细菌内毒素检查9.细菌内毒素灭活验证试验

1、细菌内毒素灭活验证试验湛江安度斯生物有限公司2017年5月1（一）细菌内毒素灭活验证试验1.目的：证明干热除热原过程的有效性。2.验证项目及标准 一般将不小于1000单位的细菌内毒素加入待去热原的物品中，证明该去热原工艺能使内毒素至少下降3个对数单位。3.方法（见内毒素指示剂使用方法）4.依据：CHP2015年版附录通则1421灭菌法-干热灭菌法2（二）内毒素指示剂成分：从大肠杆菌提取的内毒素效价：见效价分析报告书用途：用于干热灭活内毒素程序的验证规格：2ml/支安瓿或5ml/支安瓿3（二）内毒素指示剂使用方法1.保留12支指示剂作为未经干热对照品；2.除去指示剂标签，开启；3.在铝箔纸上做好

2、标记，封闭瓶口；4.干热烘箱：把指示剂放置在烤箱的不同位置，依据烤箱的大小及冷点分布情况来确定指示剂的数量，一般放置1015个点（角落、中间点、冷点）。指示剂应与除热原物料夹放在一起；45.按灭活内毒素程序进行干烤（*最差装载）；6.对经灭活程序后的指示剂进行鲎试验测试；7.各干烤点的数据分析。5凝胶限度法分析方法凝胶法定量法凝胶半定量法*最差装载：最大装载和最难被热穿透的物品组合。（二）内毒素指示剂分析方法举例内毒素指示剂：标示效价 1250EU/支鲎试剂：标示灵敏度（） 0.125EU/ml6内毒素指示剂使用时要注意查看鲎试剂的批号是否和效价测定报告书的批号一致！7加入BET水的量和混合的

3、时间鲎试剂批号分析方法举例（凝胶限度法）阳性对照：将未经干热的指示剂按标示效价稀释至0.25EU/ml（2）81.8ml30s12.5EU/ml30s 30s1250EU/ml0.2ml指示剂BET水1.0ml125EU/ml0.2ml1.8ml1.25EU/ml0.2ml1.8ml30s0.4ml0.25EU/ml1.6ml5，000倍混合10分钟内毒素指示剂加入BET水的量和混合的时间参照效价测定报告书样品：经干热的指示剂经干热的指示剂按标示效价稀释至125EU/ml或者原液1250EU/ml检测9 30sS10.2ml指示剂BET水1.0mlS101.8ml混合10分钟检测项目阴性对照阳

4、性对照样品（125EU/ml）样品（1250EU/ml）4数量级分析，非必需结果分析及判断检测项目阴性对照阳性对照样品（125EU/ml）试验有效！样品（125EU/ml）样品（125EU/ml）样品（125EU/ml） + +下降1000倍，符合规定！不符合规定！不符合规定！9未经干热的指示剂效价确认（按标示效价稀释至2、/2、/4）分析方法举例（凝胶半定量法）110.125EU/ml1.0ml1.0ml0.06EU/ml30s1.0ml1.0ml0.03EU/ml30s1.0ml1.0ml0.25EU/ml1.6ml10000倍20000倍40000倍5000倍1.8ml30s12.5EU

5、/ml30s 30s1250EU/ml0.2ml指示剂BET水1.0ml125EU/ml0.2ml1.8ml1.25EU/ml0.2ml1.8ml30s0.4ml混合10分钟内毒素指示剂加入BET水的量和混合的时间参照效价测定报告书30s经干热的指示剂经干热的指示剂需稀释至出现阴性结果的浓度12 30sS10.2ml指示剂BET水1.0mlS101.8ml混合10分钟结果计算及判断可回收内毒素量13未经干热的指示剂反应终点倍数未经干热指示剂每瓶含量（EU/瓶)稀释倍数5000100002000040000平行管200000.125X20000X1.0=2500100000.125X10000X

6、1.0=1250Rc = antilg2lg2500+lg1250= 1767.8(EU/瓶)经干热的指示剂（稀释倍数）反应终点倍数经干热指示剂每瓶含量（EU/瓶)1（4数量级验证）10（3数量级验证）平行管 1 0.125X1X1.0= 0.1251 0.125X1X1.0 = 0.125残余内毒素量Rs antilg2lg0.125+lg0.125即Rs0.125(EU/瓶)14内毒素衰减 lgRd = lgRc-lgRs = lg1767.8 - lg0.125= 4.15中国药典要求lgRd 3分析方法举例（定量法）动态浊度法/动态显色法制备标准曲线 例如5、0.5、0.05EU/ml反应溶液制备：未经干热内毒素指示剂溶液稀释到0.5EU/ml；经干热内毒素指示剂溶液直接检测原液；计算Rc、Rs、和lgRd14分析方法举例（定量法）例如：Rc=1250EU/瓶；Rs0.05EU/瓶； lgRdlg1250-lg0.054.415问题讨论1.为什么要使用指定批号的鲎试剂？可不可以用同灵敏度的鲎试剂替代？内毒素指示剂的效价是