基因敲除知识补充

1、7.19同源臂通常是指打靶载体上待插入的外源序列两侧的与基因组序列完全一致的侧翼序列，用于识别并发生重组的区域同源序列是指在同一物种不同个体间或不同物种间相同或相似的DNA序列，而同源臂是指一段同源序列，类似于tRNA氨基酸 臂的结构，所谓臂，指的是手臂样结构。O同源重组设计上游臂w下游臂的长度多长合适?Liuy621-1 I 浏览 1 &我次临分享T I 200S-06-06 06:55我有更好的答案w按默认排序I按时间排序2015-05-30 21:072条回答智慧.Angel I三级一般300-800bp比较合适,怛根据不同的物种会有差异临分享w目评论Liuy621 I 一级最快回笞20

2、00-06-08 16:57股来说同源重组左右同源臂的总长比所缺失基因大1 KB临分享寸&评论I d 0 分 。T载体的定义:T载体（T-Vector）是一种高效克隆PCR产物（TA克隆）的专用质粒载体，为线性化载体，无需酶切可直接与具有A末端的PCR产物连接，属于非定向克隆。T载体的作用原理:大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都具有在PCR产 物的3末端添加一个切的特性（下图红色框内所示位置）。因此， 人们在线性化平末端载体的两端分别又人工加上一个额外的T碱基（下图两个红色箭头所示），从而可与PCR克隆产物的A末 端互补配对，提高了 PCR产物连接和克隆的效率。GCATG CTCCC

3、GGCCGCGTAC GAGGG CCGGCT7 Transcription Start. . . TGTAA TACGA CTCAC TATAG GGCGA ATTGG GCCCG ACGTC 3 ACATT ATGCT GAGTG ATATC CCGCT TAACC CGGGC TGCAGT7 PromoterApalAatllSphlBstZICCATG GCCGC GGGATT3 GGTAC CGGCG CCCTANcolSac 11f -ATCAC TAGTG CGGCC GCCTG CAGGT CGACC ATATGl one ci msc-rt TTAGTG ATCAC GCCG

4、G CGGAC GTCCA GCTGG TATACII II II IPstl Sall NdetSpeiIBstZISP6 Transcription StartGGAGA GCTCC CAACG CGTTG GATGC ATAGC TTGAG TATTC TATAG TGTCA CCTAA AT 3CCTCT CGAGG GTTGC GCA AC CTACG TATCG MCTC ATATC ACAGT GCATT TA,. . . 5rI I11ISP6 PromoterSac IBstXlNsi3T载体进行TA克隆的优势:相对于另一种非定向克隆平末端克隆，使用T载体进行TA克隆是一种快

5、速、高效、一步到位的非定向克隆法。有研究曾证 明，平末端克隆的连接效率仅为粘端连接的1/50，且自身环化率高。T载体的制备：商业化T载体：一般来说，商业化的T载体多是先使用平端限制性内切酶（如EcoRV）将克隆载体进行线性化，然后再单独加入dTTP和Taq 酶7275C反应，进行末端的加T。由自制T载体：一种常见的自制方法是利用限制性内切酶制造出具有单个T末端突出的片段，最常用的内切酶为XcmI2，其识别和切割特点 如下：5.l.CCANNNNN，NNNNTGG.J.33.1GGTNNNN1NNNNNACCr-5P其中XcmI的识别序列分别为两端的CCA和TGG，而切割序列则为中间三角箭头所指

6、的N （N代表任意碱基）。由于N可以是 任意碱基，所以如果将切割位置的N设置为T，那么在该酶的切割下，就可以产生一个3 T末端。相似的，在其互补链上设置 另一个相同或者类似的XcmI酶切位点（保证切割位点为T即可）就可以产生另一个T末端。一般可以在商业化的T载体基础 上进行改造，通过PCR或者合成Oligo的方式插入上述两个XcmI位点。连接成功的质粒可按需要自行扩增和保存，使用时用 XcmI进行完全酶切（这里的酶切必须保证完全，否则载体易自连，所以XcmI酶最好过量，或者适当延长消化时间），就可以 制备得到T载体。常见T载体及序列：虽然上面提到可以自制T-Vector，但实际上现在的商业化载

7、体已经做到比较便宜，而且批次间稳定性保持的不错。最常见的T-Vector要属Takara公司的pMD系列（pMD18-T、pMD19-T、pMD20-T以及对应的去除多克隆酶切位点的Simple载体，如 pMD19-T-Simple4）和 Promega 公司的 pGEM 系列（pGEM-T和 pGEM-T Easy） 5载体：zdi ti英文单词vector，在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种 能自我复制的DNA分子。三种最常用的载体是细菌质粒、噬菌体和细菌病毒和动植物病毒。运载体在基因操作过程中使用运载体有两个目的：一是用它作为运载工具，将目的基因转移到

8、宿主细胞 中去；二是利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制（称为克隆）。现在所用的运载体主要有两 类：一类是细菌细胞质的质粒，它是一种相对分子质量较小、独立于染色体DNA之外的环状DNA（一 般有1200 kb左右，kb为千碱基对），有的一个细菌中有一个，有的一个细菌中有多个。质粒能通 过细菌间的接合由一个细菌向另一个细菌转移，可以独立复制，也可整合到细菌染色体DNA中，随着 染色体DNA的复制而复制。另一类运载体是噬菌体或某些病毒等。现在人们还在不断寻找新的运载体， 如叶绿体或线粒体DNA等也有可能成为运载体。作为运载体必须具有四个条件：在宿主细胞中能保存下来并能大量复制；有多个限制酶切

9、点， 而且每种酶的切点最好只有一个，如大肠杆菌PBR322就有多种限制酶的单一识别位点，可适于多种 限制酶切割的DNA插入；含有复制起始位点，能够独立复制；有一定的标记基因，便于进行筛 选。如大肠杆菌的pBR322质粒携带氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，就可以作为筛选的标记 基因。一般来说，天然运载体往往不能满足上述要求，因此需要根据不同的目的和需要，对运载体进 行人工改建。现在所使用的质粒载体几乎都是经过改建的。基因克隆的载体类型：质粒载体，噬菌体载体，柯斯质粒载体，M13噬菌体载体，噬菌粒载体 t载体就是一种常用的克隆载体，既然是克隆载体当然是用来克隆目的基因片段的Taq DNA酶扩增

10、的PCR产物，其DNA双链前后末端都有一个游离的A碱基，可以与t载体末端游离 的T碱基互补形成环状重组T质粒。关于菌株的几个概念：野生型菌株：从自然界分离到的微生物在其发生突变前的原始状态。营养缺陷型：野生型菌株经过人工诱变或自然突变失去合成某种营养的能力，只有在基本培养基中补充 所缺乏的营养因子才能生长。原养型：营养缺陷型菌株经回复突变或重组后产生的菌株，其营养要求在表型上和野生型相同关于培养基：基本培养基（minimal medium，MM）:仅能满足微生物野生型菊株生长需要的培养基，用-来表示。完全培养基（complete medium，CM）：凡可满一切营养缺陷型苗营养需要的天然或半组

11、合培养基。用+ 来表示。补充培养基（supplemental medium，SM）：凡只能满相应的营养缺陷型生长需要的组全培养基， 它是在基本培养基中加入该菌株不能合成的营养因子而组成。营养缺陷型是指缺乏合成某种对自身生长繁殖所必须的营养物质（氨基酸、维生素、碱基等）的能力 的突变型，只能从周围环境或培养基中获得这些物质或其前体物才能正常生长。营养缺陷型的检出是通过一系列培养基实现的。基本培养基（MM）能满足野生型和原养型菌株最低营养要求的合成培养基。完全培养基（CM）能满足各种营养缺陷型菌株营养要求的天然培养或半合成培养基。补充培养基（SM）在MM中有针对地补加某一种或几种营养成分，以满足特

12、定营养缺陷型菌株 生长要求的培养基诱变后的菌体经富集培养后，涂布于CM平板上，将长出的菌落按一定排列次序逐个地点种漩平板、CM 平板的相应位置。培养后，在CM上有菌落生长而iMM的相应位置上没有生长的菌落，能是营养缺陷型。 挑取菌体分别接种于AM. CM上进一步复证除点植对照法外，还可通过影印法、夹层法、限量补给法等检 出营养缺陷型。拷贝数 就是指某基因（可以是质粒）在某一生物的基因组中的个数.单拷贝就是该基因在该生物基因组中只有一个，多则指有 多个。实验材料大肠杆菌K12的野生型菌株大肠杆菌实验器其和药品用具：灭菌培奔皿（9cm）,灭菌三角瓶（150inlh灭菌离心管。培养基1）肉汤液体培养

13、基:牛肉膏0.5g,蛋白腺1g. NaClO 5g,蒸锚水100ml, Ph7.2,高压 灭菌15磅/英、尸15分钟。2）肉泌液体培养基（2E）：牛肉言。一5g,蛋白腺lg，NaClO 5g,蒸馅水50ml, Ph”, 高压灭菌锅15磅/英、315分钟.3）基本液体培养基：葡萄粒2g,蒸辟水98niL pH7.0,高压灭菌S磅/英、_H 3。分钟4）基本固体培养基：琼脂跄，基本液体培奔基100ml, pH7.0,高压灭菌8磅/英、J 2 30 分钟，5）无N基本液体培养基：K2HPO40.7g, KH2PO403gl柠檬酸钠-3H.O 0.5g, MgSO4 7H2O 0.01g,葡萄糖 2g

14、,蒸爆水 lOOinl, P117.0,高压灭菌 8 磅/英、j 30 分钟，6）基本液体培养基:KcHPOE.Tg.KHiPOE-*,柠檬酸钠-3H:O 0.5g,MgSO4 *7H2O 0.01g （NH4）2SO4 0.2gt 葡萄糖 2g,蒸御水 1 OOnil. P117.0-高压灭菌 8 疏，英- 30 分钟，乞理盐水：NaC10 S5g,蒸简水100ml,高压灭菌15磅/英寸15分钟匚2.1.1菌种大肠杆菌(E.coli) K12菌株2,1.2培养基LB液体培养基X4 (10rrl/100ml酵母膏5时蛋白豚1朝、NaCI 10g/L.蒸水100ml. pH7.2：LB 固体培养

15、基Xl(240/500ml)：酵母膏 5g/L、蛋白腺 10&L NaCI 10g/L、蒸水 100ml、 琼脂 2.0%, pH7.2；2XLB液体培养基Xl(3ml/试管卜酵母膏10g/L.蛋白20g/L. NaCI 20g/L.蒸水50mk pH7.2；无，基本培养基X l(5m|/100ml)： K2HPO4 7g/L, KH2PO4 3g/L 柠It 酸钠*3H2O5g/L,MgS04*7H20 0.1g/L.葡萄糖 2Qg/L,蒸倘水 lOOmk pH7.0,2N 基本液体培养基Xl(5ml/100ml)： K2HPO4 7g/L. KH2PO43g/L,柠檬酸钠*3 H2O5g/

16、L, MgSO4*7H2O0.1g/L.葡萄糖 2Qg/L, (NH4) 2SO4 2g/L,蒸水 lOOmL pH7.D；基本固体培养基X l(300/500ml： 50 X Vogel *2mR葡萄糖20g/蒸孺水98ml、琼月旨2.0%. pH7.0o2.1.3试剂0.85%生理盐水，混合氨基酸和混合维生素(见表一)四、材料菌种 E.coli培养基、LB培养液(Luria-Bertani培养基,这个名字来源于英语的lysogeny broth,即溶菌肉汤。是微生 物学实验中最常用的培养基，用于培养大肠杆菌等细菌，分为液态培养基和加入琼脂制成的固 态培养基。加入抗生素的LB培养基可用于筛选

17、以大肠杆菌为宿主的克隆。)：酵母膏，0.5g； 蛋白胨，1g； NaCl, 0.5g；水，100ml, pH7.2 121C灭菌 15min2XLB培养液：其它不变，水，50ml。基本培养基：葡萄糖 0.5 g，(NH4)2SO4 0.1 g，柠檬酸钠 0.1 g，MgSO47H2O 0.02 g，K2HPO4 0.4 g，KH2PO4 0.6 g，重蒸水100 mL，pH 7.2，110C灭菌20 min。配固体培养基时需加2%洗涤 处理过的琼脂。全部药品需用分析纯，使用的器皿 需用蒸馏水或重蒸水冲洗23次。无N基本液体培养基：K2HPO4,0.7g； KH2PO4,0.3g;柠檬酸钠 3H

18、2O,0.5g； MgSO4 7H2O,0.01g;葡萄糖 2g；水 100ml，pH7.0 110C 灭菌 20min2N基本培养基：KcHPO,0.7g； KHcPO,0.3g;柠檬酸钠 3H O,0.5g； MgSO 7H O,0.01g; (NH1SO1,0.2g;葡萄糖 2g；水 100ml，pH7.0 110C 灭菌 20min完全培养基同LB培养基，配置固体培养基，需加2%的琼脂。混合氨基酸和混合维生素表2 大肠杆菌K12中与氨基酸转运有关的次级主动转运蛋白(TMS:跨膜片段)Table 2 The secondary active transporter involved in

19、 amino acid transport in Escliericliia coli K12(TMS： traiisnieinbrane segments)转运蛋白势能离子转运的氨基酸吸收/分泌共转运方向TMS与无机阳离子（Na+/H）同向共转运蛋白AGCS家族（丙氨酸/甘氨酸:Na+/H+同向转运蛋白TC2.A.25）YaaJ(l)(X)07),Na+、l丙氨酸吸收同向9A PC超家族（氨基酸-多胺-有机金属阳离子超家族TC2.A.3）AroP(l)0112),9Na+、l芳香族氨基酸吸收同向12Cy cA( 14208 )20Na+、l丙氨酸、甘氨酸、 幼.氨酸吸收同向12LysP(b2

20、156)2,Na+、l赖氨酸吸收同向12PheP(l)0576)221Na+、l苯丙氨酸吸收同向12ProY (1)0402 )t,Na+、l脯氨酸吸收同向12MmuP( 1)0260 )2Na+、lS-甲基-甲硫氨酸吸收同向12YeeF(l)2014)23Na+、l脯氨酸吸收同向12YI)aT( 1)0486)Na+、l.丝.氨酸？?12YcaM( 1)0899)Na+、l氨基酸？?13AnsP(bl453)Na+、l天冬氨酸?12YcjJ (l)1296)Na+、l赖氨酸?12DA ACS家族（二矮酸盐/氨基酸：阳离子（Na+或1）同向转运蛋白TC2.A.23）GltP(l)4077)24

21、Na+谷氨酸吸收同向1()SstT( 13089 )25Na+统氨酸、苏氨酸吸收同向8ESS家族（谷氨酸：NT同向转运蛋白TC2.A.27）GhS (1)3653)加Na+谷氨酸吸收同向9HAAAP家族【2 （羟基/芳香族氨基酸转运蛋白TC2.A.42）Mtr(l)3161)ir色氨酸吸收同向11TnaB( 1)3709)ir色氨酸吸收同向11TyrP( 1)1907)ir酪氨酸吸收同向11S(laC( 1)2796)ir统氨酸吸收同向11T(lcC(l)3116)h+苏氨酸吸收同向11LIVCS家族（支链氨基酸：阳离子同向转运蛋白TC2.A.26）BrnQ (1)0401 )27NaH支健氨

22、基酸吸收RJ向12MFS超家族（主要易化子超家族TC2.A.1）Pn)P(l)4111)Na+、l脯氨酸吸收同向12YhjE(l)3523)Na+、l脯氨酸吸收同向11YdfJ (l)1543)Na+、l脯氨酸吸收同向9SSS家族（溶质：Na+同向转运蛋白2.A.21）PutP(l)1015)29Na+脯氨酸吸收同向12TRAP-T家族（组分ATP-不依赖型周质转运蛋白TC2.A.56）YiaM (1)3577)YiaN(l)3578)Yia()( 1)3579)Na+谷氨酸吸收同向41()0与其它离子同向共转运蛋白LysE家族（L-赖氨酸分泌蛋白TC2.A.75）YggA(l)2923)3OOH-赖氨酸、精氨酸分泌同向6与无机阳离子（Na7H0反向共转运蛋白DMT超家族（药物/代谢物转运蛋白超家族TC2.A.7）Y(1(1G(I)1473)H*芳香族氨基酸分泌反向1()YdeD(bl533)H*半胱氨酸分泌反向1()RhtA ()(