蛋白质药物的peg化学

1、蛋白质药物的peg化学蛋白质药物的peg化学第1页蛋白质药物的peg化学第2页蛋白质药物的peg化学第3页1.快速被体内酶降解2.肾小球过滤去除3.抗原抗体反应4.溶解度差造成沉淀蛋白质药品在使用中出现问题TC实际浓度理想浓度蛋白质药物的peg化学第4页体外聚乙二醇修饰（PEG化）(1)增大药品分子量，防止被肾小球过滤(2)妨碍蛋白酶降解作用(3)屏蔽药品免疫位点(4)增加药品在体液中溶解度(5)与药品间化学键在体内随时间水解，迟缓释放药品 +蛋白或多肽偶联物聚乙二醇CH3(-O-CH-CH)n-OH蛋白质药物的peg化学第5页聚乙二醇修饰又称为分子PEG 化( PEGylation) ，是2

2、0世纪70 年代后期发展起来前景技术。大多化学药品与蛋白质、多肽类等药品在产生作用同时，存在本身缺点，将具有活性聚乙二醇与其进行偶联，影响了分子空间结构，导致生物化学性质改变，到达了增加体内半衰期，增加药品水溶性，降低免疫原性，改进药代动力和药效性质，提升临床应用范围等效果。蛋白质药物的peg化学第6页聚乙二醇介绍聚乙二醇（poly(ethylene glycol)）是一类聚醚类聚合物。伴随平均分子量不一样，性质也产生差异。当分子量小于1000 Da时，聚乙二醇是无色无臭粘稠液体，高分子量聚乙二醇则是白色固体。固体聚乙二醇熔点正比于分子量，逐步靠近67极限。聚乙二醇分子中含有大量乙氧基，能够与

3、水形成氢键，含有高度亲水性，在水溶液中有较大水动力学体积，能改变药品在水溶液中生物分配行为和溶解性，在其修饰药品周围产生空间屏障，降低药品酶解，防止在肾脏代谢中很快被消除，并使药品能被免疫系统细胞识别。聚乙二醇修饰蛋白质普通构象不会改变，其结合物生物学活性主要由结合物蛋白质个别产生。聚乙二醇含有免疫学惰性，即使分子量高达5.9106 Da，本身免疫原性也很低。临床上使用聚乙二醇修饰蛋白治疗时，未发觉抗聚乙二醇抗体产生。聚乙二醇是经美国食品药品管理局（FDA）同意极少数能作为体内注射药用合成聚合物之一。蛋白质药物的peg化学第7页蛋白质药物的peg化学第8页目 录 PEG修饰反应类型 PEG修饰

4、剂研发 PEG修饰方法 PEG修饰工艺优化 PEG修饰产物质量控制蛋白质药物的peg化学第9页一、PEG修饰反应类型蛋白质药物的peg化学第10页在20种组成蛋白质常见氨基酸中，只有含有极性氨基酸残基侧链基团才能够进行化学修饰。活化聚乙二醇经过与蛋白质分子上氨基酸残基进行化学反应而实现与蛋白质偶联。这些氨基酸残基上反应性基团多呈亲核性，其亲核活性通常按以下次序依次递减：巯基-氨基-氨基羧基（羧酸盐）羟基。以下按照蛋白质分子上与聚乙二醇偶联基团不一样进行分类介绍。蛋白质药物的peg化学第11页氨基修饰蛋白质分子表面游离氨基含有较高亲核反应活性（主要为赖氨酸-氨基和末端氨基），普通不处于活性中心部

5、位，因而成为化学修饰中最常见被修饰基团。这些被修饰基团主要是赖氨酸-、-氨基和末端氨基。同时用于氨基修饰PEG 种类也较多， 其中氰脲酰氯法、 烷基化和酰基化是常见氨基修饰方法。蛋白质药物的peg化学第12页巯基修饰半胱氨酸上巯基通常处于蛋白质内部，位于蛋白质表面自由巯基远少于氨基不过位置确定， 因而可针对那些对活性影响不大、呈游离状态巯基进行定量、定点修饰。若天然蛋白中不含半胱氨酸，则可经过基因工程改造方法在蛋白特定区域引入一个或一个以上自由半胱氨酸，对蛋白质进行定点修饰，这一方法不但能够实现高度选择性修饰，而且能够降低蛋白生物活性丧失，并降低免疫原性。最常见修饰剂为MAL-PEG。蛋白质药

6、物的peg化学第13页羧基修饰羧基修饰位点包含天冬氨酸、谷氨酸及末端羧基。首先将聚乙二醇分子中端基转化为氨基，再在碳二亚胺存在条件下与蛋白质羧基结合，但同时也易产生其它交联反应。多年来发觉PEG-酰肼可与羧基特异结合。在EDC 存在下， 酸性条件（pH=4.55） 时， 蛋白质中氨基被质子化防止了交联反应发生。蛋白质药物的peg化学第14页二、PEG修饰剂研发蛋白质药物的peg化学第15页Sc-PEG 专利分析以PEG-OH为原料必定路径CH3OCH2CH2(OCH2CH2)nOH + 光气 + NHS CH3OCH2CH2(OCH2CH2)nO-C-O-N + NH2G-CSFOOOCH3O

7、CH2CH2(OCH2CH2)nO-C-NHG-CSF O单链修饰：(SC-PEG)蛋白质药物的peg化学第16页Roche企业长期有效干扰素产品专利分析一样是以PEG-OH为原料必定路径双链修饰：蛋白质药物的peg化学第17页新修饰策略采取新方法制备新修饰剂以PEG-COOH（CM-PEG)为原料必定路径CH3(OCH2CH2)nOCH2CH2OHCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-O- N + NH2G-CSFOOO单链修饰：CH3(OCH2CH2)nOCH2COOHCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NHG-CSFO(CM-PEG)蛋白质药物的peg化学第18页以PEG-COOH

8、为原料必定路径CH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NHOOO双链修饰：CH3(OCH2CH2)nOCH2COOH + Lysine OCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NH-O(CH2)3CH2CH-C-O-N+ NH2IFNCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NHOOCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NH-O(CH2)3CH2CH-C-NHIFN蛋白质药物的peg化学第19页PEG修饰剂批量制备蛋白质药物的peg化学第20页PEG修饰剂批量制备分枝型ZL 01141745.5蛋白质药物的peg化学第21页PEG修饰剂批量制备分叉(长尾)型ZL 03100736.8蛋白质药

9、物的peg化学第22页PEG修饰剂批量制备可逆型ZL03105003.4蛋白质药物的peg化学第23页PEG修饰剂批量制备不可逆型10029577.1ZL02120740.2蛋白质药物的peg化学第24页PEG修饰剂批量制备异端基双官能团10029577.1蛋白质药物的peg化学第25页聚乙二醇修饰剂产品产品号末端基团分子量mPEG-OH5-OH5KmPEG-OH10-OH10KmPEG-OH20-OH20KmPEG-COOH5-COOH5KmPEG-COOH10-COOH10KmPEG-COOH20-COOH20KMPEG-NHS5-N-羟基琥珀酰亚胺5KMPEG-NHS10-N-羟基琥珀酰

10、亚胺10KMPEG-NHS20-N-羟基琥珀酰亚胺20K蛋白质药物的peg化学第26页三、药用蛋白PEG修饰方法蛋白质药物的peg化学第27页创新技术（反应器技术和产物移走技术）振荡反应器流加反应器缓释反应器固相反应方式膜耦合反应方式双水相反应方式Q. Yun, R. Yang, T. Chen, J. Bi, G. Ma, Z Su. J. Biotechnology, , 118: 67-74中国创造专利，申请号10114930.0 中国创造专利，申请号0410029577 1.修饰反应器设计PEG-pellet 反应器蛋白质药物的peg化学第28页吸附蛋白加入PEGPEG修饰洗脱2.固相

11、吸附法制备PEG修饰蛋白蛋白质药物的peg化学第29页固相吸附法与液相吸附法比较1峰：原蛋白；2峰：单修饰蛋白； 3峰：多修饰蛋白蛋白质药物的peg化学第30页3. 引入巯基方法制备PEG修饰蛋白(2) PEGylationSNH+(1) ThiolationHS-(CH2)3-C-NH-HbNH+NOOPEG-S-(CH2)3-C-NH-HbNH+OPEGNO2-iminothiolaneNH2-Hb蛋白质药物的peg化学第31页该PEG修饰产物凝胶过滤分析蛋白质药物的peg化学第32页四、PEG修饰工艺优化蛋白质药物的peg化学第33页PEG修饰反应参数优化 建立反应动力学，包含位点反应动

12、力学和蛋白分 子反应动力学，优化反应时间 优化反应pH值 优化PEG与蛋白摩尔比 优化反应体系蛋白质药物的peg化学第34页pTimeppppp 蛋白分子修饰反应动力学Weijun Li, Zhiguo Su. Quantitatively investigating monomethoxypolyethylene glycol modification of protein by capillary electrophoresis, J. Biochem. Biophys. Methods. ，59: 65-74蛋白质药物的peg化学第35页PEG修饰位点反应动力学蛋白质药物的peg化学第36页PEG醛修饰药用蛋白优化反应蛋白质药物的peg化学第37页 膜耦合修饰工艺制备PEG化药用蛋白蛋白质药物的pe