培养基制备实验原理及步骤

1、实验三 培养基制备实验目的：了解培养基的制备原理并掌握其制备过程。实验原理：培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。由于各种微生物所需要的营养不同，所以培养基的种类很多。可以根据微生物种类和实验目的不同分成若干类型。培养基的类别如下：1.按照培养基的成分来分培养基按其所含成分，可分为合成培养基、天然培养基和半合成培养基三类。 (1)合成培养基。合成培养基的各种成分完全是已知的各种化学物质。这种培养基的化学成分清楚，组成成分精确，重复性强，但价格较贵，而且微生物在这类培养基中生长较慢。如高氏一号合成培养基、察氏培养基等。

2、(2)天然培养基。由天然物质制成，如蒸熟的马铃薯和普通牛肉汤，前者用于培养霉菌，后者用于培养细菌。这类培养基的化学成分很不恒定，也难以确定，但配制方便，营养丰富，所以常被采用。 (3)半合成培养基。在天然有机物的基础上适当加入已知成分的无机盐类，或在合成培养基的基础上添加某些天然成分，如培养霉菌用的马铃薯葡萄糖琼脂培养基。这类培养基能更有效地满足微生物对营养物质的需要。2.按照培养基的物理状态分培养基按其物理状态可分为固体培养基、液体培养基和半固体培养基三类。(1)固体培养基。是在培养基中加入凝固剂，有琼脂、明胶、硅胶等。固体培养基常用于微生物分离、鉴定、计数和菌种保存等方面。(2)液体培养基

3、。液体培养基中不加任何凝固剂。这种培养基的成分均匀，微生物能充分接触和利用培养基中的养料，适于作生理等研究，由于发酵率高，操作方便，也常用于发酵工业。(3)半固体培养基。是在液体培养基中加入少量凝固剂而呈半固体状态。可用于观察细菌的运动、鉴定菌种和测定噬菌体的效价等方面。3.按照培养基用途分培养基按用途可分为基础培养基、加富培养基、选择培养基和鉴别培养基。(1)基础培养基 含有一般细菌生长繁殖需要的基本的营养物质。最常用的基础培养基是天然培养基中的牛肉膏蛋白胨培养基。(2)加富培养基 是在基础培养基中加入某些特殊营养物质，如血、血清、动植物组织提取液，用以培养要求比较苛刻的某些微生物。(3)选

4、择性培养基 是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学抗性而设计的培养基。利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。鉴别培养基 是在培养基中加入某种试剂或化学药品，使微生物培养后会发生某种变化，从而区别不同类型的微生物。实验器材：1溶液或试剂 牛肉膏，蛋白胨，琼脂，可溶性淀粉，葡萄糖，孟加拉红，链霉素，1mol/L NaOH，lmol/L HCl，KNO3，NaCl，K2HPO43H2O，MgSO47H2O，FeSO47H2O。2仪器或其他用具 试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻璃棒，天平，牛角匙，pH试纸，棉花，牛皮纸，记号笔，线绳，纱布，漏斗，漏斗架，胶管，止水

5、夹等。实验内容：（一）牛肉膏蛋白胨培养基的配制牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。其配方如下：牛肉膏3g，蛋白胨10g，Nacl5g，琼脂1520g，水1000mL，PH7.47.61称药品 按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放入热水中，牛肉膏使与称量纸分离，立即取出纸片。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。2加热溶解 在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入己溶解的药品中

6、，再加热融化，此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分。3 调pH 检测培养基的pH，若pH偏酸，可滴加lmol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用lmol/L HCl进行调节。pH的调节通常放在加琼脂之前。应注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。4过滤 液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利培养的观察。但是供一般使用的培养基，这步可省略。5分装 按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。分装量：固体培养基约为试管高度的l/

7、5，灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜。半固体培养基以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。6加棉塞 试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞。棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。要使棉塞总长约2/3塞入试管口或瓶口内，以防棉塞脱落。有些微生物需要更好的通气，则可用8层纱布制成通气塞。有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞。7包扎 加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。若培养基分装于试管中，则应以5支或7支在一起，再于棉塞外包一层牛皮纸，用绳扎好。然后用记号笔注明、培养基名称

8、、组别、日期。8灭菌 将上述培养基于121.3湿热灭菌20min。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。9摆斜面 灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，使斜面的长度不超过试管总长的1/2。10无菌检查 将灭菌的培养基放入37温箱中培养2448h，无菌生长即可使用，或贮存于冰箱或清洁的橱内，备用。（二）高氏号培养基的配制高氏1号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。其配方如下：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，K2HPO43H2O 0.5g，MgSO47H2O 0.5g，FeSO47H2O 0.01g，琼脂1520g，水1000mL，p

9、H7.47.6。l称量和溶解 先计算后称量，按用量先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将其调成糊状，再加入少于所需水量的水，继续加热，边加热边搅拌，至其完全溶解。再加入其他成分依次溶解。对微量成分FeSO47H2O可先配成高浓度的贮备液后再加入，方法是先在1000mL水中加入1g的FeSO47H2O，配成浓度为0.01g/mL的贮备液，再在1000mL培养基中加入以上贮备液1mL即可。待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如要配制固体培养基，其琼脂溶解过程同牛肉膏蛋白胨培养基配制。2pH调节、分装、包扎及无菌检查 同牛肉膏蛋白胨培养基配制。（三）马丁氏培养基的配制马丁氏培养基是

10、用于分离真菌的选择培养基。其配方如下： KH2PO4 1g，MgSO47H2O 0.5g，蛋白胨5g，葡萄糖l0g，琼脂1520g，水1000mL，自然pH。1称量和溶解 先计算后称量，按用量称取各成分，并将其溶解在少于所需量的水中。待各成分完全溶解后，补充水分到所需体积。再将孟加拉红配成1%的水溶液，在1000mL培养液中加入以上孟加拉红溶液3.3mL，混匀后，加入琼脂加热融化，方法同牛肉膏蛋白胨培养基配制。2分装、包扎、灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋白胨培养基配制。3链霉素的加入 链霉素受热容易分解，所以临用时，将培养基融化后待温度降至45左右时才能加入。可先将链霉素配成1%的溶液(配好的链霉素溶液保存于-20)，在100mL培养基中加1%链霉素0.3mL ，使每毫升培养基中含链霉素30g。注意事项：称药品用的牛角匙不要混用，称完药品应及时