细菌内毒素检查5.动态显色法鲎试验及其在药品生产质控上的应用

1、动态显色法鲎试验及其在药品生产质控上的应用湛江安度斯生物有限公司2017年5月1一、细菌内毒素检查法分类凝胶法（Gel-clot）限度试验半定量试验光度法（Photometry）浊度法显色法动态浊度法(KTA)终点浊度法(ETA)动态显色法(KCA)终点显色法(ECA)细菌内毒素检查法 （BET）2二、动态显色法鲎试验的原理与特点 1. KCA鲎试验原理3动态法光度分析内毒素凝固酶原凝固酶显色寡肽寡肽pNA（黄色）+显色寡肽：一种人工合成的三肽或四肽，俗称鲎三肽或鲎四肽，又称显色基质或显色底物。寡肽的末端连接着一个成分为对硝基苯胺（pNA）的显色基团。在无凝固酶状态时，含有显色寡肽的溶液是无色

2、透明的。当溶液含有内毒素，内毒素激活鲎凝固酶原成为凝固酶，凝固酶会特异性地切断连接显色基团的肽链，使显色基团与显色寡肽分离。游离的显色基团呈黄色。使用动态光度仪分析反应溶液的光度变化，可以定量地测定溶液中的内毒素含量。通常使用405nm光源进行光度分析。42. KCA鲎试验特点灵敏度高在所有的鲎试验方法中，KCA鲎试验的灵敏度最高；在常规的鲎试验条件下（37/60分钟），KCA鲎试验的灵敏度可达0.005EU/ml；灵敏度高的原因在于显色寡肽的应用。5检测范围广在所有的鲎试验方法中，KCA鲎试验的检测范围最广；在常规的鲎试验条件下，KCA的检测范围可达10,000倍（500.005EU/mL）

3、，标准曲线相关系数|r|0.998；线性是衡量检测能力的重要指标；KCA线性好的原因同样在于显色寡肽的应用。6Y轴Log（时间）X轴Log（浓度）动态浊度法(KTA)50EU/mL5EU/mL0.5EU/mL0.05EU/mL0.005EU/mL7Y轴Log（时间）X轴Log（浓度）50EU/mL5EU/mL0.5EU/mL0.05EU/mL0.005EU/mLY轴Log（时间）X轴Log（浓度）50EU/mL5EU/mL0.5EU/mL0.05EU/mL0.005EU/mLX轴Log（浓度）50EU/mL5EU/mL0.5EU/mL0.05EU/mL0.005EU/mL8Y轴Log（时间）抗

4、干扰能力强KCA鲎试验是基于显色的速率来测定样品的内毒素，通常影响凝胶法鲎试验的凝胶生成的干扰因素或影响浊度法鲎试验的浊度生成的干扰因素不会影响KCA鲎试验的显色反应。专门针对鲎凝固酶设计的显色寡肽对显色反应有极为专一的特异性，使KCA鲎试验的抗干扰能力大大强于其它方法的鲎试验。9节约鲎资源目前还没有比鲎试验更好的检测内毒素或热原的方法。在未来的一定时期内，鲎试验仍然是检测内毒素的最灵敏、最快速、最方便和最经济的方法。鲎试验需要消耗珍贵的鲎资源。今天地球上的鲎资源已经越来越少。在KCA鲎试验中，有一部分的酶促反应功能已被显色寡肽所取代，因此它需要的鲎溶胞物只是凝胶法或浊度法鲎试验的4060%。

5、10三、药品生产质控对鲎试验的要求与药品放行检查的鲎试验（BET）比较，药品生产质控对鲎试验有着特殊的要求：1. 灵敏度更高；2. 抗干扰能力更强； 3. 检测范围更宽；4. 检测时间更短；5. 实验操作方便快捷；6. 检测结果准确可靠；7. 试验成本越低越好。11根据药品生产质控对鲎试验的要求，比较现行的各种鲎试验方法，最适合生产质控应用的就是动态显色法鲎试验（KCA TAL test）。下面，介绍湛江安度斯生物有限公司专门为药品生产质控设计的一套MKCA鲎试验系统。12四、微板法动态显色鲎试验系统 （MKCA System）. 系统组成1. 光度分析仪：采用赛默飞FC/ET型酶标仪仪器特点

6、：具有振板、37恒温孵育和动态数据采集功能。13 2. 内毒素检测专用软件：生物探针5版14 3. MKCA鲎试剂：12次试验/支15 4. 光度法内毒素工作品系列：H、M、L165. 细菌内毒素检查用水：内毒素 0.003EU/mL6. 无热原采样瓶 177. 专用微孔板（酶标板）18 8. 移液器具19. MKCA系统应用举例标准曲线及阳性产品对照的制备。利用光度法内毒素工作标准品系列制备标准曲线。H、M、L分别代表高、中、低3个浓度。将待测样品溶液加入M瓶中，制备样品阳性对照。 （实验演示视频1）202. 生产过程内毒素的快速测定假设：某种药品的生产在某一关键工序时要对其半成品（S）的内

7、毒素含量进行监控。21 实验步骤： （1）实验计算及预试验 （2）比对反应曲线制备 （3）日常生产快速测定22（1）试验计算及预试验半成品S，设其浓度为20mg/mL该药品的内毒素限值：L=0.2EU/mg设生产控制限值为 h，h 取 1/4L = 0.05EU/mg经干扰评价预试验得知，供试品S5mg对BET无干扰。取S2mg为日常快速测定的供试品浓度，则监控的内毒素限值为： h2mg = 0.05EU/mg 2mg/mL = 0.1EU/mL日常生产时取该工序半成品S，稀释至S2mg （1:10稀释），测定内毒素含量不得0.1EU/mL。23（2）比对反应曲线制备取一不含可测内毒素的半成品

8、S，用BET水及标准内毒素（RSE或CSE）制备一对照样品S2mgE0.1。对照样品的制备：E E0.2 S S4mg1.0mL S4mg +1.0mL E0.2 2.0mLS2mgE0.1 取对照 样品与KCA试剂反应，得比对反应曲线。存档该比对曲线备用。（实验演示视频2）WW混合1分钟24（3）日常生产快速测定进入快速采集模式，将样品的反应曲线与存档的对比曲线比较，软件将自动判断样品曲线的走势。样品反应曲线比对比曲线快，样品不合格。样品反应曲线比对比曲线慢，样品合格。（实验演示视频3）25快速采集的原理26Cs：比对标准曲线；A、B供试品反应曲线3. 日常的细菌内毒素检查（实验演示视频4）27.鲎试验成本分析1. 鲎试验方法的成本比较282016年安度斯鲎试剂价格表Gel-ClotKTAKC