分泌蛋白的追踪

1、分泌蛋白的追踪第1页，共14页，2022年，5月20日，10点58分，星期一目录一.研究背景二.实验过程三.讨论第2页，共14页，2022年，5月20日，10点58分，星期一1 9 4 5年 ， 克 劳 德 和 泡特 ( Ke i t h Ro b e r t s P o r t e r ， 1 9 1 2 1 9 9 7 )发 表 了培 养 细 胞 的 第 一 张 电 子 显 微 镜照 片 ， 首 次 发 现 了 一 些 新 的 细 胞 亚 显 微结 构一 线 粒 体 和 内质 网 ， 这 次 重 大 突破 开启 了 现 代 细 胞 生 物 学 的 一 扇 大 门 ，为 随 后 全 面 深

2、入 研 究 细 胞 精 细 结 构 奠定 了基 础 。帕 拉 德 对 细 胞 电子 显 微 镜 研 究 的 一 项 重 大 贡 献 是 改 进了细 胞 固 定 技 术 。当 时 锇 酸 ( O s 0 4 ) 由于 可 快 速 高 效 保 持 培 养 细 胞 内 部 的 精细 结 构 而 被 广 泛 应 用 于 电 子 显 微 镜 研究 ， 但 锇 酸 对 生 物 组 织 内 的细 胞 研 究 却存 在 很 大 困 难 。帕 拉 德 认 为 这 是 由 于锇 酸 酸性 难 以控 制 的 原 因 ， 因此 引 入 缓冲液 方 法 以 保 证 相 对 稳 定 的 p H， 这 种改进 使 组 织

3、细 胞 结 构 研 究 成 为 可 能 ， 这种 固 定 液 也 被 称 为 帕 拉 德 固 定 液 5 。帕拉 德 还 对 电子 显 微 镜 研 究 的 其 他 方面进 行 了 革新 ， 如 塑 料 包 埋 材 料 的 应 用和超 薄 切 片 技 术 的 完 善 ， 这 使 2 O世 纪5 O 年 代 早 期 细 胞 电 子 显 微 镜 照 片 清 晰度 得 到 极 大 提 高 ， 从 而 发 现 了 更 多 的 细胞 内细 节 。第3页，共14页，2022年，5月20日，10点58分，星期一将细胞与放射性标记的合成底物(属于某些途径或大分子)一起培养，则标记结果将在下一步与非标记底物共培养

4、中延续.脉冲标记实验：用放射性同位素标记的前体化合物对细胞或个体进行短时间的标记，以研究代谢合成动态的生物技术。 放射自显影术（radioautography；autoradiography）用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。其原理是将放射性同位素（如14C和3H）标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，将标本制成切片或涂片，涂上卤化银乳胶，经一定时间的放射性曝光，组织中的放射性即可使乳胶感光。然后经过显影、定影处理显示还原的黑色银颗粒，即可得知标本中标记物的准确位置和数量，放射自显影的切片还可再用染料染色，这样便可在显微镜下对标

5、记上放射性的化合物进行定位或相对定量测定。 第4页，共14页，2022年，5月20日，10点58分，星期一研究背景除了合成蛋白质来行使细胞功能，许多细胞还必须产生和分泌其他蛋白到细胞外履行职责。蛋白分泌的机制迷住了许多细胞生物学家，包括帕拉德。在分泌的研究的早期，细胞被破坏，各种细胞器被离心分离。这些细胞分级分离的研究表明，分泌的蛋白是存在于与内质网（ER）相关联的膜结合的囊泡细胞和质膜，在那里它们被合成，并被最终从释放. 为了进一步阐明的途径，帕拉德转向了新开发的技术，高分辨率放射自显影，放射性标记的蛋白质在细胞内移动时, 使他可以跟踪它们。他的工作产生深远意义的发现是该分泌蛋白在囊泡内的移

6、动是从ER到高尔基复合体，然后到质膜。第5页，共14页，2022年，5月20日，10点58分，星期一帕 拉 德 由于 对 现 代 细 胞 生 物 学 诞生 和发 展做 出 了 许 多 奠 基 性 贡 献 而 被生 物学 界誉 为 “ 现 代 细胞 生 物 学 之 父 ”第6页，共14页，2022年，5月20日，10点58分，星期一帕拉德想要确定哪些细胞结构和细胞器参与蛋白质的分泌？1.给豚鼠注射3H亮氨酸 2.从4分钟到15小时的时间点，将动物处死，并且固定胰腺组织.（ 因 为 帕拉 德 发 现该 器 官 拥 有 大 量 分泌 细 胞 ， 这些 分 泌 细胞 存 在 大 量 粗 糙 内质 网

7、， 并 且 还 发 现 胰 腺 分 泌 细胞 中 的 酶原 颗 粒 可 作 为 消 化 酶 的 暂 时 储 存 位 点 。 第7页，共14页，2022年，5月20日，10点58分，星期一为了彻底解决这一细胞器的蛋白分泌的作用 ?（为 了 阐 明 蛋 白分 泌 过 程 ， 帕 拉 德 再 一 次在技 术 上 做 出 了 重 大 革 新 他 改 进了适 合 蛋 白质 研 究 的 细 胞 内 同 位 素 示踪 体 系 ， 同时 还 发 展 了放 射 自显 影 的 电子显 微 镜 方 法 ）体外脉冲追踪实验 细胞暴露于放射性标记的前体 .这种情况下,H3亮氨酸,短时间内被称为“脉冲”。 随后的“追”的

8、时期,放射性前体用未标记的形式取代.1.通过削减豚鼠胰腺切成厚片，2.将其培养含有3H亮氨酸的媒体中3分钟。 3.加入过量未标记的亮氨酸(在脉冲结束时 )。4.组织切片5.然后固定为放射自显影或用于细胞分离 第8页，共14页，2022年，5月20日，10点58分，星期一电子显微镜放射自显影所揭示的是豚鼠胰腺分泌蛋白的合成和移动。（a）在一个3分钟的时间标记与3 H亮氨酸结束时，组织被固定，切片电子显微镜，并进行放射自显影。大多数标记的蛋白质（放射自显影颗粒）是在粗糙的急诊室。 （二）经过7分钟的追逐与内未标记的亮氨酸，大多数标记的蛋白质已经转移到高尔基体囊泡。 （三）有37分钟的追逐后，大部分

9、的蛋白质是在不成熟的分泌囊泡。 （四）一个117分钟的追逐后，大部分蛋白质是在成熟的酶原颗粒。第9页，共14页，2022年，5月20日，10点58分，星期一第10页，共14页，2022年，5月20日，10点58分，星期一技 术 上 的 改 进 使 研 究进 程 大 大 加 快 ， 帕 拉 德 和 同 事 首 先 为 哺乳 动 物 注 射 放 射 性 同位 素 标 记 的 氨 基 酸 ( H 标 记 亮 氨 酸 ) ， 然 后 分 离 亚 细 胞成 分 ， 以 观察 新 合 成 的 带 有 放 射 性 标 记的蛋 白质 动 力 学 特 征 。借 助 这 些 方 法 ，帕 拉 德 最 终 发 现

10、分 泌 蛋 白 首 先 在 粗 面内质 网 表 面 的 核 糖 体 上 合 成 ， 随 后 被 运 输 到 高 尔 基 体 ， 在 这 里 合 成 的 多 肽链 折叠 成 为 适 宜 分 泌 的 蛋 白结 构 ， 最 后 进 入分 泌 囊 泡第11页，共14页，2022年，5月20日，10点58分，星期一为了确保他的结果是蛋白分泌在体内的准确反映，帕拉德精心设计系统 ?用3H亮氨酸脉冲标记组织切片3分钟 用未标记的亮氨酸追逐的标签7，17，37，57，和117分钟.第12页，共14页，2022年，5月20日，10点58分，星期一拉德的实验给了生物学家首先明确一下蛋白质通过分泌途径移动。他对胰腺外分泌细胞的研究结果产生了两个开创性的看法。1.该分泌蛋白穿过他们的方式进出细胞的高尔基复合体2.分泌蛋白它们在整个通路分隔成囊泡 帕拉德的