蛋白质分析鉴定

1、蛋白质分析鉴定蛋白质分析鉴定第1页 第一节 蛋白质物理化学性质分析蛋白质分析鉴定第2页 蛋白质由氨基酸组成，含有氨基酸一些功效基团，保留了一些氨基酸性质，但又发生了质改变，具备一些氨基酸没有性质。蛋白质分析鉴定第3页、 蛋白质两性解离和等电点 两性解离：蛋白质是两性电解质，解离情况比氨基酸复杂得多。在特定pH值范围内，蛋白质解离产生带正电荷或负电荷基团，分折蛋白质滴定曲线可得到各解离基团PK值蛋白质分析鉴定第4页等电点pI 指某一pH值时，蛋白质所带正负电荷恰好相等，净电荷为0，此时溶液pH值称为等电点。 蛋白质分子所带电荷性质和数量由蛋白质分子中可解离基团种类和数目、溶液pH值所决定。 pH

2、大于pI，蛋白质带负荷，电场中向阳极移动 pH=pI，电场中不移动，蛋白质沉淀出，此时导电率、渗透压、粘度等均达最低值。 pH小于pI， 蛋白质分子带正电荷，电场向阴极移动。蛋白质分析鉴定第5页蛋白质等离子点（特征常数）： 指在纯水中（即没有其它盐类存在）蛋白质正离子数等于负离子数pH值。因蛋白质等电点不是一成不变，它随溶剂性质、离子强变等原因而改变。蛋白质分析鉴定第6页二、蛋白质分子大小 相对分子质量Mr从一万到几百万或更大，对Mr测定，按性质分两类： 1.依据化学组成测定最低相对分子量 利用化学分析定量测定蛋白质中某一特殊元素含量，并假定蛋白质分子中含1个这种元素，蛋白质分析鉴定第7页2.

3、 用物理化学方法来测定蛋白质相对 分子质量 是当前常见方法，包含测定质点：扩散系数、沉降超离心、凝胶过滤、渗透压等。 渗透压测定法最为方便，但准确度较差，超离心法最为准确，但需昂贵超速离心机，蛋白质分析鉴定第8页 三、 蛋白体胶体性质 胶体：指质点大小在1nm-100nm范围内所组成分散系统 蛋白分子直径2nm-20nm，其溶液是胶溶液而且其分子表面分布有亲水氨基酸极性R基，是一个亲水胶体，含有亲水胶体性质： 1、 含有半通透性 2、丁达尔效应 3、布朗运动等。蛋白质分析鉴定第9页蛋白质相对分子质量大，在溶液中形成颗粒大，不能经过半透膜。透析：利用蛋白质不能经过半透膜性质将其与小分子物质分开分

4、离方法蛋白质分析鉴定第10页四、蛋白质沉淀作用 蛋白质保持稳定亲水胶体状态，这种稳定性主要由两原因决定：1、 水化作用 存在有极性R基（NH2、COOH、OH等），故蛋白质分子表面结合有一层水分子，称为水化膜，其可预防分子互碰而聚集。蛋白质分析鉴定第11页2 、电荷排斥作用 蛋白质是两性分子，一定pH值下，分子带相同电荷，同性电荷互斥，使分子不能聚集。 由此，改变稳定性条件，蛋白质稳定性被破坏，从溶液中沉淀出来： a 加入脱水剂除去水膜 b 使pH=pI c 加入电解质使质点表面失去同种电荷。蛋白质分析鉴定第12页 五、蛋白质变性作用 天然蛋白质受到理化原因影响，氢键、盐键等次级键维系高级结构

5、遭到破坏，分子内部结构发生改变，致使生物学 性质、理化性质改变现象。 蛋白质分析鉴定第13页物理原因： 加热、紫外线、X射线、超声波化学原因：强酸、强碱、尿素、乙醇、三氯醋酸等蛋白质变性后，结构虽有改变，但组成成份和Mr没有改变 蛋白质分析鉴定第14页六、蛋白质颜色反应 可作为蛋白质定性定量测定依据蛋白质分析鉴定第15页1、茚三酮反应(Ninhydrin Reaction)氨基酸和水化茚三酮(苯丙环三酮戊烃)功效时，产生蓝色反应，因为蛋白质是由许多氨基酸组成，所以也呈此颜色反应。蛋白质分析鉴定第16页2、双缩脲反应(Biuret Reaction) 蛋白质在碱性溶液中和硫酸铜功效展现紫红色，称

6、双缩脲反应。凡分子中含有两个以上CONH键化合物都呈此反应，蛋白质分子中氨基酸是以肽键相连，所以，全部蛋白质都能和双缩脲试剂发生反应。蛋白质分析鉴定第17页3、米伦反应(Millon Reaction)蛋白质溶液中加入米伦试剂(亚硝酸汞、硝酸汞及硝酸混和液)，蛋白质首先沉淀，加热则变为红色沉淀，此为酪氨酸酚核所特有反应，所以含有酪氨酸蛋白质均呈米伦反应。蛋白质分析鉴定第18页第二节 蛋白质分析技术蛋白质分析鉴定第19页氨基酸序列分析电泳技术空间结构分析生物质谱技术蛋白质分析鉴定第20页多肽链中氨基酸序列分析 怎样才能确定蛋白质分子一级结构呢？测定蛋白质一级结构，就是要确定蛋白质多肽链中氨基酸残

7、基排列次序，其基础战略是由Sanger开创肽链端基分析法与不一样切点肽片段拼对法巧妙结合。蛋白质分析鉴定第21页确定蛋白质分子一级结构，普通需要经过以下步骤：纯化待测蛋白质分子，测定其分子量并确定分子中多肽链数目。 对于由两条及两条以上多肽链组成蛋白质分子，则需将其拆开（断裂二硫键）并单独分离出来。蛋白质分析鉴定第22页2. 分析多肽链氨基酸组成。 将多肽链用酸或酶完全水解，再用离子交换树脂（或用高效液相色谱）将各种氨基酸分离开，测定其含量并计算各种氨基酸组成百分比。下列图表示蛋白质水解产物经过Moor-Stein Dowex 50离子交换柱层析自动分析结果。蛋白质分析鉴定第23页3. 端基分

8、析 分析确定多肽链N-末端和C-末端氨基酸残基，作为整条多肽链标志点。N-末端测定多用二硝基氟苯法和丹磺酰氯法，C-末端测定可用肼解法和羧肽酶法。蛋白质分析鉴定第24页4. 将多肽链裂解为小肽段。 采取专一化学法或蛋白酶水解法可在特定位点将大分子多肽链个别降解为小肽段，再采取适当分离方法，将这些小肽段分别分离开来。蛋白质分析鉴定第25页5. 肽片段氨基酸次序分析。 采取Edman降解法，分别分析测定各肽片段氨基酸排列次序。该法用异硫氰酸苯酯标识N-末端氨基酸残基，然后将其水解并分离出来加以判定，剩下肽片段回收后再进行下一个残基分析测定。如此循环操作，就能够将一条肽片段全部氨基酸次序排列出来。蛋

9、白质分析鉴定第26页电泳技术纸电泳醋酸纤维薄膜电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE) (可分为圆盘电泳和垂直平板电泳）琼脂糖凝胶电泳SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳等电聚焦(IEF)双向电泳毛细管电泳蛋白质分析鉴定第27页 在外加电场作用下，带电蛋白质颗粒在电场中移动速度（v）取决于电场强度(E)，所带净电荷(q)，蛋白质分子量、分子形状以及与介质摩擦系数(f)。蛋白质分析鉴定第28页聚丙烯酰胺凝胶电泳法 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE)是利用聚丙烯酰胺凝胶作为支持物电泳法，聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙稀酰胺和交联剂甲叉双丙稀酰胺交联而成多孔网状凝胶。 不连续PAGE有分离胶、浓缩胶和样品胶。 PAGE分辨率

10、很高。蛋白质分析鉴定第29页电泳过程蛋白质分析鉴定第30页SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS）电泳法SDS（十二烷基磺酸钠）是一个阴离子型表面活性剂，它能够与蛋白质多肽链中氨基酸残基按大约1 1.4百分比结合。每一个蛋白质分子都因为结合了许多SDS而带有大量负电荷，而蛋白质分子原有电荷则能够忽略。该法主要利用了蛋白质分子量大小不一样而分离蛋白质。用已知分子量蛋白质作为标准，则能够估算出不一样蛋白质分子量。蛋白质分析鉴定第31页双向电泳：2-DE技术依然是大多数蛋白质组研究中分离复杂蛋白质混合物首选技术 。蛋白质分析鉴定第32页双向电泳分析中样品制备制备标准： 应使全部待分析蛋白样品全部处于溶解状态

11、（包含多数疏水性蛋白），且制备方法应含有可重现性。 预防样品在聚焦时发生蛋白聚集和沉淀。 预防在样品制备过程中发生样品抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。 完全去除样品中核酸和一些干扰蛋白。 尽可能去除起干扰作用高丰度或无关蛋白，从而确保待研究蛋白可检测性。蛋白质分析鉴定第33页样品溶解是2-DE成功分离蛋白质最关键原因之一。溶解目标：1、样品中非共价结合蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽溶解液（不然样品中结合牢靠蛋白复合物可能使2-DE中出现新蛋白点，对应表示单个多肽点强度会下降）；2、溶解方法必须允许可能干扰2-DE分离盐、脂类、多糖和核酸等物质去除；3、溶解方法要确保样品

12、在电泳过程中保持溶解状态。蛋白质分析鉴定第34页增加样品溶解性伎俩变性剂：经过改变溶液中氢键结构使蛋白质充分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低靠近疏水残基能量域。其经典代表是尿素和硫尿。表面活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质疏水基团后，还常需最少一个表面活性剂来溶解疏水基团。常见表面活性剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100和NP-40、两性离子去污剂CHAPS、OBG等。其中CHAPS和SB3-10最好。还原剂：在变性剂和表面活性剂联用条件下，加用还原剂可使已变性蛋白质展开更完全，溶解更彻底。常见含自由巯基DTT或-巯基乙醇，以及不带电荷三丁基膦（TBP）进行还原。蛋白质分

13、析鉴定第35页起载体作用两性电解质：即便在变性剂和表面活性剂存在情况下，一些蛋白质也需要在盐离子作用下才能保持其处于溶解状态，不然这些蛋白质在其处于PI点时会发生沉淀。Carrier ampholytes作用在于捕捉样品中少许盐分，从而确保蛋白质溶解性。应用时，两性电解质浓度应小于0.2（w/v)。浓度过高会使IEF速度降低。另外，为了确保试验准确性，在选择不一样pH范围IPG胶条时，也应使两性电解质pH值与之相符合。蛋白质分析鉴定第36页一维固相pH梯度等电聚焦（IEF with IPG）： IPG胶材料是Immobilines，为拥有CH2=CH-CO-NH-R结构8种丙烯酰胺衍生物系列，

14、其中R包含羧基或叔氨基团，它们组成了分布在pH310不一样值缓冲体系。依据公布配方计算后，将适宜IPG试剂添加至混合物中用于凝胶聚合，在聚合中缓冲基团经过乙烯键共价聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度。经过这种方式生成IPG不会发生电渗透作用，因而能够进行尤其稳定IEF分离到达真正平衡状态。 蛋白质分析鉴定第37页蛋白质分析鉴定第38页蛋白质分析鉴定第39页蛋白质分析鉴定第40页IPG IEF 中pH梯度选择 常见方法：先宽后窄，先线性后非线性，先短后长，预试验确定。蛋白质分析鉴定第41页两维间平衡 一维结束后可马上进行二维电泳，也可保留在两片塑料膜间于80保留数月。但在二维电泳前一定要进行胶

15、条平衡，方便于被分离蛋白质与SDS完整结合，从而在SDS是电泳能顺利进行。蛋白质分析鉴定第42页二维SDS 同普通SDS类似。 但普通在垂直电泳系统中无需浓缩胶，因为在IPG胶条中蛋白质区域已得到浓缩，能够认为非限制性IEF胶（低浓度丙烯酰胺胶）充当了浓缩胶。 蛋白质分析鉴定第43页蛋白质分析鉴定第44页凝胶图像处理分析和经典流程凝胶图像扫描：图像加工：斑点检测和定量：凝胶配比：数据分析：数据呈递和解释：2-DE数据库建立：蛋白质分析鉴定第45页双向电泳分类 非变性2D：两向均在非变性条件下进行，这么分离蛋白质点等电点和表观分子量同生理条件下取得这些蛋白值是一样 非变性/SDS-2D：第一向采

16、取非变性IEF，之后在2%SDS溶液中平衡；第二向也在SDS存在条件下进行。适于分析非共价键连接蛋白蛋白间相互作用。蛋白质分析鉴定第46页非变性/还原/SDS-2D：非变性条件下IEF聚焦，之后用8M尿素5%-ME2%SDS进行平衡，再进行第二向SDS-PAG电泳。此时分离蛋白质点可进行点切取、蛋白酶消化、MALDI-TOF-MS分析判定，提供关于断裂二硫键连接多肽信息。变性2D：样品先用2%SDS5%-ME95变性5min，IEF在8M尿素1%NP-40条件下进行，之后胶条用2%SDS5%-ME平衡，然后进行SDS。该技术适于DNA序列和多肽结构分析，或分析被碳氢键连接和其它翻译后修饰所引发

17、多肽结构微异质性，但此方式显示大于100Kd蛋白质点少于第三种方式蛋白质分析鉴定第47页 毛细管电泳 capillary electrophoresis蛋白质分析鉴定第48页 毛细管电泳 capillary electrophoresis 是利用被分析离子在电场作用下移动速率不一样而到达分离目标，这种技术主要用来分析在毛细管缓冲溶液中能离解为离子物质。 蛋白质分析鉴定第49页 以毛细管为分离通道，高压直流电场为驱动力新型液相分析技术。可将有生物化学意义复杂化合物在不改变其性质前提下进行分离蛋白质分析鉴定第50页优点: 操作简单，试样量少，分离效率高，成本低等。缺点：在迁移时间上重现性，进样准确

18、性和检测灵敏度方面比高效液相色谱法稍逊。蛋白质分析鉴定第51页毛细管电泳基础原理 离子电泳迁移率不一样，在电场中移动速度不一样，利用这个原理能够把不一样离子彼此分离。电泳迁移率与分析物质所带电荷呈正比，与摩擦阻力系数呈反比。假如两种物质带有不一样电荷或者经过缓冲溶液移动摩擦力不一样，那么这两种物质能够彼此分离。蛋白质分析鉴定第52页毛细管电泳装置蛋白质分析鉴定第53页毛细管电泳在蛋白质分析应用分子量测定等电点测定肽谱分析（指纹图）测定蛋白质一级结构迁移率测定蛋白质分析鉴定第54页检测方法紫外吸收、激光诱导荧光数据统计参量：峰面积、峰高、峰间距蛋白质分析鉴定第55页蛋白质空间结构分析二级结构测定

19、通常采取圆二色光谱(circular dichroism，CD)测定溶液状态下蛋白质二级结构含量。 -螺旋CD峰有222nm处负峰、208nm处负峰和198 nm处正峰三个成份；而-折叠CD谱不很固定。 蛋白质分析鉴定第56页X衍射晶体分析 (X-ray crystallography)蛋白质分析鉴定第57页核磁共振蛋白质分析鉴定第58页 瑞士科学家库尔特维特里希则创造了“利用核磁共振技术测定溶液中生物大分子三维结构法”。 这种方法优点是可对溶液中蛋白质进行分析,进而可对活细胞中蛋白质进行分析,能取得“活”蛋白质结构,其意义非常重大。这种方法原理选择生物大分子中质子(氢原子核) 作为测量对象,

20、连续测定全部相邻2个质子之间距离和方位,这些数据经计算机处理后就可形成生物大分子三维结构图。蛋白质分析鉴定第59页 核磁共振(NuclearMagnetic Resonance -NMR) 现象是1946 年由哈佛大学伯塞和斯坦福大学布洛赫用不一样方法在各自试验室里观察到。核磁共振分析技术是利用经过对核磁共振谱线特征参数测定来分析物质分子结构与性质.NMR 不破坏被测样品内部结构,是一个无损检测方法.因为不一样原子核吸收不一样电磁波,因而经过测定和分析受测物质对电磁波吸收情况就能够判定它含有哪种原子,原子之间距离有多大,并据此分析出它三维结构。蛋白质分析鉴定第60页 最初,核磁共振技术主要用于

21、核物理研究方面,用它测量各种原子核磁矩,误差仅是0. 003 %0. 005 %。 1985 年,维特里希等人公布了第一次利用NMR 法测定溶液中蛋白质蛋白酶抑制剂IIA ( proteinase inhibitor IIA) 结构(如图4 所表示) 。1990 年用NMR 测定蛋白质结构有23 个,而到1994 年一年测定蛋白质结构数上升到100个。1997 年,维特里希应用NMR 方法测定一个蛋白质蛋白感染素(prion protein) 结构。蛋白质分析鉴定第61页在水溶液中,大约有二分之一蛋白质链展现出规则、紧密 三维结构 ,而另二分之一则非常松 。当前,科学家已经利用这一方法绘制出1

22、5 %20 %已知蛋白质结构。蛋白质分析鉴定第62页质谱分析法质谱分析法是化学领域中一个非常主要分析方法。它经过测定分子质量和对应离子电荷实现对样品中分子分析。质谱分析用于生物活性分子研究含有以下优点:灵敏度极高,能为亚微克级试样提供信息,适合用于复杂体系中痕量物质判定和结构测定 。质谱技术含有非常强结构分析能力,而且样品用量极少(10 - 11g) 。19 世纪末科学家已经奠定了这种方法基础,1912 年科学家约瑟夫汤普生(Joseph Thompson) 第一次利用它取得对小分子分析结果.蛋白质分析鉴定第63页蛋白质分析鉴定第64页 首先将成团生物大分子拆成单个生物大分子,并将其电离,使之

23、悬浮在真空中,然后让它们在电场作用下运动。不一样分子经过指定距离时间不一样,质量小分子速度快些,质量大分子速度慢些,经过测量不一样分子经过指定距离时间,就可计算出分子质量。蛋白质分析鉴定第65页质谱图与分子结构相关 质谱是唯一能够给出准确分子量，对化合物分子式确实定起决定性作用。 质谱法优势：基础原理蛋白质分析鉴定第66页蛋白质分析鉴定第67页蛋白质分析技术（2）一、Western Blot 二、ELISA三、免疫荧光技术四、免疫组织化学技术 五、蛋白质与蛋白质相互作用研究技术蛋白质分析鉴定第68页一 Western Blot1 原理：将经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质转移到硝酸纤维素或PVD

24、F膜上，然后与能特异性识别待检蛋白抗体进行反应，洗涤去除没有结合特异性抗体后，加入标识、能识别特异性抗体种属特异性抗体，反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合标识抗体，加入适合标识物检测试剂进行显色或发光等，观察有没有特异性蛋白条带出现，也可经过条带密度大小来进行特异性蛋白半定量。蛋白质分析鉴定第69页2 操作过程SDS电泳 转膜（PVDF或硝酸纤维素膜）封闭 一抗 洗涤 酶标二抗反应洗涤 显色或化学发光显影蛋白质分析鉴定第70页蛋白质分析鉴定第71页蛋白质分析鉴定第72页二、ELISA1 原理： ELISA基础是抗原或抗体固相化及抗原或抗体酶标识。在测定时，受检标本与固相载体表面抗原或抗体起

25、反应。再加入酶标识抗原或抗体，也经过反应而结合在固相载体上。此时固相上酶量与标本中受检物质量呈一定百分比。加入酶反应底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物量与标本中受检物质量直接相关，故可依据呈色深浅进行定性或定量分析。测定方法含有很高敏感度（pg-ng/ml水平），而且重复性好。 蛋白质分析鉴定第73页ELISA 常见酶和底物辣根过氧化物酶，底物为OPD, 深桔黄色 ，检测波长492nm；TMB， 蓝绿色，检测波长450nm 碱性磷酸酶，底物为PNPP（对消基苯磷酸酯）, 黄色检测波长405nm能够一次包被多块板，冻存备用 蛋白质分析鉴定第74页ELISA各步骤及反应时间 包被：2436h，蛋白浓度为15ug/ml 封闭：37C 2h 或4C过夜（3BSA） 样本反应：37C 4