兔骨髓基质干细胞体外培养复合β－磷酸三钙进行胸椎后侧融合实验

1、兔骨髓基质干细胞体外培养复合磷酸三钙进展胸椎后侧交融实验【关键词】脊柱交融摘要：目的评价磷酸三钙复合骨髓基质干细胞为骨移植替代物进展脊柱交融的效果。方法60只兔子分四组进展胸椎后路交融：组组织工程化骨即TP复合BSs，组TP自体红骨髓，组单纯TP，组自体髂骨。术后12周处死其余动物进展放射学、手工力学和组织学检查。结果从影像学和手工力学比拟，组的交融率高于、组且有统计学差异。组织学上，组新骨形成量较多，陶瓷微孔内部充满新生骨;组骨小梁形成量较组少,为新生骨与纤维组织混杂；组陶瓷骨颗粒微孔内多为结缔组织，新生骨的量少，只见少量新生骨贴附于陶瓷骨外表;组在椎板与移植骨的交界处有稀疏的新生骨小梁形成

2、。结论TP复合BSs是脊柱交融自体骨的良好替代物。关键词：骨髓基质干细胞；磷酸三钙；脊柱交融；骨移植替代物BnearrstralderivedsteblastsprustrialiuphsphatepsitesasbnegraftsubstitutefrpsterirthraispinalfusinAbstrat：bjetiveTevaluatetheeffiayfautgenusbnearrstralderivedsteblastsprus(BSs)trialiuphsphate(TP)psitesasanalternativetautgenusgraftaterialsinspinalfu

3、sin.ethdPsterirthraispinefusinasarriedutin60hiteNeZealandrabbitsusingnefthefllinggraftaterials:TPgranulesplusulturedSs(grup);TPgranulesplusfreshautgenusbnearr(grup);TPgranulesalne(grup);andautgenusbnegraft(grup).Alltherabbitserekilled12eeksaftersurgerytevaluateithradigraphy,T,anualpalpatinandhistlgi

4、analysis.ResultTherateffusinassignifiantlyhigheringrupparedithgrup,grupandgrup;IngrupIhistlgialanalysisshedabundanenelyfredbneinntatiththeiplantedgranules;Ingrupthereereareduedauntfnelyfredbneandabundantfibrustissue;Ingrupthereererelativelylittlenebnefratinandabundantfibrustissue;Ingrup,thereerethin

5、trabeulaefnelyfredbnelsedtthedertiatedlainaandsefibrustissue.nlusinTheresultsindiatethatbnearrstralderivedsteblastTPpsitesayprvideanellalternativetautgenusgraftaterialsfrspinalfusin.Keyrds：Bnearrstralell;trialiuphsphate;Spinalfusin;Bnegraftsubstitutes脊柱交融材料的研制及生物学因素在脊柱交融的过程中所起的作用已引起广泛重视，本实验讨论应用多孔陶瓷磷

6、酸三钙TP，上海贝奥路生物材料公司复合培养骨髓基质干细胞(BSs)进展脊柱交融，以期到达良好的脊柱交融率，寻找更理想的脊柱交融骨移植替代材料。1材料和方法1.1骨髓基质干细胞体外培养和诱导分化将穿刺抽取的兔骨髓细胞液在1h内进展接种培养。按3105/2的密度接种于DE液培养瓶中，于37，5%2培养，5d后换液，去除未贴壁细胞，参加含成骨细胞诱导液的DE培养基进展诱导培养，使其向成骨细胞转化。以后每隔3d换液。细胞生长达交融8090后，用0.25%胰蛋白酶进展消化，计数。按134进展细胞传代。搜集第三代细胞备用。1.2载体TP的准备将TP人工骨制备成53大小，用三蒸水在超声清洗机上反复清洗，洗净

7、其外表及孔隙中的碎屑，枯燥后环氧乙烷消毒无菌包装备用。1.3组织工程骨的构建将TP人工骨颗粒浸在纤维连接蛋白100g/l溶液中，4条件下放置16h；然后换成DE培养基，并取传第三代的骨细胞，以510106/l的浓度与TP混合，在37，5%2培养条件下用摇床动态培养24h，其中复合培养12h换液1次。然后同等条件下改静态培养，体外培养35d。制备组织工程化人工骨复合物。1.4脊柱交融动物分组和手术方法1.4.1动物分组60只兔子分4组进展胸椎后路交融：组组织工程化骨即TP复合BSs，组TP自体红骨髓，组单纯TP，组自体髂骨。将拟植入的TP人工骨粒浸在纤维连接蛋白100g/l溶液中，4条件下放置1

8、6h。组：植入TP复合骨髓基质细胞。组：植入TP新颖自体骨髓(每侧5l，共10l/只)。组：植入单纯TP。组：植入自体髂骨皮质松质骨颗粒。植入材料均为5g。1.4.2手术方法兔耳静脉苯巴比妥钠35g/kg麻醉。剃毛、固定、消毒。胸椎后正中切口，显露双侧椎板和关节突关节；去除椎板小关节上软组织，并将椎板、小关节皮质骨打毛，刮勺刮去关节间隙局部软骨。每侧放置2.5g植骨材料。逐层缝合。术后分笼饲养。肌注青霉素80/d，共57d。1.5脊柱交融的评价方法1.5.1X线片结合T平扫及三维重建评估交融情况按照uryl3的分级标准评分,3、4分时诊断为巩固交融；2分、2分以下时诊断为假关节形成。由2名有经

9、历的医生用双盲法进展评估。转贴于论文联盟.ll.1.5.2非破坏性手工力学检测取出整块胸椎标本，修剪标本长度为交融节段加上下各1个椎体，保存上下各一节段正常未做交融节段的目的是做为交融节段力学检测的比照。剔除周围肌肉组织，去除前方椎体及保存各韧带前方椎板，关节突关节、横突，手工力学检测，评价交融情况。1.5.3组织学分析将上述力学检测的标本用4福尔马林固定24h，脱钙，石蜡包埋，切片，HE染色。光镜下观察。1.6统计学分析用SAS6.12软件非参数检验做统计学分析。当P0.05时，为有显著性差异。2结果2.1动物一般情况术后2d内死亡4只,及时补做实验;其余动物未见不良反响。2.2标本大体观察

10、剔除骨周软组织，植骨材料周围未见炎症现象。组较、组交融骨块体积大；在、组交融块的外面可以看到不同程度的陶瓷颗粒嵌于交融块中，组和组标本的陶瓷颗粒与周围组织粘附较严密，而组中陶瓷颗粒易于从周围组织中剥离。2.3影像学观察在X线片和T平扫及T三维重建上观察交融骨块，有以下特点：组的骨块形成量相对较大、植骨与椎板交融界面及质地均匀度均好于其它各组(图14)。按照uryl3制定客观分级标准,4组之间巩固交融的百分比有显著性差异P=0.0324;组的交融率高于、组(P0.05(表1)。表2手工触诊力学检测交融情况组别略2.4手工力学检测按Bden4的分级标准。组大局部获得巩固交融；组和组未交融标本形成率

11、均接近50，而巩固交融的比率相对低。组未交融比率明显低于、组P0.05，有统计学意义；、3组之间无显著性差异(表2)。表1放射学评分组别略2.5组织学观察组：整个交融骨块的陶瓷骨微孔内全部充满新生骨，中央有血管形成，无纤维结缔组织图5。组：交融骨块的陶瓷骨微孔内为新生骨和纤维结缔组织，新生骨的量明显少于组图6。组：与、组相比，陶瓷骨颗粒微孔内多为结缔组织，新生骨的量少，只见少量新生骨贴附于陶瓷骨外表图7。组：12周时，自体骨与椎板到达愈合，但骨小梁稀疏，没有再血管化的倾向图8。3讨论自体移植骨可以为新骨形成提供必要的材料包括骨形成细胞、生长因子以及支撑骨细胞和细胞间基质的支架构造。但是自体骨移

12、植尚有某些缺乏之处，难以普遍推广应用。寻找自体骨替代材料的研究已有多年1,尚无一致的结论。一些研究认为具有骨传导作用的材料单独应用于脊柱后外侧交融时不能获得较高的交融率2。加上具有骨诱导作用的物质特别是BP家族，比单用具有骨传导作用的材料能获得明显高的交融率1。然而，BP费用昂贵和可能引起异位骨化等副作用限制了其临床应用，况且BP在临床试验性应用中没有获得比单独应用自体移植骨5或脱钙骨基质更好的交融效果6。但也有动物实验说明BSs+BP较新颖红骨髓有更快、更强的成骨才能7。寻找更好的植骨交融材料是目前骨组织工程研究的热点。BSs有多向分化潜能，在体外一定的诱导条件下可以扩增分化为成骨细胞并分泌

13、细胞因子；TP陶瓷骨具有良好的生物相容性、孔隙率和机械性能，且能降解，是骨组织工程的良好载体。本实验研究说明用TP复合培养BSs进展脊柱交融比单独应用TP获得明显高的巩固交融率，并且有比自体骨交融率更高的趋势。TP可能影响放射学评分，在X线片和T均表现出有连续性骨块，但组织工程化骨组比单纯应用TP组似乎更均匀同质并且植骨与椎板连接更严密。这个结果在大体标本上也能证实：单独应用TP进展交融动物的交融块中，其陶瓷颗粒容易从交融块周围组织中剥脱，而应用TP复合BSs或参加新颖骨髓进展交融的交融块中，其陶瓷颗粒不容易从周围组织中剥脱。已经有很多研究通过长骨缺损的动物模型证实了新颖骨髓的骨诱导作用,然而

14、当新颖骨髓被用于脊柱后外侧交融时，其结果争议很大1，3。本研究说明，用TP复合BSs进展交融，其交融率比应用简单机械混合新颖骨髓的TP交融率高，并且组织学分析I组中新生骨的量明显比组多。本实验研究证实BSs经过体外刺激分化为骨祖细胞后可以种植到TP陶瓷骨上，这种复合材料在脊柱交融实验研究中可以促进新骨形成，其交融效果明显好于单纯TP陶瓷骨材料。参考文献：1BdenSD，artinGJJr，rne，etal.Theusefrallinehydrxyapatiteithbnearr,autgenusbnegraft,rsteindutivebneprtEinextratfrpsterlateral

15、lubarspinefusinJ.Spine,1999,15;24(4):320-327.2IthH，EbaraS，Kaiura，etal.ExperientalspinalfusinithusefrebinanthuanbnerphgenetiprtEIn2J.Spine,1999，15;24(14):1402-1405.3urylLJ,JhnstneB,PetersilgeA,etal.AugentatinfspinalarthrdesisithautlgusbnearrinarabbitpsterlateralspinefusindelJ.Spine，1999，5:434-438.4BdenSD，ShiandleJH,Huttn.Anexperientallubarintertransversepressspinalfusindel.Radigraphi,histlgi,andbiehanialhealingharateristisJ.Spine,1995,15;20(4):412-420.5FriedlanderGE,laytnRP,leDJ,etal.stegeniPrtein1(BP7)inthetreaten