重组蛋白质药物纯化清洁验证

1、重组蛋白质药物纯化清洁验证重组蛋白质药物纯化清洁验证第1页目录清洁验证定义法规对清洁验证要求清洁验证前提设备分组待清洁成份可接收程度取样方法取样点选择检验方法特殊设备清洁验证再验证偏差与变更控制案例分析Company Logo重组蛋白质药物纯化清洁验证第2页清洁验证定义清洗验证是用书面证据证实同意清洗规程能够对设备进行有效清洗，并使清洗后设备适合用于产品制造或包装，即设备内表面残留物及微生物指标到达清洁要求所要求标准。通常清洁验证应包含以下三个方面： 1、生产结束至开始清洁最长时间（也称待清洁时限）； 2、已清洁设备用于下次生产前最长存放时间（也称清洁效期）； 3、连续生产最长时间（阶段性生产

2、，大小清场）。Company Logo重组蛋白质药物纯化清洁验证第3页法规对清洁验证要求中国GMP要求（年版）第一百四十三条清洁方法应该经过验证，证实其清洁效果，以有效预防污染和交叉污染。清洁验证应该综合考虑设备使用情况、所使用清洁剂和消毒剂、取样方法和位置以及对应取样回收率、残留物性质和程度、残留物检验方法灵敏度等原因。Company Logo重组蛋白质药物纯化清洁验证第4页法规对清洁验证要求GMP附件 确认与验证第三十八条 为确认与产品直接接触设备清洁操作规程有效性，应该进行清洁验证。应该依据所包括物料，合理地确定活性物质残留、清洁剂和微生物污染程度标准。第三十九条 在清洁验证中，不能采取

3、重复清洗至清洁方法。目视检验是一个很主要标准，但通常不能作为单一可接收标准使用。第四十条 清洁验证次数应该依据风险评定确定，通常应该最少进行连续三次。清洁验证计划完成需要一定时间，验证过程中每个批次后清洁效果需及时进行确认。必要时，企业在清洁验证后应该对设备清洁效果进行连续确认。Company Logo重组蛋白质药物纯化清洁验证第5页法规对清洁验证要求GMP附件 确认与验证第四十一条 验证应该考虑清洁方法自动化程度。当采取自动化清洁方法时，应该对所用清洁设备设定正常操作范围进行验证；当使用人工清洁程序时，应该评定影响清洁效果各种原因，如操作人员、清洁规程详细程度（如淋洗时间等），对于人工操作而

4、言，假如明确了可变原因，在清洁验证过程中应该考虑对应最差条件。第四十二条 活性物质残留程度标准应该基于毒理试验数据或毒理学文件资料评定建立。如使用清洁剂，其去除方法及残留量应该进行确认。可接收标准应该考虑工艺设备链中多个设备潜在累积效应。第四十三条 应该在清洁验证过程中对潜在微生物污染进行评价，如需要，还应该评价细菌内毒素污染。应该考虑设备使用后至清洁前间隔时间以及设备清洁后保留时限对清洁验证影响。Company Logo重组蛋白质药物纯化清洁验证第6页法规对清洁验证要求GMP附件 确认与验证第四十四条 当采取阶段性生产组织方式时，应该综合考虑阶段性生产最长时间和最大批次数量，以作为清洁验证评

5、价依据。第四十五条 当采取最差条件产品方法进行清洁验证模式时，应该对最差条件产品选择依据进行评价，当生产线引入新产品时，需再次进行评价。如多用途设备没有单一最差条件产品时，最差条件确实定应该考虑产品毒性、允许日接触剂量和溶解度等。每个使用清洁方法都应该进行最差条件验证。在同一个工艺步骤中，使用多台同型设备生产，企业可在评定后选择有代表性设备进行清洁验证。第四十六条 清洁验证方案应该详细描述取样位置、所选取取样位置理由以及可接收标准。Company Logo重组蛋白质药物纯化清洁验证第7页法规对清洁验证要求GMP附件 确认与验证第四十七条 应该采取擦拭取样和（或）对清洁最终阶段淋洗液取样，或者依

6、据取样位置确定其它取样方法取样。擦拭用材料不应该对结果有影响。假如采取淋洗方法，应该在清洁程序最终淋洗时进行取样。企业应该评定取样方法有效性。第四十八条 对于处于研发阶段药品或不经常生产产品，可采取每批生产后确认清洁效果方式替换清洁验证。每批生产后清洁确认应该依据本附录相关要求进行。第四十九条 如无法采取清洁验证方式来评价设备清洁效果，则产品应该采取专用设备生产。Company Logo重组蛋白质药物纯化清洁验证第8页法规对清洁验证要求欧盟GMP要求 36.为确认清洁规程效力，应进行清洁验证。应依据所包括物料，合理确实认产品残留、清洁剂和微生物污染程度标准。这个程度标准应该是能够到达，能够证实

7、。 37.应使用经验证、检出灵敏度高检验方法来检测残留或污染物。每种分析方法或仪器检测灵敏度应足以检测出设定合格程度水平残留或污染物。 38.通常只有接触产品设备表面清洁规程需要验证。一些场所下，还应考虑不直接接触产品个别。应验证设备使用与清洁间隔时间，以及已清洁设备可保留时间，并经过验证确定清洁间隔时间和清洁方法。Company Logo重组蛋白质药物纯化清洁验证第9页法规对清洁验证要求欧盟GMP要求 39.对于相同产品和相同工艺而言，可从相同产品及工艺中，选择一个含有代表性产品和工艺进行清洁验证。可采取“最差条件”方法进行单独验证试验，在验证中应考虑关键原因。 40.为证实方法是经过验证，

8、通常应在3个连续批上使用该清洁规程，并检验合格。 41.清洁验证不应采取“不停测试，直至清洁”方式。 42.假如实际产品是有毒物质或有害物质，在清洁验证中，能够例外地采取物化特征相同无毒无害物质来模拟。Company Logo重组蛋白质药物纯化清洁验证第10页清洁验证前提厂房、设备、公用系统（水电汽等）经过验证（最少含IQ/OQ）。设备在运行确认中，已经过核黄素试验、风险评定或其它方法确认最难清洁部位。生产工艺流程已经确认。清洁规程已经确定，明确四个主要参数TACT，即清洗时间、清洗动作要求，清洗液浓度，清洗液温度。有完善操作说明书。相关统计已放到现场（操作统计、取样统计）。分析方法和检验仪器

9、经过验证。（专属性，灵敏度，精密度，线性范围，检验回收率）取样方法经过验证。取样回收率。对于极易溶于水残留，如作为清洁剂氢氧化钠，因为其溶度远低于其溶解度，可无须进行回收率研究。依据PDA TR49，清洁验证并不要求对生物负载与内毒素回收率进行研究。物料试剂经过检验合格。 操作人员经过培训，并取得对应资质。完成试验性工作。Company Logo重组蛋白质药物纯化清洁验证第11页设备分组设备分组能够筛选验证对象，降低无须要和无价值验证工作，使验证更有针对性。设备分组应考虑是否接触产品活性成份，是否多产品共用，设备是否重复使用，设备清洁方法（手工清洗、自动清洗），设备材质，设备结构，设备规格。设

10、备分组策略是基于设备应在设计和可清洁性上“相同”或“相同”，“相同”或“相同”理由，应在验证方案中给予清楚描述。Company Logo待清洁成份重组蛋白质药物纯化清洁验证第12页设备分组示例：直接接触产品活性成份，多品种共用设备。验证重点。能够选择最难清洁产品进行重点验证，其它产品进行简单确认。直接接触产品活性成份，品种专用设备。不接触产品活性成份设备，如接触缓冲溶液、辅料设备。一次性使用设备。该类设备不需要清洁验证。二次分组：按照设备材质、设备结构和清洗方法进行二次分组，对于材质、结构一致，且清洗方法一样设备，能够选择规格最大和规格最小设备进行验证，对于其余规格设备最好也进行一次简单确实认

11、。Company Logo重组蛋白质药物纯化清洁验证第13页设备分组依据风险分析结果，结合设备选型设计比对，将化学原因和物理原因进行成组比对，选择代表性组合进行验证，并使用最差条件进行模拟。Company Logo待清洁成份重组蛋白质药物纯化清洁验证第14页设备分组设备分组验证策略当设备相同时，能够设计一个检测矩阵，每次检测时抽取几个设备，累计完成此次全部项目标检测，共验证最少3次，验证结束后每台设备最少有1个项目被检测1次。只要给出充分理由说明设备项目是“相同”，就没有必要对该组中每个设备每个项目都验证一次。为了便于管理，也能够抽取其中3台设备，分别进行一次完整检测，其它设备各抽检一次，只抽

12、检个别项目。对于“相同”设备，要选取最差情况设备为代表，或者对设备进行归类。比如，在容积相同但结构不一样储液罐中，选择结构更复杂设备作为最差情况。在结构相同但容积不一样储液罐中，选择最大和最小（代表极端情形）来进行正式验证运行（除非某个容积能够认定为最差情况）。对该组中其它设备（不是最差情形）选择确认运行（最少一个批次）。待清洁成份重组蛋白质药物纯化清洁验证第15页待清洁成份在清洁验证中，为全部待清洁成份都制订程度标准并一一检测是不切实且没有必要。在一定意义上，清洁过程是个溶解过程，所以，通常做法是从各组分中确定最难清洁（溶解）物质，以此作为参考物质，或者依据待清洁成份共有特征，选择一个指标进

13、行确认。待清洁成份可分为活性成份、工艺相关杂质、辅料、清洁剂、微生物（来自物料、清洁过程、环境）。活性成份可能包含产品相关杂质，如聚合体，降解物等。不一样生产阶段可能含有不一样工艺相关杂质。比如发酵阶段含工程菌及细胞碎片等，在纯化阶段含细菌内毒素、菌体蛋白、外源DNA等。清洁剂最常见是氢氧化钠溶液，可能还有酸、表面活性剂等。Company Logo重组蛋白质药物纯化清洁验证第16页示例Company Logo待清洁成份分类代表性污物适用工艺设备下游和配制/分装污物含产品可溶性盐溶液，产品及工艺相关杂质 纯化设备浓缩和缓冲液置换设备包含产品和制剂组分溶液（比如辅料、表面活性剂） 配制设备最终无菌

14、过滤设备；产品灌装设备缓冲液制备污物 无产品盐水溶液 缓冲液配制设备缓冲液过滤和储存设备清洁剂污物含清洁剂包含表面活性剂酸和碱全部工艺设备重组蛋白质药物纯化清洁验证第17页待清洁成份最难参考物选择单组分产品：组份=参考物原料药直接分装各种成份普通标准最难参考物选择考虑原因清洁能力药品活性成份和辅料水溶性残留影响造成风险功效分类毒性如最难清洁物质非单一物质，则将一起作为最难清洁物质。Company Logo重组蛋白质药物纯化清洁验证第18页可接收程度清洁验证方案中最关键技术问题为怎样确定可接收程度。选择产物残留、清洁剂、微生物污染，以及其它任何工艺成份程度，逻辑上应该基于物料对生产流程和产品安全

15、性和纯度影响而定。可接收程度通常由企业自己确定。确定可接收程度应该含有“实用性、易获取性、可验证性”。对于不一样生产阶段，可接收程度能够有所区分，比如前期阶段，如发酵、纯化，因为后面还有纯化步骤，所以其清洁标准可适当放宽。计算设备内表面积不能只考虑单个设备，而应考虑产品生产过程中所接触整个设备链面积，过高预计设备表面积是保险做法。Company Logo重组蛋白质药物纯化清洁验证第19页可接收程度活性物质程度清洁剂程度微生物程度内毒素程度视觉清洁标准Company Logo重组蛋白质药物纯化清洁验证第20页可接收程度活性物质程度：10ppm：上批产品残留在设备里物质全部溶解到下批产品中浓度程度

16、不超出10ppm（百万分之十）。1ppm=1mg/kg=1mg/L=110-61/1000 MinTD：上批产品残留在下批产品活性成份不得高于最低日治疗剂量千分之一。Company Logo重组蛋白质药物纯化清洁验证第21页可接收程度活性物质程度纯化层析工艺含有选择性，残留活性蛋白难以在工艺步骤中逐步向下传递。在清洁剂作用下，残留活性蛋白也轻易被分解。所以用于制剂生产阶段MAC计算通常不适合用于原液生产。参考PDA TR49指南中要求，能够选择使用一些限制区域表面积计算残留量，比如使用最终一步纯化工艺后全部生产设备。依据相关清洁验证指南推荐，原液生产阶段，可接收标准通常为下游工艺TOC 1-2

17、ppm和上游工艺TOC 5-10ppm。对于如超滤膜和色谱填料这些产品专用材料能够更高。重组蛋白质药物纯化清洁验证第22页可接收程度MAC计算公式MAC：Maximum Allowable Carryover，最大允许残留量。MinTD：已清洁产品活性物质最小日治疗剂量。MBS：使用同一设备生产下一产品活性物质最小批量。MaxDD：使用同一设备生产下一产品活性物质最大日剂量。SF：安全因子。SF=1000。重组蛋白质药物纯化清洁验证第23页可接收程度TOC与蛋白值关系通常清洁验证采取TOC作为分析方法，TOC定量程度大约为100500ppb碳，与含碳量为50%约2001000ppb蛋白质数值等

18、效（基于生物制品）Company Logo重组蛋白质药物纯化清洁验证第24页可接收程度清洁剂程度：本公司清洁剂成份包含：NaOH、NaCl和水。其中NaCl和水是人体正常成份，毒性能够忽略。通常做法是用电导率值为其设定间接程度。氢氧化钠可接收水平建立在毒理学残留量计算或者是工艺参数效果之上。所以，程度是基于注射用水标准或者是稍高于这个标准（比如5 S/cm）。基于市售化学试剂毒性计算是比较极端，因为氢氧化钠并不会以氢氧化钠形式污染到最终产品中。假如这些化学物质以高浓度完整地污染下来，经过工艺检验（这么会引发PH显著改变）也会发觉这种不符合性。所以，目标并不要求与注射用水标准一致，而是确认一个很

19、低清洁剂含量。而允许电导率程度略高于注射用水程度原因是，注射用水程度要求只是适合用于管路中循环注射用水。一旦从循环管路中取出来并经过清洁设备（尤其是经过喷淋装置时它能够从空气中摄取二氧化塔），不要期望它一定会满足WFI电导率程度。Company Logo重组蛋白质药物纯化清洁验证第25页可接收程度清洁剂程度：阅毒理学数据库（http:，美国），NaOHLD50为40 mg/kg（mouse，ip.），含有较高安全阈值。假设NaOH对于人LD50和小鼠一致，按照成人体重为60kg计，则需要注射2.4g NaOH才能到达半致死剂量。检测清洁剂残留常见方法为电导率和pH。依据测试结果，25s/cm（

20、25）时NaOH浓度约为5.5g/ml。计算可得，pH为8（25）时，NaOH浓度为10-6mol/L（折合为0.04g/ml）。在电导率为25s/cm（25）或pH为8时，每支制剂产品中NaOH残留量最大为9.35g（rhG-CSF 480g/支装量为1.7ml/支），远低于半致死剂量千分之一。重组蛋白质药物纯化清洁验证第26页可接收程度微生物程度不要预期清洁过程会造成设备无菌结果。即使设备将进行在线灭菌或者是在下一产品生产前灭菌，通常做法是评定微生物负载来确保随即生产工艺不会被过分挑战。只要到达普通非无菌生产微生物程度标准（1-2CFU/cm2表面取样方法）就已经是足够。对于冲洗取样，一些

21、企业将利用经典WFI值（10 CFU/100毫升），而其它企业将利用100 CFU/100毫升或1,000 CFU/100毫升值。设定较高程度原因是随即设备将进行灭菌。制订方法下批产品原料及生产过程既不增加微生物繁殖，也不会降低微生物繁殖下批产品生产前设备在生产前不灭菌，但产品最终灭菌下批产品生产前设备在生产前需要灭菌Company Logo重组蛋白质药物纯化清洁验证第27页可接收程度微生物程度下批产品生产前设备在生产前不灭菌，但产品最终灭菌，其微生物程度设定方法以灭菌前微生物含量程度为基础进行计算产品无菌确保值大小与灭菌前工艺F0值以及灭菌前微生物含量相关，所以任何一个经过验证灭菌工艺都需要

22、确定允许灭菌前微生物程度，知晓这个程度后，后面计算与第一个情况就一致。Company Logo重组蛋白质药物纯化清洁验证第28页可接收程度内毒素程度在内毒素经各个去除步骤后，内毒素对最终产品残留量是更值得关注。内毒素通常只在最终冲洗水测定，程度设定通常是注射用水标准0.25EU/ml。对于用大肠杆菌进行细菌发酵（革兰氏阴性细菌，在冲洗过程中能够生产大量内毒素），在发酵和收获步骤后清洗符合注射用水程度，是不可能完成，这种情形下，其它企业在更高水平设置内毒素程度，比如5-25 EU/ml。Company Logo重组蛋白质药物纯化清洁验证第29页可接收程度视觉清洁标准：不得有可见残留物。依据经验数

23、据，目检能发觉最低残留物程度是1g/ cm2。视觉检验是核实残留物去除一个直接衡量伎俩，很轻易完成。做到每个样品都检。 设备表面无可见残留物检验要包含两个个别 终洗水或淋洗水无可见残留物Company Logo重组蛋白质药物纯化清洁验证第30页取样方法取样方法应依据设备类型、被取样点材料、设备构型等综合考虑。必要时可采取几个不一样取样方法，使样品含有更加好代表性。取样方法应是实用，易培训，不然清洁状态难以监控。取样方法:直接取样法（目检）、冲洗取样、擦拭取样、空白模拟取样。Company LogoGM重组蛋白质药物纯化清洁验证第31页取样方法擦拭取样含有机械力，能够取到难溶性残留，能够分析特殊

24、区域、难清洁区域，但有些区域无法进行取样。应详细要求擦拭溶剂和药签，药签湿润程度，擦拭力度、角度、路线、擦拭面积等。最终冲洗水取样要求待测残留物含有良好溶解性，适合用于大面积，无法直接取样或不能拆卸设备。取样应要求冲洗方式和冲洗量，确保残留物能够溶解到冲洗水中，而且要防止大量冲洗水稀释残留污染物。另外，小部件还能够拆卸后浸入浸提液取样。Company LogoGM重组蛋白质药物纯化清洁验证第32页擦拭取样TOC擦拭采样取样前首先目测，确保无可见残留物。选定所要擦拭表面积。将擦拭子润湿，然后按在取样表面上，用力将其稍微弯曲，使棉签整个平面接触擦拭表面，平稳而迟缓擦拭取样表面，详细擦拭方法见下列图

25、。取样方法每个取样部位每次采样用1根TOC专用棉签擦拭。擦拭完成后，将TOC专用药签折断，放入40ml TOC专用瓶内，把盖子密封好，进行编号。重组蛋白质药物纯化清洁验证第33页最终冲洗水取样测外观、电导、pH取样要求用透明洁净玻璃瓶取样150ml（每项50ml），取样前玻璃瓶用注射用水荡洗3遍。测TOC水样取样要求用TOC专用取样瓶装满样品，取样瓶在取样前先用注射用水荡洗3遍。检微生物取样要求用无菌50ml离心管取样50ml，取样后离心管应用封口膜密封。测细菌内毒素取样要求用无菌无热源注射器或离心管取样5ml，取样后离心管应用封口膜密封蛋白残留量洁净1.5ml EP管取1ml，取样后EP管应

26、用封口膜密封。取样方法重组蛋白质药物纯化清洁验证第34页最终冲洗水取样层析柱终洗水取样要求检外观、电导、pH、细菌内毒素、微生物、蛋白残留量项目标取样要求同上。应注意层析柱流出管道应垂直悬空，必要时，取样前管道先用消毒酒精擦拭，排掉个别流出液后取中段样。层析柱空白样取样要求检外观项目用透明洁净玻璃瓶取50ml；检蛋白残留量/宿主菌蛋白质/外源性DNA残留量用无菌无热源离心管取5ml；检内毒素用无菌无热源离心管取5ml；微生物项目用无菌离心管取50ml ，取样后离心管用封口膜密封。Company Logo取样方法重组蛋白质药物纯化清洁验证第35页空白模拟取样在生物制药中，空白模拟取样普通仅包含注

27、射用水或不含产品工艺缓冲溶液。在此取样过程中，设备是清洁。清洁后，只使用注射用水或缓冲液运行生产流程（尽最大可能）。运行后，像任何其它清洁验证样品一样，对注射用水或缓冲液进行评价，项目通常包含TOC(或总蛋白)、电导率、生物负载和内毒素，分析所制造产品残留物是否成为任何可能污物。在原液和制剂生产中都能够进行空白模拟运行，以论证工艺材料实际污染量。Company Logo取样方法重组蛋白质药物纯化清洁验证第36页取样点选择选取取样点应考虑设备最难清洗部位、关键部位、最有代表性部位、结构材料不一样部位、取样点方便性和重现性、设备总尺寸。对于擦拭取样，通常不可能擦拭设备全部表面，所以，应该选择设备最

28、差区域作为取样点。这些区域应在清洁难度和残留水平方面代表着对清洁规程最大程度挑战，比如：人孔、料斗底部、桨拌桨叶底部和阀门周围。假如进行微生物取样，取样计划应包含微生物可能最差区域，比如：较难靠近地方以及可搜集水排水区域。微生物和化学取样应在不一样区域进行，测试方案中应包含设备及其取样点描述或图表。对于最终冲洗水取样，取样时要从设备专用取样口或者产品出料口取样。Company Logo重组蛋白质药物纯化清洁验证第37页检验方法特异性：活性成份色谱分析：HPLC,GC,高效薄层色谱（HPTLC）是非常灵敏和有效。ELISA：对于生物药非常有效，不过昂贵、费劲。电泳：灵敏度较低非特异性UV光谱：有适度特异性，不需要定量检测。TOC:针对通用污染物或总蛋白。总有机碳分析仪是非常灵敏，但不是特定。应该和pH与电导率一起使用。pH：请氢离子非常敏感。用于清洁程序中酸和碱追踪。电导率：对全部离子敏感。（当TOC、pH和电导率联合使用时，在清洁验证分析方法中被证实是非常有效。）内毒素及微生物Company Logo重组蛋白质药物纯化清洁验证第38页特殊设备清洁验证特殊设备清洁验证层析柱层析填料结