凋亡检测实验

1、凋亡检测实验第1页，共24页，2022年，5月20日，8点54分，星期一主 要 内 容凋亡概述凋亡检测方法的历史沿革DNA Ladder 实验 实验原理 实验材料及试剂 实验步骤及结果第2页，共24页，2022年，5月20日，8点54分，星期一 Apoptosis Necrosis Apoptosis (Kerr and Wyllie, 1972)第3页，共24页，2022年，5月20日，8点54分，星期一 Apoptosis A genetically programmed , non-necrotic cell death.Involved in tissue homeostasis, c

2、ell differentiation.Play major role in a variety of diseases(e.g. Alzheimer , AIDS , heart failure and cancer).第4页，共24页，2022年，5月20日，8点54分，星期一 凋亡与坏死的差别第5页，共24页，2022年，5月20日，8点54分，星期一 凋亡 坏死胞体 变小 变大胞膜 皱缩, 形成空泡 肿胀, 通透性改变结局 形成凋亡小体被邻近细胞吞噬细胞 崩解, 引起炎症反应胞核 涉及多个细胞, 组织结 构被破坏浓缩, DNA断裂成180200bp或其倍数的片段与其他细胞关系 不规则碎

3、裂, 溶解通常只影响散在单个细胞, 组织结构不被破坏第6页，共24页，2022年，5月20日，8点54分，星期一Apoptotic AssayMorphology DNA Fragmentation DNA LadderCaspase Activity Anti-PARP western blotCell Membrane Alteration Phosphotidylserine Exposure第7页，共24页，2022年，5月20日，8点54分，星期一第8页，共24页，2022年，5月20日，8点54分，星期一第9页，共24页，2022年，5月20日，8点54分，星期一第10页，共24页

4、，2022年，5月20日，8点54分，星期一第11页，共24页，2022年，5月20日，8点54分，星期一Apoptotic AssayMorphologyDNA Fragmentation DNA Ladder Caspase Activity Anti-PARP Western blotCell Membrane Alteration Phosphotidylserine Exposure第12页，共24页，2022年，5月20日，8点54分，星期一endonucleaseGel electrophoresis700520360180Base pairsDistance between c

5、uts = mutiple of 180 bps180 bps第13页，共24页，2022年，5月20日，8点54分，星期一Apoptotic DNA LadderLane 1: MarkerLane 2: negative controlLane 3: DNA of apoptotic cellsLane 4: DNA of necrosis cells金标准第14页，共24页，2022年，5月20日，8点54分，星期一实验原理 细胞凋亡过程中,可发生特异性级联生化反应,其中最具特色的是内源性核酸内切酶的激活. 此酶可作用于连接DNA的核小体间区域, DNA链被切割成180200bp或其整倍

6、数的片断. 抽提DNA, 经琼脂糖电泳可见梯状电泳图谱 第15页，共24页，2022年，5月20日，8点54分，星期一 固定： 将细胞生前结构和化学物质双重地保存下来，需要先固定。方法：1）物理固定，空气干燥， 冻结干燥。2）化学固定，如甲醇，乙醇，丙酮，甲醛等。 第16页，共24页，2022年，5月20日，8点54分，星期一实验步骤 获取凋亡细胞 抽提DNA 琼脂糖凝胶电泳第17页，共24页，2022年，5月20日，8点54分，星期一实验步骤 取16g大小的小白鼠, 外科手术取胸腺 少许洗去血迹 放入研磨器中(160目)研磨, 边磨边加1640液, 获取单个胸腺细胞.将所得混悬液倒入三角烧杯

7、, 加入120ml 1640液(一般一只小白鼠可获2x106/ml 细胞) 第18页，共24页，2022年，5月20日，8点54分，星期一每孔加入1.2ml DEX(5mg/ml)混匀, co2培养箱, 370c, 5h 取1ml混悬液, 加入24孔培养板中 将每孔细胞悬液转移至新的Ep管中, 3000rpm, 5min, 去上清, 加入70%乙醇700ml混匀.震荡打散细胞,-200c固定过夜 第19页，共24页，2022年，5月20日，8点54分，星期一 离心， 3000rpm， 5min, 去上清（不要回倒， 棉棒沾干液体，勿触及沉淀） 将上清转入1.5ml EP管，离心12000rpm

8、 3min加400ul裂解液，加100ul蛋白酶k, 混匀， 600c水浴，30-45min 100ul饱和Nacl, 充分震荡，离心12000rpm 3min第20页，共24页，2022年，5月20日，8点54分，星期一将上清转入无水乙醇管，颠倒离心管数次可见白色絮状物（DNA）离心12,000 rpm，1min，弃上清，并用棉签吸干残留的无水乙醇 析出的DNA应成小白点状沉淀于管底，如贴附于管壁，加溶解液时应小心。第21页，共24页，2022年，5月20日，8点54分，星期一取凝胶到凝胶成像仪上拍照分析加入20ul溶解液至管中，反复吸打数次至DNA溶解 电泳80v,1h 吸出20ul已溶解的凋亡细胞DNA，加入到2%琼脂糖凝胶孔电泳第22页，共24页，2022年，5月20日，8点54分，星期一1. 取出胸腺后, 一定要注意将组织去除干净。2. 样本须先经70%乙醇固定,以防止DNA降解。3. 70%乙醇, 无水乙醇应-200c预冷。4氯仿抽提蛋白时，应用振荡器剧烈振荡，吸移上清时，注