小植株的培养。植物组织培养根据培养对象器官培养：对根、茎、叶、花、果实、种子

3、等离体器官的培养。组织培养：对植物体的各部分组织进行的培养。细胞培养：对单个细胞或较小细胞团的培养。原生质体培养：对除去细胞壁的原生质体的培养。根据培养方式固体培养：加入琼脂等凝固剂，使培养基固体化，在此培养基上的培养。液体培养：培养基中不加凝固剂，培养基为液体，在此培养基上的培养。根据培养过程初代培养：将外植体进行的第一次培养。继代培养：将培养一段时间的培养物转接到新鲜培养基继续培养的过程。光培养：培养过程中需要光照的培养。暗培养：培养过程中不需要光照的培养。根据培养条件三、植物物组织培培养的应应用原理理（一）植植物细胞胞全能性性植物细胞胞全能性性，是指指植物体体上每个个具有完完整细胞胞核的

4、植植物细胞胞，都具具有该植植物体的的全部遗遗传信息息和产生生完整植植株的能能力。植植物的体体细胞一一旦脱离离所在器器官或组组织的束束缚成为为离体状状态时，在一定定的营养养、激素素和外界界条件作作用下，就可能能表现出出全能性性，而生生长发育育成为完完整的植植株。（二）细细胞的分分化和形形态建成成（三）植植物的再再生功能能四、植物物组织培培养的特特点（一）研研究材料料来源单单一，无无性系遗遗传信息息相同（二）试试验经济济，管理理方便，工作效效率高（三）培培养条件件人为控控制，可可周年连连续进行行试验或或生产（四）生生长快，周期短短，繁殖殖率高五、植物物组织培培养的应应用（一）优优良品种种的快速速繁

5、殖（二）脱脱毒及脱脱毒苗的的再繁育育（三）植植物新品品种的培培育（四）种种质资源源的保存存和交换换（五）有有用次生生代谢产产物的生生产III.作业1.简述述植物组组织培养养的概念念和培养养类型。2.植物物组织培培养技术术有哪些些特点？3.植物物组织培培养在生生产上有有哪些方方面的应用？ 4.通过过学习，你对植物物组织培培养技术术是怎样样理解的的？第二节 植物物组织培培养厂房房的设计计与构建建一、授课课章节第二节 植物物组织培培养厂房房的设计计与构建建。二、学时时安排2学时。三、教学学目标1了解解组培工工厂的基基本结构构、各部部分结构构的具体体功能。2理解解组培工工厂的设设计原则则与总体体要求，

6、能够根根据需要要和实际际情况科科学设计计组培工工厂。3掌握握厂房的的基本组组成，仪仪器设备备配备与与设计要要求。4了解解常用仪仪器与用用具的使使用方法法。四、教学学重点、难点分分析重点：组培工厂厂的设计计原则与与总体要要求。难点：根据需要要和实际际情况科科学设计计组培工工厂。五、教具具电化教学学设备、组培工工厂现场场或实验验室。六、教学学方法讲授法，演示法法。七、教学学过程.导入入复习：植植物组织织培养的的概念，类型及及应用。提问：细细胞全能能性的概概念。上次课我我们学习习了植物物组织培培养的基基本知识识，那么么从事植植物组织织培养的的生产需需要一些些基本的的仪器和和设备，今天我我们来学学习植

7、物物组织培培养的厂厂房的设设计与构构建。II.新新课一、植物物组织培培养厂房房的设计计（一）设设计原则则1.环境境清洁、安静、远离污污染源。2.按照照工作的的目的和和规模决决定厂房房的设计计。3.按照照自然工工作程序序先后合合理布局局，避免免生产环环节倒排排。4.经济济实用，节能安安全。（二）具具体要求求1.厂房房选址时时应选择择周围安安静、阳阳光充足足、无高高大建筑筑物遮挡挡的环境境；最好好在常年年主风向向的上风风方向，尽量减减少污染染；要求求交通便便利，便便于产品品的运送送。2.厂房房各车间间的大小小和比例例相对合合理，车车间的设设计和设设备的配配置、摆摆放与其其功能相相适应。3.厂房房必

8、须满满足3个个基本的的需要：生产准准备（器器皿洗涤涤与存放放、培养养基制备备、各种种器具的的灭菌）、无菌菌操作和和控制培培养。4.厂房房的建筑筑与装修修材料要要耐腐蚀蚀，便于于消毒和和清洁。（三）厂厂房基本本组成厂房根据据结构和和应用范范围一般般设计为为药品配配制间、洗涤间间、培养基基制作间间、缓冲冲间、无无菌操作作间、试试管苗培培养间、试管苗苗驯化移移植间。1.药品品配制间间（1）任任务：主主要用于于化学药药品的储储藏、称称量和溶溶液的配配制。（2）设设计要求求：干燥燥、通风风、无直直射光线线。房间间内设立立工作台台，工作作台最好好用抗盐盐碱，耐耐腐蚀的的台面，要牢固固、平稳稳，具有有较好的

9、的抗震性性能。注注意磁力力搅拌器器与电子子天平要要分开台台面放置置。（3）仪仪器与用用具配置置：大型型工作台台、药品品柜、普普通冰箱箱、电子子分析天天平、托托盘天平平、磁力力搅拌器器、容量量瓶、烧烧杯、量量筒等。2.洗涤涤间（1）任任务：洗洗涤室用用于完成成玻璃器器皿等仪仪器的清清洗、干干燥和贮贮存；外外植体的的预处理理与清洗洗；试管管苗的出瓶、清洗与与整理等等工作。（2）设设计要求求：房间内内应宽敞敞明亮，方便多多人同时时操作；配备大大型水槽槽，上下下水道要要畅通；地面、天花板板及墙壁壁应耐湿湿和便于于清洁；应有晾干台台，用于于放置洗洗涤后的的培养器器皿。（3）仪仪器与用用具配置置：水槽槽、

10、晾干干台、周周转箱、烘箱等等。3.培养养基制作作间（1）任任务：主主要负责责培养基基的配制制、分装装、包扎扎和高压压灭菌等等工作。（2）设设计要求求：房间宽宽敞明亮亮、通风风良好，方便多多人同时时操作；目前灭灭菌大多多采用电电加温，墙体建建筑时要要预先设设计电路路线，确确保用电线路路和灭菌菌锅的用用电安全全。在灭灭菌锅上上方的墙墙壁设置置换气窗窗，利于于通风排排气。地地面、墙墙壁应用用耐湿材材料铺设设，防水水、防潮潮、防腐腐蚀。（3）仪仪器与用用具配置置：托盘盘天平、酸度计计、工作作台、高高压灭菌菌锅、周周转箱、储物柜柜等。4.缓冲冲间（1）任任务：防防止工作作人员进进出时带带进杂菌菌。（2）

11、设设计要求求：面积积一般223m2为宜；缓冲间间应安装装紫外灯灯，用以以照射灭灭菌；配配备鞋柜柜、衣柜柜、拖鞋鞋，用于于工作人人员进入入无菌操操作室前前在此更更衣换鞋鞋，（3）仪仪器与用用具配置置：紫外外灯、鞋鞋柜、衣衣柜、工工作服等等。5.无菌菌操作间间(接种种间)（1）任任务：进进行植物物材料的的分离接接种及培培养物转转移。（2）设设计要求求：接种种室宜小小不宜大大，一般般78mm2。地面、天花板板及四壁壁要求尽尽可能密密闭光滑滑，易于于清洁和和消毒。配置推推拉门，以减少少开关门门时的空空气扰动动。房间间密闭，干爽安安静，清清洁明亮亮。在适当当位置吊吊装12盏紫紫外灯，用以照照射灭菌菌。最

12、好安安装一小小型空调调，使室室温可控控，这样样可使门门窗紧闭闭，减少少与外界界空气对对流。（3）仪仪器与用用具配置置：超净净工作台台、紫外外灯、空空调机、医用小小推车、接种器器具消毒毒器、酒酒精灯、接种工工具、搁搁物架等等。6.试管管苗培养养间（1）任任务：接接种材料料的培养养生长。（2）设设计要求求：培养养间的大大小可根根据生产产规模和和培养架架的大小小、数目目及其它它附属设设备而定定。其设设计以充充分利用用空间和和节省能能源为原原则。高高度比培培养架略略高为宜宜，周围围墙壁和和天花板板要求光滑滑平坦、有绝热热防火的的性能。能够控控制光照照和温度度，并保保持相对对的无菌菌环境；适当位位置安装

13、装紫外灯灯进行照照射灭菌菌。（3）仪仪器与用用具配置置：培养养架、空空调机、光照时时控器、温度计计、摇床床等。7.试管管苗驯化化移植间间（1）任任务：进进行试管管苗的驯驯化和移移植。（2）设设计要求求：通常常在日光光温室内内进行，其面积积大小根根据生产产规模而而定。要要求能够够控温调调湿、控控光通风风、控菌菌防虫。（3）仪仪器与用用具配置置：移栽栽容器、弥雾装装置、遮遮阳网、移栽基基质等。二、基本本仪器设设备和用用具（一）灭灭菌设备备1.湿热热灭菌设设备（高高压蒸汽汽灭菌锅锅）：用于培培养基、玻璃器器皿以及及其它可可高温灭灭菌用品品的灭菌菌，根据据规模大大小有小小型手提提式、中中型立式式、大型

14、型卧式等等不同规规格；根根据控制制方式分分为手动动控制、半自动动控制和和全自动动控制等等不同类类型。2.过滤滤灭菌设设备（防防细菌滤滤膜）：防细菌菌滤膜的的网孔直直径为00.455m以下下，当溶溶液通过过滤膜后后，细菌菌的细胞胞和真菌菌的孢子子等因大大于滤膜膜直径而而被阻，在需要要过滤灭灭菌的液液体量大大时，常常使用抽抽滤装置置；液量量小时，可用注注射器。主要用用于赤霉霉素、玉玉米素、脱落酸酸等不耐耐热物质质的灭菌菌。3.干热热灭菌设设备：利利用高温温烘烤或或灼烧的的方法进进行灭菌菌，包括括烘箱（器皿和和器械的的灭菌）、酒精精灯（用用于接种种工具的的灭菌）、接种种器械灭灭菌器等等。4.其它它灭

15、菌设设备：利利用紫外外光波、超声波波、臭氧氧等杀菌菌，主要要用于对对空气和和物体表表面进行行消毒。常用设设备包括括紫外灯灯、超声声波清洗洗器、臭臭氧发生生器等。（二）接接种设备备与用具具1.超净净工作台台：超净净工作台台是植物物组织培培养最常常用、最最普及的的无菌操操作装置置。根据据风幕形形成的方方式可分分为水平平风和垂垂直风两两种；根根据使用用方式分分为单人人单面、双人单单面、双双人双面面等。2.接种种工具：外植体体接种或或培养物物继代转转接时使使用的各各种工具具。常用用的有：尖头镊：用于分分离植物物组织等等；枪型镊：用于夹夹取植物物器官继继代转接接和外植植体接种种；解剖剪：用于幼幼嫩组织织

16、、细胞胞团等剪剪取；弯头剪：用于转转接、剪剪取试管管苗茎段段等；解剖刀：用于外外植体或或培养物物切割；接种针：用于茎茎尖剥离离和愈伤伤组织转转移；切割盘：用于原原球茎、愈伤组组织、植植物器官官等切割割分离。3.显微微镜：包包括双目目体视显显微镜(解剖镜镜)、生生物显微微镜、倒倒置显微微镜和电电子显微微镜，用用于剥离离茎尖和和进行培培养物的的观察、分析、拍照等等。（三）培培养设备备与用具具1.培养养架：试试管苗在在培养间间里培养养时通常常摆放在在培养架架上。培培养架大大多由金金属制成成，一般般设58层，最低一一层离地地高约220cmm，其他他每层间间隔300cm左左右。培培养架长长度根据据日光灯

17、灯的长度度而设计计，如采采用400W日光光灯，则则长1.3m，宽度一一般为660cmm。2.恒温温振荡器器：用于于液体培培养时改改善培养养过程的的氧气供供应状况况。3.光照照培养箱箱：对于于一些对对环境条条件要求求特别严严格的培培养物，可培养养在能自自动调控控温度、湿度、光照等等的智能能光照培培养箱里里。4.培养养器皿：根据培培养目的的和要求求不同，可选用用不同类类型和规规格的培培养容器器。（1）三三角瓶：主要用用于外植植体静置置培养、振荡培培养或试试管苗继继代培养养。规格格有500mL，ll00mmL，1150mmL，2250mmL，5500mmL等，一般使使用l550mLL三角瓶瓶。优点点

18、：其培培养面积积大，利利于组织织生长；透光度度好；由由于瓶口口较小，不易污污染。（2）试试管：主主要用于于茎尖培培养、液液体培养养。试管管要求口口径大，长度稍稍短、以以2cmm15ccm、2.55cm15ccm、3cmm15ccm 为为宜。优优点：占占空间少少，单位位面积容容纳的数数量多。（3）果果酱瓶：主要用用于继代代和生根根培养。优点：在工厂厂化大批批量生产产时使用用，价格格低廉，成本低低；口径径较大，便于操操作。缺缺点：污污染率较较高；透透光性稍稍差。（4）塑塑料瓶：主要用用于兰科科植物的的培养。有1000mLL、1550mLL、2000mLL、2550mLL的规格格。优点点：密封封好、

19、透透气性差差、瓶内内湿度大大；质轻轻，便于于操作，不易破破损，污污染率低低；长方方盒形的的培养株株数多，且叠摞摞起来节节约空间间。缺点点：可重重复利用用性较差差。（四）称称量设备备与用具具1.天平平：用于于进行琼琼脂、蔗蔗糖和各各种药品品的称量量，需要要有称量量微量元元素和植植物激素素等的分分析天平平；称量量大量元元素、蔗蔗糖和琼琼脂等的的托盘天天平等不不同精度度的天平平。2.烧杯杯：用于于配制培培养基母母液时溶溶解各种种化合物物，规格格有50010000mmL不等等。3.量筒筒：用于于量取不不同体积积的液体体，规格格有50010000mmL不等等。4.试剂剂瓶：用用于贮存存不同容容量的溶溶液

20、，规规格有550110000mL不等等。5.移液液管：用用于吸取取各种用用量较少少的母液液，规格格有0.1110mLL不等。6.容量量瓶：用用于配制制培养基基母液时时进行定定容，规规格有550110000mL不等等。（五）环环境控制制设备与与用具1.空调调机：自自动控制制植物组组织培养养厂房的的温度，为培养养物提供供最适宜宜的温度度条件。2.冰箱箱：用于于母液和和某些试试剂的贮贮存及培培养材料料的保鲜鲜或与处处理等。3.光照照时控器器：用于于自动控控制培养养间的光光照时间间。（六）其其它设备备与用具具1.磁力力搅拌器器：磁力力搅拌器器用于加加速搅拌拌难溶的的物质，如各种种化学物物质等。磁力搅搅

21、拌器还还可加热热，加快快物质的的溶解。2.蒸馏馏水发生生器或纯纯水机：用于制制备配制制母液和和培养基基的蒸馏馏水或去去离子水水。3.药品品柜：用用于存放放各种化化学药品品。4.加热热设备：制备固固体培养养基时需需加热使使固化剂剂溶化，因此需需要加热热设备如如液化气气灶、电电炉、恒恒温水浴浴锅等。5.pHH计：用用于精确确测量和和调节培培养基的的pH，大规模模生产中中一般用用精密ppH试纸纸代替。III.作业1.植物物组织培培养厂房房的设计计原则和和要求有有哪些？2.植物物组织培培养的工工艺流程程是怎样样的？3.组建建一个植植物组织织培养生生产车间间应包括括哪几部部分，各各部分的的设计要要求以及

22、及主要功功能是什什么？4.植物物组织培培养需要要哪些基基本设备备，各有有何作用用？第三节 植物物组织培培养操作作技术（1）一、授课课章节第三节 植物物组织培培养操作作技术（1）。二、学时时安排2学时。三、教学学目标1掌握握组培的的一般工工作程序序。2掌握握不同类类型培养养器皿和和用具的的洗涤技技术。3了解解常用消消毒灭菌菌方法的的原理，掌握其其操作技技术，能能根据物物品种类类正确选选用消毒毒灭菌方方法。四、教学学重点、难点分分析重点：常用的消消毒灭菌菌技术。难点：灭菌和消消毒的区区别及无无菌意识识的树立立。五、教具具电化教学学设备。六、教学学方法讲授法，演示法法。七、教学学过程.导入入提问：植

23、植物组织织培养实实验室的的基本构构成。本次课主主要介绍绍的是植植物组织织培养洗洗涤和消消毒灭菌菌技术。II.新新课一、洗涤涤技术植物组织织培养除除了要对对培养材材料和接接种用具具进行严严格消毒毒外，各各种用具具更要求洗洗涤清洁洁，因为为各种灭灭菌方法法的有效效作用时时间都是是以材料料或用具具清洁为为前提的的。（一）洗洗涤液1.洗衣衣粉、洗洗洁精洗洗涤液适适用于玻玻璃器皿皿和金属属类器具具的洗涤涤。2.铬酸酸洗涤液液 由由重铬酸酸钾和浓浓硫酸混混合而成成，属强氧化化剂，对对无机离离子、灰灰尘效果果好，对对油污无无效。铬酸洗涤涤液的配配制：称称取重铬铬酸钾550g，加入11L蒸馏水，加热搅搅拌至完

24、完全溶解解；冷却却后注入入90mmL浓硫硫酸，混混合均匀匀即可。刚配好好的洗液液是棕红红色，反反复使用用至变成成青褐色色则失效效。【注意事事项】（1）配配制时重重铬酸钾钾溶液一定定要冷却却后才能能加浓硫硫酸，且且只能把把浓硫酸酸缓慢加加入重铬铬酸钾溶溶液中，决不能能将重铬铬酸钾溶溶液或蒸蒸馏水倒倒入浓硫硫酸中。（2）由于铬铬酸洗涤涤液具有有极强的的氧化能能力和腐腐蚀作用用，故不不要用手手直接接接触洗涤涤液。（二）各各类器皿皿和用具具的洗涤涤方法1.新的的玻璃器器皿：使使用前先先用1%稀盐酸酸浸泡112224h用毛刷蘸蘸洗衣粉粉水刷洗干净流水冲洗洗344次最后用用蒸馏水水冲淋11遍晾干（或烘烘干

25、）后后备用。2.已用用过的培培养器皿皿：除去去容器内内的残渣渣自来水水冲洗浸泡在在洗衣粉粉水中115330miin用毛刷刷刷洗干干净流水冲冲洗34次最后用用蒸馏水水冲淋11遍晾干（或烘干干）后备备用。3.已被被霉菌等等杂菌污污染的器器皿：1121高温高高压蒸汽汽灭菌330miin趁热倒倒去残渣渣自来水水冲洗浸泡在在洗衣粉粉水中115330miin用毛刷刷刷洗干干净流水冲冲洗34次最后用用蒸馏水水冲淋11遍晾干（或烘干干）后备备用。4.移液液管、量量筒等量量器：铬酸洗涤涤液中浸浸泡2hh以上取出后在在流水中中冲洗330miin蒸馏水水冲淋11次晾干（或烘烘干）后后备用。5.载玻玻片和盖盖玻片：洗

26、涤液液中浸泡泡数小时时水洗绸布擦擦干放在995%的的洒精中中备用。6.解剖剖刀、镊镊子、剪剪刀等：新购置置金属器器皿因其其上有润润滑油或或防锈油油，用蘸蘸有四氯氯化碳的的棉布擦擦去油脂脂，再用用湿布擦擦净，干干燥备用用。每次次使用后后先用洗洗衣粉水水刷洗，再用酒酒精擦拭拭。二、灭菌菌与消毒毒技术（一）灭灭菌与消消毒的区区别1有菌菌和无菌菌的范畴畴有菌的范范畴是：凡是暴暴露在空空气中的的物体，接触自自然水源源的物体体，至少少它的表表面都是是有菌的的。无菌的范范畴是：经高温温灼烧或或一定时时间蒸煮煮过后的的物体，经其他他理化灭灭菌方法法处理后后的物体体一般可可认为是是无菌的的。2.灭菌菌与消毒毒的

27、区别别灭菌是指指用物理理或化学学方法杀杀死物体体表面和和孔隙内内一切微微生物或或生物体体。消毒是指指杀死、消除或或充分抑抑制部分分微生物物，使之之不再发发生危害害作用。由灭菌和和消毒的的含义可可以看出出，二者者的主要要区别是是：灭菌菌是把所所有有生生命的物物质全部部杀死；而消毒毒主要杀杀死或抑抑制物体体表面的的微生物物，但芽芽孢、厚厚垣孢子子一般不不会死亡亡。（二）常常用的消消毒灭菌菌方法（三）消消毒灭菌菌技术1.环境境消毒：方法主主要有空空气过滤滤灭菌、紫外线线照射消消毒、喷喷雾消毒毒和熏蒸蒸消毒等等。空气过过滤灭菌菌：成规规模的植植物组织织培养车车间可采采用空气气过滤系系统对整整个环境境进

28、行空空气过滤滤灭菌，这种方方法投入入较高，操作要要求比较较严格，一般较较少采用用。组织织培养中中普遍采采用的是是对无菌菌操作的的微环境境进行空空气过滤滤灭菌，如超净净工作台台的局部部无菌环环境。紫外线线照射消消毒：利利用紫外外光波照照射灭菌菌，细菌菌吸收紫紫外线后后，蛋白白质和核核酸发生生结构变变化，引引起细菌菌的染色色体变异异，造成成死亡。缓冲间间、接种种间、培培养间等均可采采用紫外外线照射射消毒，一般照照射20030miin。喷雾消消毒：利利用700%75%的酒精精或0.2%的的新洁尔尔灭对环环境进行行喷雾，既可以以起到直直接杀死死环境中中微生物物的作用用，又可可以使飘飘浮的尘尘埃降落落，

29、防止止尘埃上上附着的的杂菌污污染培养养基和培培养材料料。熏蒸消消毒：利利用加热热焚烧、氧化等等方法，使化学学药剂变变为气体体状态扩扩散到空空气中，以杀死死空气和和物体表表面的微微生物。常用熏熏蒸剂是是甲醛，熏蒸时时，按22mLm3用量，将甲醛醛置于广广口容器器中，加加0.22g/mm3高锰酸酸钾氧化化挥发。熏蒸时时，房间间可预先先喷湿，关闭紧紧密，224h后后打开门门窗通风风。2.用具具的消毒毒灭菌：根据用用具种类类不同分分别采用用干热灭灭菌、湿湿热灭菌菌、浸泡泡消毒、擦拭消消毒等方方法。干热灭灭菌：利利用烘箱箱进行烘烘烤灭菌菌的方法法，适用用于各种种玻璃器器皿和器器械的灭灭菌消毒毒。方法法是

30、将清清洗后的的玻璃器器皿和器器械妥为为包扎，放入箱箱内，将将箱温控控制在11501700，烘烤1120mmin，即可达达到灭菌菌效果。在干热热条件下下，细菌菌的营养养细胞抗抗热性大大为提高高，故能能源消耗耗大，又又浪费时时间，所所以目前前多采用用湿热灭灭菌代替替，接种种工具也也可采用用消毒器器烘烤和和酒精灯灯外焰灼灼烧的方方法消毒毒。湿热灭灭菌：适适用于培培养基、玻璃器器皿、棉棉塞、布布制品及及金属用用具等的的灭菌，一般灭灭菌掌握握在0.10.115MPPa压力力下20030miin。浸泡消消毒：在在无菌操操作时，把镊子子、剪子子、解剖剖刀等浸浸入700%775%的的酒精中中浸泡，使用之之前取

31、出出在酒精精灯外焰焰上灼烧烧，待冷冷却后使使用。擦拭消消毒：接接种用具具及超净净工作台台表面等等使用前前可用770%酒酒精或00.10.22%新洁洁尔灭溶溶液进行行擦拭消消毒。3.培养养基灭菌菌：培养养基灭菌菌一般采采用湿热热灭菌，特殊情情况下采采用过滤滤无菌。湿热灭灭菌：采采用高压压蒸汽灭灭菌锅灭灭菌。过滤灭灭菌：主主要针对对一些不不能处于于高温高高压环境境的物质质，如GA3、IAAA、ABAA（脱落落酸）、ZT（玉米素素）、部部分维生生素、多多数抗生生素和酶酶。过滤滤灭菌的的原理是是细菌滤滤膜的网网孔直径径为0.45m以下下，当溶液液通过滤滤膜后，细菌的的细胞和和真菌的的孢子（直径11m以

32、上上）等因因大于滤滤膜网孔孔直径而而被阻。4.外植植体消毒毒：从外界界或室内内选取的的植物材材料，都都不同程程度地带带有各种种微生物物，因此，植物材材料必须须经严格格的表面面消毒处理理。接种的的植物材材料叫做做外植体体。外植植体的消消毒要求求比较严严格，既既要能有有效杀灭灭微生物物，又要要保证植植物组织织尽量少少受伤害害。外植植体一般般采用浸浸泡消毒毒的方法法，具体体方法在在以后课课程中讲讲授。III.作业1.不同同的培养养器皿怎怎样选择择与洗涤涤？2.植物物组织培培养环境境如何进进行消毒毒灭菌？3过滤滤灭菌的的技术原原理？第三节 植物物组织培培养操作作技术（2）一、授课课章节第三节 植物物组

33、织培培养操作作技术（2）。二、学时时安排2学时。三、教学学目标1掌握握培养基基的作用用。2掌握握培养基基中生长长调控物物质的作作用。3了解解培养基基的类型型。四、教学学重点、难点分分析重点：培养基的的基本成成分。难点：培养基中中生长调调节物质质的作用用。五、教具具电化教学学设备。六、教学学方法讲授法，演示法法。七、教学学过程.导入入培养基是是进行植植物组织织培养的的基质，进行植植物组织织培养必必须掌握握培养基基的基本本知识，今天我我们就学学习培养养基的种种类和基基本成分分。II.新新课三、培养养基制备备技术（一）配配制培养养基的目目的配制培养养基的目目的是人人为提供供离体培培养材料料的营养养源

34、。配配制的不不同培养养基，是是为满足足不同类类型植物物材料对对营养的的不同需需要。没没有一种种培养基基能够适适合一切切类型的的植物组组织或器器官，在在建立一一项新的的培养系系统时，首先必必须找到到一种合合适的培培养基，培养才才有可能能成功。（二）培培养基的的种类1.培养养基的种种类划分分培 养 基 种 类固体培养基：在液体培养基中加入一定量凝固剂，使其成为固体状态。根据形态液体培养基：培养基中没有凝固剂为液体状态。根据培养阶段根据培养进程根据营养水平初代培养基：初代培养阶段所用的培养基。继代培养基：继代培养阶段所用的培养基。完全培养基：在基本培养基中加入适宜的植物激素和有机附加物的培养基。基本

35、培养基：只含有无机盐、蔗糖、维生素和水等最基本成分的合成培养基。如Ms、White、Nitsch、N6等培养基。诱导培养基：初代培养时诱导外植体生长与脱分化的培养基。增殖培养基：继代培养中促进培养物快速增殖的培养基，也称扩繁培养基。生根培养基：诱导试管苗生根的培养基。2.常用用培养基基的配方方和特点点目前已已公开报报道的基基本培养养基有许许多种类类，各有有不同的的特点和和适用范范围，在在植物组组织培养养生产中中应根据据不同的的植物种种类和培培养部位位及不同同的培养养目的选选用不同同的培养养基。常用的培培养基配配方：表1 常用培培养基配配方含量（mg/L）MS（119622）B5（119688）

36、Whitte（19443）SH（19772）Knuddsonn C（19446）VW（19449）N6（19774）(NH44)2S04NH4NN03KN033Ca(NN03)24H20CaCll22H20Ca3(PO44)216500l90004401342500015080200250002005001000050052520046328300166MgS0047H20KH2PPO4NaH22P04H20Na2SSO4Na2EDTTA37017037.3325015037.33720172004001525025025025018540037.33FeSOO47H20Fe2(SO44)3K

37、ClFe2(C4H4O6)327.8827.882.56520252827.88NH4HH2PO4MnSOO4H20MnS0044H20ZnSOO47H20H3B003KINa2MMo0442H20MoO33CuSOO45H20CoCll26H2022.338.66.20.8330.2550.02250.0225102.03.00.7550.2550.02250.0225531.50.7550.00010.011300101.05.01.00.10.20.17.57.54.43.81.60.8盐酸硫胺胺素VBl烟酸盐酸吡哆哆醇VB6肌醇甘氨酸0.10.50.51002.0101.01.0100

38、0.10.30.135.05.05.01000010.50.52蔗糖pH3000005.82000005.52000005.63000005.82000005.82000005.55000005.8表2 常用基基本培养养基的特特点基本培养养基种类类设计由来来特点适用范围围MS19622年由MMuraashiige和和Skooog为为培养烟烟草细胞胞而设计计无机盐和和离子浓浓度较高高，为较较稳定的的平衡溶溶液；它它的硝酸酸盐和铵铵盐含量量较其他他培养基基为高，比例也也比较合合适，不不需要添添加更多多的有机机附加物物。广泛地用用于植物物的器官官、花药药、细胞胞和原生生质体培培养B519688年由G

39、Gambborgg等为培培养大豆豆根细胞胞而设计计除含有较较高的钾钾盐外，还含有有较低的的氨态氮氮和较高高的盐酸酸硫胺素素适合双子子叶植物物，尤其其木本植植物的培培养Whitte19433年由WWhitte为培培养番茄茄根尖而而设计无机盐数数量较低低，提高高了MggSO44的浓度度适于生根根培养SH19722年由Scchennk和Hiddebrranddt设计计盐分浓度度较高，铵态氮氮含量较较低，盐盐酸硫胺胺素和硝硝酸钾含含量较高高在不少单单子叶和和双子叶叶植物的的组培中中应用效效果较好好Knuddsonn C19222年由KKnuddsonn为兰科科种子培培养而设设计，后后经多次次改良成分简

40、单单，不能能满足大大多数植植物组织织细胞的的生长发发育所需需的营养养物质适用于兰兰科植物物种子培培养和萌萌发VWVaciin 和和Wennt 在在19449年设设计培养基的的总离子子强度稍稍低些，磷以磷磷酸钙的的形式供供给适用于气气生兰的的组培N619744年朱至至清等为为水稻等等禾谷类类作物花花药培养养而设计计成分较简简单，KKN033和(NHH4)2S04含量高高适用于单单子叶植植物花药药培养，广泛应应用于小小麦、水水稻及其其他植物物的花药药培养（三）培培养基的的组成培养基主主要有水水、无机机盐、有有机物、植物生生长调节节物质、培养基基的支持持材料五五大类组组成。1.水水水是植物物原生质质

41、体的组组成成分分，也是是一切代代谢过程程的介质质和溶媒媒。它是是生命活活动过程程中不可可缺少的的物质。配制培培养基母母液时要要用蒸馏馏水，以以确保母液液及培养养基成分分的精确确性，防防止贮藏藏过程发发霉变质质，大规规模生产产时可用用自来水水。但在在少量研研究上尽尽量用蒸蒸馏水，以防成成分的变变化引起起不良效效果。2.无机机元素(1)大大量元素素指浓度度大于00.5mmmollL的的元素，有N，P，KK，Caa，Mgg，S等等。常由由KN003、NH4NO3、KH2P04、NaHH2P04、KCll、MgSS047HH20、CaCCl22HH20等化合合物来提提供。(2)微微量元素素指浓度度小于

42、00.5mmmollL的的元素，Fe，B，MMn，CCu，MMo，CCo等。铁是一些些氧化酶酶、细胞胞色素氧氧化酶、过氧化化氢酶等等的组成成成分。同时，它又是是叶绿素素形成必必要的。培养养基中的的铁对胚胚的形成成、芽的的分化和和幼苗转转绿有促促进作用用。在制制作培养养基时不不用Fee2(S004)3和FeCCl3(因其其pH在在5.22以上，易形成成Fe(OH)3的不溶溶性沉淀淀)，而而用FeeS0447HH20和Na2-EDDTA结结合成螯螯合物使使用。BB，Mnn，Znn，Cuu，Moo，Coo等，也也是植物物组织培培养中不不可缺少少的元素素，缺少少这些物物质会导导致生长长发育异异常。3.

43、有机机化合物物(1)糖糖类：这这类有机机物的作作用一是是培养物物赖以生生长的碳碳源；二二是使培培养基维维持一定定的渗透透压。种类：常用的的有蔗糖、葡萄糖糖、果糖糖，麦芽芽糖、半半乳糖、甘露糖糖等在组织织培养中中也有应应用。使用浓浓度：一一般在2233。在大规规模生产产时，可可用食用用的绵白白糖代替替。（2）维维生素类类：这类化化合物在在植物细细胞中主要以以各种辅辅酶的形形式参与与多种代代谢活动动，对生生长、分分化等有有很好的的促进作作用。种类：硫胺素素(维生生素B11)、吡吡哆醇(维生素素B6)、烟烟酸(维维生素BB3，又称称维生素素PP)、泛酸酸(维生生素B55)、生生物素(维生素素H)、钴

44、胺素素(维生生素B112)、叶酸(维生素素B111）等。使用浓浓度：00.11.00 mgg/L(3)肌肌醇(环环己六醇醇)：作用：在糖类类的相互互转化中中起重要要作用；参与细细胞壁和和细胞膜膜的构建建；能促促进愈伤伤组织的的生长以以及胚状状体和芽芽的形成成；对组组织和细细胞的繁繁殖、分分化有促促进作用用。使用浓浓度：一一般为11OO mgL。(4)氨氨基酸：作用：是很好好的有机机氮源，可被细细胞直接接吸收利利用。常用种种类：甘甘氨酸、精氨酸酸、谷氨氨酸、谷谷酰胺、天冬氨氨酸、天天冬酰胺胺、丙氨氨酸等。有时应应用水解解乳蛋白白（LHH）或水水解酪蛋蛋白（CCH），但由于于它们营营养丰富富，极易

45、易引起污污染。如如在培养养中无特特别需要要，以不不用为宜宜。(5)天天然复合合物：其成分分比较复复杂，大大多含氨氨基酸、激素、酶等一一些复杂杂化合物物。它对对细胞和和组织的的增殖与与分化有有明显的的促进作作用，但但对器官官的分化化作用不不明显。它的成成分大多多不清楚楚，所以以一般尽尽量不使使用。椰乳 是椰子子的液体体胚乳。它是使使用最多多、效果果最大的的一种天天然复合合物，一般使使用浓度度在10020。它在在愈伤组组织和细细胞培养养中有促促进作用用。在马马铃薯茎茎尖分生生组织和和草莓微微茎尖培培养中起起明显的的促进作作用，但但茎尖组组织的大大小若超超过1mm时，椰乳就就不发生生作用。香蕉 用量

46、为为15002000g/LL。主要要在兰花花的组织织培养中中应用，对原球球茎增殖殖有明显显促进效效果，并有利利于壮苗苗与生根根。马铃薯薯 去掉掉皮和芽芽后，加加水煮330miin，经经过过滤滤，取其其滤液使使用。用用量为11502000gL。添加后后可得到到健壮的的植株。4.植物物生长调调节物质质 植植物生长长调节物物质是培培养基的的关键性性物质，对植物物组织培培养起着着决定性性作用，控制着着培养物物的脱分分化、再再分化和和形态建建成。（1）生生长素类类：作用：在组织织培养中中，生长长素主要要被用于于诱导愈愈伤组织织形成，诱导根根的分化化和促进进细胞分分裂、伸伸长生长长。种类及及活性：常用种种

47、类有IIAA(吲哚乙乙酸)、NAAA(萘乙乙酸)、IBAA(吲哚哚丁酸)、2，4-DD(2，4-二二氯苯氧氧乙酸)等。作作用能力力的强弱弱顺序为为：2，4-DDNAAAIBAAIAAA。稳定性性：IAAA是天天然存在在的生长长素，高高温高压压易被破破坏，也也易被细细胞中的的IAAA分解酶酶降解，受光也也易分解解，故要要避光贮贮存，过过滤灭菌菌。其他他3种生生长素为为人工合合成，耐耐高温高高压，不不易被分分解破坏坏。特别别是NAAA稳定定性好，活性较较高，价价格低廉廉，所以以应用最最普遍。溶解性性：生长长素不溶溶于水，IAAA、NAAA、IIBA配配制时可可先用少少量955酒精精助溶。2，44-

48、D可可用0.1moolLL的NaaOH或或KOHH助溶。（2）细细胞分裂裂素类：作用：诱导芽芽的分化化促进侧侧芽萌发发生长，细胞分分裂素与与生长素素相互作作用，当当组织内内细胞分分裂素生长素素的比值值高时，诱导愈愈伤组织织或器官官分化出出不定芽芽。促进细细胞分裂裂与扩大大。抑制根根的分化化。因此此，细胞胞分裂素素多用于于诱导不不定芽的的分化、茎、苗苗的增殖殖，而避避免在生生根培养养时使用用。种类及及活性：这类激激素是腺腺嘌呤的的衍生物物，包括括6-BBA(66-苄氨氨基嘌呤呤)、KKt(激激动素)、Ztt(玉米米素)等等。作用用能力的的强弱顺顺序是：ZT6-BBAKT，常常用的是是人工合合成的

49、、性能稳稳定的、价格适适中的66-BAA。溶解性性：细胞胞分裂素素不溶于于水，也也不溶于于酒精，一般可可溶于00.1mmol/L的盐盐酸或NNaOHH溶液中中。（3）赤赤霉素(GA)：有200多种，培养基基中添加加的是GGA3，主要要用于促促进幼苗苗茎的伸伸长生长长，促进进不定胚胚发育成成小植株株；此外外，赤霉霉素还用用于打破破休眠，促进种种子、块块茎、鳞鳞茎等提提前萌发发。一般般在器官官形成后后，添加加赤霉素素可促进进器官或或胚状体体的生长长。赤霉素溶溶于酒精精，配制制时可用用少量995酒酒精助溶溶。赤霉霉素不耐耐热，高高压灭菌菌后将有有70-1000失失效，应应当过滤滤灭菌。生长调节节物质

50、的的使用量量甚微，一般用用mgL表示示浓度。在组织织培养中中生长调调节物质质的使用用浓度，因植物物的种类类、部位位、时期期、内源源激素等等的不同同而异，一般生生长素浓浓度的使使用为00.0555 mggL，细胞分分裂素00.05510 mmgLL。5.培养养基的其其他成分分(1)琼琼脂：在固体体培养时时琼脂是是最好的的固化剂剂。琼脂脂是一种种由海藻藻中提取取的高分分子碳水水化合物物，本身身并不提提供任何何营养。琼脂能能溶解在在90以上热热水中，成为溶溶胶，冷冷却至440即凝固固为固体体状凝胶胶。琼脂脂的用量量在610gL之之间。一一般琼脂脂以颜色色浅、透透明度好好、洁净净的为上上品。琼琼脂的凝

51、凝固能力力除与原原料、厂厂家的加加工方式式有关外外，还与与高压灭灭菌时的的温度、时间、pH等等因素有有关，长长时间的的高温会会使凝固固能力下下降，过过酸过碱碱加之高高温会使使琼脂发发生水解解，丧失失凝固能能力。时时间过久久，琼脂脂变褐，也会逐逐渐丧失失凝固能能力。加入琼脂脂的固体体培养基基与液体体培养基基相比，优点在在于操作作简便，通气问问题易于于解决，便于经经常观察察研究等等，缺点点是培养物物的吸收收面积小小；各种养养分在琼琼脂中扩扩散较慢慢，影响响养分的的充分利利用；培养物物排出的的一些代代谢废物物，聚集集在吸收收表面，对组织织产生毒毒害作用用。(2)抗抗生物质质：抗生物物质有青青霉素、链

52、霉素素、庆大大霉素等等，用量量在520 mmgLL之间。添加抗抗生物质质可防止止菌类污污染，减减少培养养中材料料的损失失。抗生生素各有有其抑菌菌谱，要要加以选选择试用用，也可可两种抗抗生素混混用。但但应当注注意抗生生素对植植物组织织的生长长也有抑抑制作用用。（3）抗抗氧化物物：培养养基中添添加抗氧氧化物是是为了抑抑制外植植体和培培养物褐褐变。常常用的抗抗氧化剂剂有半胱胱氨酸、维生素素C、柠柠檬酸、聚乙烯烯吡咯烷烷酮（PPVP）等。（4）活活性炭：活性炭炭有很强强的吸附附作用，它可以以吸附非非极性物物质和色色素等大大分子物物质，包包括琼脂脂中所含含的杂质质，培养养物分泌泌的酚类类、醌类类物质及及

53、激素等等。通常常使用浓浓度为00.110ggL。培养基中中添加活活性炭的的作用：防止褐褐化；促促进生根根；降低低玻璃苗苗的产生生频率；活性炭炭在胚胎胎培养中中也有一一定作用用。但是是，活性性炭具有有副作用用：吸附培培养基中中的生长长调节物物质；削弱琼琼脂的凝凝固能力力，添加加时须注注意。III.作业1.培养养基的作作用是什什么？2.培养养基一般般包括哪哪些基本本成分？3.培养养基中添添加的植植物生长长调控物物质有哪哪些？ 各有有什么作作用？第三节 植物物组织培培养操作作技术（3）一、授课课章节第三节 植物物组织培培养操作作技术（3）。二、学时时安排2学时。三、教学学目标1掌握握培养基基母液的的

54、配制技技术。2掌握握培养基的的配制、分装包包扎技术术。3掌握握培养基基高压灭灭菌技术术。4掌握握无菌操操作技术术。四、教学学重点、难点分分析重点：1培养养基母液液配制。2培养养基的制制备技术术。3培养养基的高高压蒸汽汽灭菌。4无菌菌操作技技术。难点：1培养养基母液液、培养养基配制制的计算算。2无菌菌操作技技术步骤骤的剖析析。五、教具具电化教学学设备、试管苗苗、接种种工具、培养基基。六、教学学方法讲授法，模拟实实验法。七、教学学过程.导入入提问：培培养基的的作用。复习：培培养基的的基本成成分。II.新新课（四）培培养基的的配制1.培养养基母液液的配制制：所谓谓母液是是欲配制制培养液的的浓缩液液，

55、也称称贮备液液。母液液配制的的目的一一是方便便快速配配制培养养基，二二是保证证各物质质成分的的准确性性及配制制时的快快速移取取。（1）母母液配制制方法单配法法：将培培养基配配方中的的各种成成分分别别配成一一定浓度度的母液液。一般般mg/mL表表示。混配法法：将几几类营养养成分按按配方中中的用量量扩大一一定倍数数称量，分别溶溶解后各各类混合合在一起起定容到到一定体体积配成成混合母母液。（2）母母液配制制流程确定培养基配方确定母液种类计算称量溶解混合定容分装贴标签冰箱保存记录（3）母母液配制制要求母液浓浓缩倍数数：大量量元素110220倍；微量元元素10002200倍倍；铁盐盐1000倍；有有机物

56、11002000倍。选用蒸蒸馏水，分析纯纯或化学学纯试剂剂，防止沉沉淀。激素母母液浓度度：0.511mg/mL，11次配成成50mmL或1100mmL（4）药药品用量量的计算算：配制制母液时时药品用用量(mmg)=配方用用量(mmg)浓缩倍倍数制备容容量（LL）（5）母母液配制制技术 以MMS培养养基为例例，配制制过程如如下：表1 MS培培养基母母液配制制（单位位：mgg/L）母液种类类成分规定量扩大倍数数称取量母液体积积(mL)配1L培培养基吸吸取量(mL)大量元素KNO33NH4NN03MgSOO47H20KH2PP04CaCll22H2O1900016500370170440101900

57、0016500037000170004400010000100微量元素MnS0044H20ZnS0047H20H3B003KINa2MMo0442H20CuS0045H20CoCll26H2022.338.66.20.8330.2550.02250.02251002230086062083252.52.5l000010铁盐Na2EEDTAAFeS0044H2037.3327.8810037300278001000010有机物甘氨酸盐酸硫胺胺素盐酸吡哆哆醇烟酸肌醇2.00.10.50.51001002001050501000001000010大量元元素母液液 配配成浓缩缩10倍倍的母液液。用感感

58、量0.01gg托盘天天平按表表2-4称称取药品品，分别别加入1100mmL左右右蒸馏水水中，再再用磁力力搅拌器器搅拌促促进溶解解，然后后倒入110000mL容量量瓶中，再加水水定容至至刻度，成为110倍母液液。注意意Ca2+和SO42、PO43易发生生沉淀，因此CCaCll22HH2O充分溶溶解后最最后加入入。微量元元素母液液 配配成浓缩缩1000倍的母母液。用用感量0.00001g分分析天平平按表22-4准准确称取取药品后后，分别别溶解，混合后后加水定定容至110000mL。铁盐母母液 配成浓浓缩1000倍的的母液，用感量量0.001g托托盘天平平按表22-4称称取药品品，分别别溶解，混合后

59、后加水定定容至110000mL。有机物物母液 配成浓浓缩1000倍的的母液。用感量量0.0001gg分析天天平按表表2-4分分别称取取药品，溶解，混合后后加水定定容至110000mL。每种激激素必须须单独配配成母液液，浓度度一般配配成0.511mgmL，用用时根据据需要取取用。多多数激素素难溶于于水，要要先溶于于特定溶溶剂，然然后才能能加水定定容。具具体方法法为：IIAA、IBAA、GA、NAAA等先溶溶于少量量95的的酒精中中，再加加水定容容到一定定体积；2，4-DD可用少少量0.1mool/LL的NaaOH溶溶解后，再加水水定容到到一定体体积；KKt和BA先溶溶于少量量0.11moll/L

60、的的HCl中中再加水水定容。（6）母母液的保保存 将配制制好的母母液分别别倒入试试剂瓶中中，贴好好标签，在标签签上注明明母液名名称，配配制倍数数与日期期。然后后放入冰冰箱内44低温保保存，用用时再按按比例稀稀释。2.培养养基的配配制（1）培培养基配配制工艺艺流程确定培养基配方及用量计算母液用量移取母液定容玻璃器皿洗涤调节pH分装培养基熬制高压灭菌干燥称取琼脂、蔗糖封口标识、记录（2）培培养基制制备的操操作步骤骤确定培培养基配配方及用用量：根根据培养养对象、培养目目的等，通过查查阅资料料及咨询询等确定定培养基基配方，然后据据外植体体的数量量和试验验处理的的多少确确定培养养基的用用量。称取琼琼脂、