重组梅毒螺旋体多表位抗原的改进及应用

1、重组梅毒螺旋体多表位抗原的改良及应用【摘要】目的对梅毒螺旋体抗原表位进一步优化，以满足梅毒检测试剂的需要。方法用信息生物学软件对梅毒螺旋体TpN47抗原表位进展分析，在我们以前研究工作的根底上，延伸其长度，用化学合成法获得目的基因，插入到pBVIL1载体中，构建pBVIL1/TpN47表达质粒。将新获得的TpN47基因与本研究室保存的TpN15、TpN17、TpN44.5基因片段相连接，进展嵌合表达，经纯化后用双抗原夹心法测其活性。结果经改良的重组梅毒螺旋体多表位嵌合抗原，用于检测国家新一代的参考品，其阳性及阴性符合率均为100%，4份灵敏度符合参考品的要求。结论所构建的pBVIL1/TpN1

2、5TpN44.5TpN17TpN47嵌合质粒，在E.li中获得了高效表达，经测定，此抗原可满足新一代梅毒检测试剂的需要。【关键词】梅毒螺旋体；TpN47；嵌合抗原；参考品Iprveentbasednrebinantulti-epitpehieriantigenTrepneapalliduanditsappliatinSNGXia-gu，ANGgu-hua，HENKun，etal.InstitutefBasiedialSienes,AS,BEijing100850,hina【Abstrat】bjetiveInrdertdetetKitantibdiesfsyphilis，theepitpehie

3、riantigenfTrepneapalliduereptiizedfurther.ethdsTrepneapalliduTpN47antigenepitpeereanalyzedbyinfratinbilgysftare,textenditslength,thenlinkedithTpN15,TpN17,TpN44.5antigensgenefragent.TherebinantTrepneapalliduulti-epitpehieriantigensasexpressedinE.li.TheAtivityfulti-epitpehieriantigenseredetetedbysandi

4、hantigenenzye-linkediunsrbentassay(ELISA).ResultsIprveentbasednrebinantulti-epitpehieriantigenTrepneapalliduantigensereusednelypanelfantibdiessyphilis,resultsfdetetinerebthpsitiveandnegativeinideneratif100%,4serialsensitivitynsistentithpanel.nlusinRebinantfulti-epitpehieriantigenfTrepneapalliduashig

5、hlyexpressedinE.li.Satisfyrequireentfrnepanelfsyphanalyantibdies.【Keyrds】Trepneapallidu；ulti-epitpehieriantigen;TpN47；panel目前，临床上对梅毒螺旋体感染的检测，常用的方法是血清学检测，如酶联免疫吸附测定ELISA1法等，此方法所用抗原绝大局部为重组蛋白。在以前的研究2中，我们分别选择了TpN15、TpN17、TpN44.5和TpN47的优势抗原表位，进展了克隆和表达，并将此四组基因连接，在E.li中进展了嵌合表达，此抗原在当时梅毒感染血清学检测中起了重要作用，但随着新一代参

6、考品panel的起用，我们发现不能完全满足检测试剂的需要，其原因可能是TpN47基因片段过短所致，因当时为了最大限度缩短基因长度，以降低非特异性反响，仅选用了24个氨基(78101)。我们再次以梅毒全基因组序列3为根底，用Bisun分子生物学软件4重新对抗原表位进展了全面系统地分析，增加TpN47基因长度，即选用400个氨基酸1400，这样可能会进步抗原的覆盖面。此片段经与TpN15、TpN17、TpN44.5基因片段相连接，进展嵌合克隆表达纯化后采用双抗原夹心法对梅毒参考品进展测定，其结果符合要求。1材料与方法1.1材料1.1.1菌株及质粒原核交融表达载体pBVIL1、pBVIL1/TpN1

7、5、pBVIL1/TpN17、pBVIL1/TpN44.5表达质粒由本室构建并保存；E.liHB101，由本室保存。1.1.2工具酶和试剂DNA限制内切酶、PR产物回收试剂盒、Prega公司消费的T4DNA连接酶及T4DNA聚合酶购自博大泰克生物技术公司；氨苄西林用于配制LB培养基的胰化蛋白胨bat-tryptne及酵母提取物(bat-yeast)购自本院条件处。1.1.3引物、序列测定由奥科生物技术合成，三博远志公司测序。1.1.4梅毒参考品panel中国药品生物制品检定所提供。1.2方法1.2.1TpN47抗原表位的选择先从网上Gene-Bank中获得TpN47蛋白的氨基酸全序列，用Bis

8、un分子生物学软件对其抗原表位进展分析，选取抗原性较强局部。1.2.2TpN47基因的合成方法根据所选择的TpN47抗原表位的氨基酸序列，按大肠杆菌的优势密码子，推断出编码抗原表位的基因序列。设计多条有局部重叠序列的基因片段，从中间向两端逐步延伸合成。设计时，如发现基因中有与Xh1、XbaI1及Spe1一样的酶切位点,要作适当调整。1.2.3PR扩增、酶切、连接、转化及诱导表达等参照美Sabrb,J.等箸，黄培堂等译?分子克隆实验实验指南?第三版有关章节进展。详细扩增条件为951in,551in，721.30in，扩增30个循环后，再72延伸7in。1.2.4纯化从表达菌中提取包涵体,并用溶解

9、液(25TE、1%巯基乙醇,8脲pH8.5)将其溶解,然后以SP-SepharseFF或Q-SepharseFF进展离子交换层析,上样后以平衡缓冲液25TE、6脲、0.1%巯基乙醇、pH8.5洗至基线,再用不同浓度的Nal(用平衡缓冲液配制)洗脱。SDS鉴定各抗原蛋白所在的洗脱峰。将搜集的洗脱峰用sephadexG-50凝胶过滤缓冲液：25TE，0.1%SDSpH8.5,搜集第一峰。1.2.5抗原活性鉴定用长臂生物素将纯化后的重组梅毒多表位嵌合抗原一局部进展标记，另一局部包被酶联测定板，以双抗原夹心法，对梅毒阴阳性血清进展测定，评价抗原的反响活性。2结果2.1TpN47抗原表位的的选择用Bis

10、un分子生物学软件对TpN47抗原表位进展分析，如图1所示，选择峰值较高局部，即1400氨基酸，作为抗原序列。图1Bisun分子生物学软件对TpN47抗原表位分析图2.2TpN47抗原表位基因的设计及获取根据以上的氨基酸序列，用E.li的优势密码子及基因合成方法,设计多条有局部重叠序列的引物，在基因前端参加酶切位点Xh1及连接臂GGTGGTGGATT，后端引入Xba1,为了基因片段的连接，设计了含有Spe1酶切位点的通用引物ATAGTGGTGGTGGATT。通过PR逐步扩增延伸法，获得了一条含1224bp的基因序列图2。2.3pBVIL1/TpN47表位抗原表达质粒的构建如图3所示，将上述获得

11、的目的基因片段，用XhI和XbaI双酶切后同，插入表达载体pBVIL1中，即获得了表达质粒pBVIL1/TpN47，经基因序列测定，目的基因插入正确。将此质粒转化于HB101受体菌中，42诱导后可表达目的蛋白，经SDS鉴定，有一60kD的表达区带，这和理论值相符合图5。2.4pBVIL1/TpN15TpN44.5TpN17TpN47嵌合抗原的表达在各表位抗原表达质粒中，均含有通用连接臂，所以可按图4方法进展连接。先将pBVIL1/TpN44.5质粒作为模板，用含有SpeI及含有BaHI的引物扩增出TpN44.5和局部IL-1的基因片段，插入酶切后的pBVIL1/TpN15中，获得含有TpN15

12、和TpN44.5两个基因的表达质粒。由于新质粒中，TpN15和TpN44.5基因间的连接是由互补酶XbaI和SpeI之间的相连，连接后酶切位点消失，因此，新质粒又可成为新的载体，继续与TpN17和TpN47以同样的方法连接，这样最终获得pBVIL1/TpN15TpN44.5TpN17TpN47表达质粒，经转化、诱导后，也得到了高效表达图5，其分子为71kD。2.5抗原纯化TpN15TpN44.5TpN17TpN47嵌合抗原均以包涵体方式表达，所以首先从菌体中提取包涵体，溶解后经离子交换及凝胶过滤等方法进展纯化，经SDS鉴定，其纯度约为95%图5。2.6活性测定我们将纯化的TpN15TpN44.

13、5TpN17TpN47嵌合抗原，一局部用活化长臂生物素标记，另一局部包被酶联测定板，以双抗原夹心法对梅毒参考品进展测定，结果说明表1，10份阳性样品均为阳性，20份阴性样品无一份假阳性；4份灵敏度样品L1-L3为阳性，L4阴性，结果符合参考品要求。表1中国药品生物制品检定所梅毒参考品测定结果D450n注：TP1TP10：参考品10份阳性样品；N1N20：20份阴性样品；L1L4：灵敏度样品；utff=0.183讨论3.1抗原表位的选择在梅毒抗原研究中，基因选择极为重要，如片段过长，非特异性反响增高，即出现假阳性，如片段过短，覆盖面降低，影响检出率。用Bisun分子生物学软件对TpN47全长基因

14、扫描，结果说明，最强表位区在1300氨基酸之间，其次是在310400，我们选择了1400，目的是尽可能的增加抗原的覆盖面。3.2各单片段抗原嵌合表达时的排列顺序我们选用的基因顺序是TpN15TpN44.5TpN17TpN47，因为TpN15和TpN44.5片段很小，放在最前，以免被掩盖，TpN17分子较大且活性较高，放于中间不会受太大影响，将TpN47放在最后是为了最大限度的进步其活性。我们也曾按不同的排列顺序表达过多种抗原，但效果不够理想结果未显示。3.3各单片段混合抗原与嵌合表达抗原活性比拟我们将各单片段抗原按一定比例混合后，测其活性，结果是阳性检出率下降，其原因可能是这四种蛋白的分子量相差较大，所以对酶联板的亲和力各不一样，即包被上去的量也不同，并且，小分子蛋白易被大分子蛋白所覆盖，这样各抗原片段所表现出的活性也就不同。我们将这四种抗原基因连接后进展嵌合表达，使其成为一个分子，这样各抗原片段就会充分发挥各自的免疫学活性。【参考文献】1YungH，yesA,SeagarL,etal.Nvelrebinant-antigenenzyeiune-assayfrserlgialdiagnsisfsphilis.Jlinirbil,1998,36(4):913-917.2宋晓国，