临床生物化学：第23章 临床酶学检验的原理和方法

1、第二十三章 临床酶学检验的原理和方法第2页教学目标与要求 掌握定时法和连续监测法的概念和特点；酶活性测定最适条件及其确定；影响酶活性测定的主要方法因素。 熟悉酶活性测定的意义；定时法和连续监测法酶活性浓度的计算；最适底物的选择和浓度确定。 了解酶促反应进程曲线；影响酶活性测定各因素的作用机制；测定酶活性的校准物和计算K值；同工酶测定方法和意义。第3页主要内容 酶活性测定的理论基础 酶活性的影响因素和最适条件 影响酶活性测定的方法因素 同工酶检测技术第4页基本特点1.项目多，应用广基本方法临床酶学检验2.含量少，难度大3.高灵敏度4.高特异度1.活性测定法,广泛应用2.质量测定法，准确，难度大，

2、少用第5页酶促反应进程一 二 三第一节 酶活性测定的理论基础定时法（Fixed time assay） 连续监测法（Continuous monitoring assay）第6页一、酶促反应进程 酶促反应动力学参数1.初速度(initial velocity)指在反应最初阶段底物的消耗量很小（一般在5以内）时的反应速度，用v0来表示2.最大反应速度(maximum velocity)指当酶的结合位点与底物结合饱和时的反应速度，通常用V或Vmax来表示 3.米氏常数（Michaelis constant，Km）指酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位同底物浓度酶活性国际单位：规定每升样

3、品中每分钟生成1微摩尔为一个酶活性国际单位即1U/L。第7页酶促反应时间进程曲线：酶促反应体系中，底物和产物浓度随着反应的进行时刻变化，以产物或底物浓度变化量对时间作图所得曲线即为酶促反应时间进程曲线。分为三个时期。第8页延滞期：酶促反应初始期，底物减少产物增加均较缓慢，即反应速率较小。几秒到几分钟，要尽量缩短该期。多种因素影响造成： 单一酶促反应：酶催化位点暴露、底物解离与酶结合、酶与辅酶结合、酶的激活等。 酶偶联反应：中间产物堆积、指示反应速率达到平衡等。1-3min。第9页线性期：延滞期后，底物过量时酶促反应速率达到最大反应速率并保持相对恒定的一段时期，在时间进程曲线中呈直线或接近直线。

4、 产物和底物的变化与时间成比例，可反映酶活性大小。一般认为底物消耗小于5%时仍处于线性期，实际需根据曲线来确定。酶浓度越高，线性期越短。第10页非线性期：底物耗尽期，线性期后反应速率明显下降酶促反应进程曲线偏离直线的一段时期。 因素：底物减少产物增加逆反应增加、产物的抑制作用、酶失活等。 一定尽量保证在酶促反应的线性期进行检测。 酶促反应进程曲线 如将酶反应过程中测得的产物P或底物S变化量对时间作图，可得酶促反应时间进程曲线。图中产物P或底物S变化曲线的斜率就代表酶促反应的速率。延滞期线性反应期底物耗尽期必须根据线性反应期的反应速率才能准确计算出酶活性浓度。 第12页延滞期lag phase线

5、性linear phase非线性期non-linear phase酶促反应时间进程分期第13页 IFCC推荐法测定ALT的时间进程曲线第14页二、定时法 酶活性浓度测定方法按反应时间分类：定时法和连续监测法按检测方法分类：量气法、分光光度法、荧光法、 放射性核素法、离子选择电极法，旋光法、极谱法、HPLC或生物发光法等。按检测方法分类底物或产物浓度的检测 测定项目方法原理测定手段胆碱酯酶氯化乙酰胆碱做底物产生乙酸根电位滴定法脂肪酶三油酸甘油酯悬乳液做底物，生成油酸甘油一酯，浊度下降浊度法淀粉酶淀粉做底物，一定时间后，剩余的淀粉不足以使碘呈兰色时间滴定法丙氨酸氨基转移酶赖氏法比色法丙氨酸氨基转移

6、酶IFCC推荐法分光光度法丙氨酸氨基转移酶固定化谷氨酸氧化酶膜生成过氧化氢，利用过氧化氢电极生物传感器N-乙酰-氨基葡萄糖苷酶4-甲基伞形酮N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷做底物荧光葡萄糖6磷酸脱氢酶NADPH在365nm激发下产生荧光荧光第16页（一）概念 将酶与底物在特定条件（缓冲液、温度等）下孵育，经过一定时间后，用终止液终止反应，通过化学或生物化学的方法测出底物或产物的总变化量，除以时间即可计算出底物消耗速度（dS/min）或产物生成速度（dP/min），将速度换算为mol/ min再除以体积便是以国际单位表示的酶活性。又名终点法、两点法等。第17页主要优点 设备简单，操作方便，检测过程中无

7、需恒温设备，用分光光度计即可测定，也不用考虑显色剂对酶活性的影响，是早期常用方法。主要缺点 难以确定选定的反应时间是否处于线性期。延滞期难确定，很短，影响不大，有时可忽略。非线性期影响明显，一定要注意。（二）特点第18页（三）计算 标准比较法、标准曲线法、吸光系数法计算酶活性。标准法即同时测定标准品与样品的吸光度变化，根据标准品的已知某物质浓度计算样品酶活性。酶标准品较难，以产物或底物代替，不够精确。现多用吸光系数法。摩尔吸收系数：特定条件下一定波长光径为1厘米时通过该物质浓度为1mol/L溶液时的吸光度。第19页（三）计算 定时法无机P酚氨萘胺NAD(P)HH2O2丙酮酸淀粉ALT、AST、

8、LDALP、ACP、5NTALP、ACPADA、脲酶CK、GGTLD、GLD、G6PDALTAMS（四）方法设计显色物项目第21页（一）概念 将酶与底物在特定条件（缓冲液、温度等）下孵育，每隔一定时间（2s60s）连续测定酶促反应过程中某一底物或产物的特征信号的变化，从而计算出每分钟的信号变化速率。又叫速率法。三、连续监测法第22页第23页主要优点 勿须终止酶促反应，不需添加其他显色试剂，就可直接测定反应物的变化，可以明确找到反应的线性期，结果准确可靠，标本和试剂用量少，可在短时间内完成测定。主要缺点 在特定条件下进行，要求精确地控制温度、pH值和底物浓度等反应条件，对仪器要求较高，需要具有恒

9、温装置和连续记录吸光度装置。（二）特点第24页目前最常用的方法，更适用于自动生化仪，能够判断是否偏离线性，结果更准确，尤其高浓度标本时。酶几乎都有两种方法，应优先选择连续监测法。第25页（三）计算第26页（四）方法设计直接连续监测法：直接测定反应体系中待测酶的底物或产物某些理化特性计算酶活性，如吸光度、荧光、旋光性、PH、电导率等。简单，适用少，理化特性有明显差异才可以，如LDH。间接法：一步间接法和偶联法。前者在体系中加入不影响酶促反应的试剂，与产物生成可检测物质。偶联法则在体系再加入其他酶试剂，与待测酶的反应偶联，生成可检测的物质，推算待测酶的活性。包括待测酶的始发反应和指示酶的指示反应，

10、可能需要辅助酶，与指示酶统称工具酶。第27页间接连续监测法色素原底物NAD(P)H系统过氧化物酶系统其他ALP、AMY、GGT、GPDA、AFU、NAGLD、G6PD、HBDH、GDH、ALT、AST、CK 、ADALPS、ADA、 5-NTCHE、ACP（四）方法设计第28页定时法连续监测法测总变化量，平均速度测速率终止酶促反应酶促反应一直进行多用化学方法检测多用酶偶联反应定时法与连续监测法的区别含延滞期或非线性期只计算线性期速度第29页酶活性测定最适条件一 二 三第二节 酶活性测定的影响因素和最适条件酶活性测定的影响因素 最适条件的确定第30页一、酶活性测定最适条件最适条件（optimum

11、 condition）：是指能满足酶发挥最大催化效率所需的条件。酶促反应的最大速度与酶的催化活性成正比例，只有当反应速度为最大反应速度时V才与酶量E成正比例。只有在最适条件下的测定方法才是可靠的、准确的。第31页主要包括：1.底物种类和底物浓度2.缓冲液种类和离子强度、pH3.反应温度4.辅因子、激活剂浓度，指示酶和辅助酶的类型和用量5.测定时间，延滞期应尽量短暂并有足够的线性期二、酶活性测定的影响因素SPEt酶测定方法反应时间10 20 Km缓冲液v = Pt抑制剂底物温度激活剂第33页（一）底物的确定底物类型选择的原则是：选择Km最小的底物要有足够的溶解度考虑酶的特异性底物稳定性好较高临床

12、价值的底物：如ACP以麝香草酚磷酸盐为底物。三、最适条件的确定第34页单底物酶促反应：选择S10Km20Km，此时反应速度达到最大反应速度90.9% 95.2% ，误差可接受。双底物酶促反应：根据动力学方程，A/B之间的关系是一条双曲线，有无数组数据。采取最经济原则：结合价格溶解度等因素，先确定其一，再求其二。F一般选90%或95%，K可认为是常数1.底物浓度确定的方法第35页（二）缓冲液的确定缓冲液种类的选择原则：尽量使用活性或惰性缓冲液 接近最适PH，有足够的缓冲容量和能力 纯度高，不含有抑制酶活性的杂质 温度依从性小 对酶有稳定和促进作用更好 第36页缓冲液离子强度的确定：离子强度越高，

13、电解质干扰酶和底物结合，酶活性将逐步下降，选择接近体液的离子强度。大多数酶活性测定的离子强度在0.1mmol/L左右 ALP用AMP缓冲液，离子强度达到0.9mmol/L，有磷酸基团接受体作用GGT用高浓度的双甘肽有酰基接受体作用第37页第38页常用的缓冲液：N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPES）N，N-双（2-乙磺酸）哌嗪（PIPES）三羟甲基氨基甲烷（Tris）二乙醇胺（DEA）三乙醇胺（TRA）2-甲基-2-氨基-1丙醇（AMP） 第39页在1986年以前IFCC推荐酶活性测定的温度是30 2002年IFCC正式发表了“37下检测酶催化活性浓度的IFCC一级参考方法操作手册和参

14、考制品认可系统”目前基本无异议，确定37为酶活性测定温度（三）反应温度的确定第40页（四）辅助因子的确定脱辅基酶的酶活性恢复加入辅基预孵育 EDTA络合重金属离子巯基酶需巯基试剂做激活剂反复实验法确定用量第41页（五）反应时间的确定延滞期的确定原则是多观察几例浓度不等、病理情况不同的标本，选择延滞期最长者作为确定值。线性期的确定 线性期的确定与酶浓度的可测上限与非线性度有关。 计算非线性度，按最小二乘法的计算要求。一般要求读数次数应不少于4次，读数间隔30 s，故线性期在2min以上即可。第42页（六）抑制剂可逆和不可逆抑制，尽量去除：高纯度用品和水，器材干净，金属螯合剂，副反应去除产物的抑制

15、等第43页（七）偶联法中的指示酶和辅助酶种类选择：特异性高，尤其指示酶，减少副反应，避免假性偏高。辅助酶少，缩短延滞期。能不用则不用。尽量选Km小的工具酶，缩短延滞期。最适条件与待测酶接近。其他 稳定性纯度价格来源等第44页浓度确定：量不足延滞期延长，可测范围变窄；过量则增加成本，杂酶干扰多。反复试验确定合适用量。第45页基本方法因素的影响一 二 三第三节 方法因素对酶活性测定的影响检测系统的影响 其他因素的影响一、基本方法因素的影响电位滴定法浊度法时间滴定法比色法分光光度法生物传感器荧光按监测手段各类终点法LPSNAD(P)HAMYCHENAD(P)HALT（一）方法分类第47页终点法测产物

16、测底物连续监测法按监测对象按监测速度方式样品启动逆向正向底物启动按反应方向按启动类型第48页首选连续监测法：选择线性期的反应速率计算酶活性，结果可靠，不需样品空白，干扰小。对仪器要求高，有时定时法也可得到准确的结果如碱性磷酸酶。正向和逆向反应：选择底物亲和力大酶催化效率高的方向，综合干扰、价格、稳定性等因素。如CK普遍采用逆反应。第49页 （二）检测方式原则：方便性。一般应选择产物。1、产物生成类：根据产物生成量与酶活性、酶量、反应时间成正比例的关系，从无到有，从少到多进行测定，检测敏感度高。2、底物消耗类：测定底物，从多到少，而底物消耗不明显，测定误差大，检测范围窄。如碘淀粉比色法。第50页

17、 （三）启动模式 指反应所需的试剂先混合在一起，然后加入样品，依靠样品中的待测酶来启动酶促反应，只在延滞期去除部分干扰物，抗干扰能力等同单一试剂剂型，需要注意的是某些双试剂剂型是基于试剂稳定性考虑，并没有单独将底物作为第二试剂，也起不到消除内源性干扰的作用。 样品启动模式 第51页 指样品先与部分试剂（缺乏某个底物）预孵育一定时间，部分消除某些内源性、外源性干扰物以及杂酶的副反应，然后加入这个底物，启动待测酶酶促反应。需要双试剂剂型，IFCC推荐法多采用底物启动模式。底物启动模式 第52页（四）消除副反应：NAD（P）H系统使用最多，有内源性干扰产生副反应，应消除。副反应抑制剂、样品预处理等。

18、第53页二、检测系统的影响 不同的仪器，波长的设置有区别，带宽有区别，比色杯的透光性在使用过程中也会发生改变，这些都直接影响仪器对待测物的摩尔吸光系数，也就影响K值的准确性。因此，要定期检查仪器的摩尔吸光系数，校正K值。 （一）检测仪器第54页 产物的基准物质：如对硝基酚、对硝基苯胺等，可用于校准仪器的摩尔吸光系数。产物NAD（P）H的摩尔吸光系数可以用己糖激酶法测定葡萄糖来校正。 酶校准物：多是用人血清或动物血清作介质，与测定标本比较接近。尽量采用。 （二）校准物第55页（三）实验参数 一般参数：1.项目名称；2.方法类别；3.试剂类别；4.试剂位置；5.标本位置；6.冲洗次数 技术参数：1

19、.方法类型；2.波长选择；3.样品用量4.试剂用量5.稀释水量；6.试剂吸光度上下限；7.空白速率 时间参数：1.孵育时间；2.延迟时间；3.监测时间；4.底物耗尽时间 质控参数：1.参考值范围；2.线性范围；3.计算因子F值 第56页样品与试剂比例：与检测灵敏度和检测上限、测定误差有关。通过理论与实验数据获得，勿随意更改。第57页按照理化性质不同进行分离鉴定一 二第四节 同工酶检测技术按照其他性质不同进行鉴定第58页同一种属中由不同基因或等位基因编码的多肽链单体、纯聚体或杂化体，具有相同的催化作用，但其分子构成、空间构像、理化性质、生物学性质以及器官分布或细胞内定位不同的一组酶称为同工酶（i

20、soezyme）。凡酶蛋白一级结构不同的同工酶称为原级同工酶，而将经加工或修饰后的同工酶称为次级同工酶或酶多种形式。某些同工酶从组织进入体液后在蛋白酶作用下降解成不同的亚型（isoform）。 同工酶及亚型的概念第59页 电泳法由于各型同工酶的一级结构或空间构象不同，形状不同，带电性质也不同，在电场中的电泳迁移率不同，使各型同工酶分离,然后用酶催化性质选择合适的显色系统使区带呈色。评价：优点是可获得同工酶谱的全貌；简单分离效果好，科研应用广。 缺点是其显色系统不可能是所有同工酶的最适条件，而且定量也比较困难；速度慢，标本数不灵活，限制了临床应用。按照理化性质不同进行分离鉴定一第60页第61页蛋白质同工酶支持物准备、平衡、加样、电泳固定后染色蛋白质染料不固定酶促反应产物显色扫描定量扫描定量电泳法测定同工酶与蛋白质区别支持物准备、平衡、加样、电泳第62页按照其他性质不同进行鉴定二抑制法原理：免疫抑制法原理是利