壳聚糖的复合法降解及降解产物降血糖活性的研究

1、壳聚糖的复合法降解及降解产物降血糖活性的研究【摘要】目的研究复合法降解壳聚糖及降解产物的生物活性方法在纤维素酶降解的后期引入H22氧化降解壳聚糖。观察其降解产物对糖尿病小鼠生化指标的影响。结果最正确工艺条件为：纤维素酶降解时酶糖比0.2，pH4.6、50、时间为3h，后续H22降解时H22用量为0.81.0(l/g)、75、时间为1.5h，所得降解产物的平均分子量约为1700。工艺所消费的低聚壳聚糖用量为100g/kg时具有明显的降血糖生物活性，其成效甚至优于拜糖苹。结论该复合降解工艺具有本钱低，易于工业化，而且所得产品具有较高的生物活性。【关键词】壳聚糖;低聚壳聚糖;降解;血糖;生物活性Ab

2、strat：bjetiveTinvestigatehitsandegradatedbybinedethdandprdutinbilgialativityfdegradatin.ethdshitsanasfirstdegradatedbyellulasedeplyerizatin,andthenasxidatedbyH22.Theeffetsfdegradatinndiabetiieasbserved.ResultsTheptiuellulasedeplyerizatinnditinseretheassfellulasethitsan(n)0.1,pH4.6,teperature(T)50and

3、tie(t)3h.TheptiuH22xidatinnditinseretheprprtinfH22thitsan(n)0.81l/g,teperature(T)75,tie(t)1.5h.Undertheptiudegradatinnditinabut1700lighitsanuldbebtained.rever,thepreparedlighitsanshedbviuslyleringbld-gluseativityhengiventieatadsef100g/kganditseffetasevenveraarbse.nlusinThisbineddegradatinethdthitsan

4、isntnlyllystandeasytindustrialize,butalsitspreduthasahigherbilgialativity.Keyrds：hitsan;lighitsan;Degradatin;Bldgluse;Bilgiativity壳聚糖作为天然碱性多糖，其资源量仅次于纤维素，分子量从几十万到几百万不等。降解后的低聚壳聚糖因溶解性增强，容易被吸收利用，尤其是分子量在1500左右的产品显示出独特的生理活性和功能1。目前，由壳聚糖降解制备优质低聚壳聚糖的工业化消费成为该多糖广泛推广使用的瓶颈。在已有研究的众多降解方法中，非专一性酶降解和H22氧化降解法比拟有望实现大规模

5、化消费。其中H22氧化降解具有本钱低、降解速度快、产品无残毒等优势。但反响在H22用量大、温度高及反响时间长的条件下易发生副反响，制备产品的活性也受到质疑。与其相比，酶降解由于无副反响、降解条件温和、降解过程容易控制、产品生物活性高而引起人们的广泛关注2。在众多非专一性酶的挑选过程中，纤维素酶因存在广泛，消费本钱低，对壳聚糖具有一定降解作用而受到重视，但纤维素酶活力有限，降解效率低，产物分子量分布较宽3。为此，本研究在纤维素酶降解的后期向体系内引入H22快速氧化降解，以进步反响速率、缩小产品分子量分布宽度。最后对制备的低聚壳聚糖产品进展降血糖生物活性研究，以评价该制备工艺的可行性。1器材1.1

6、材料壳聚糖，济南海得贝海洋生物工程，脱乙酰度90%;纤维素酶，天津丽华制剂厂，酶活力40000Ug-1;H22，30%分析纯。拜糖苹，北京拜尔医药保健产品;四氧嘧啶，Siga公司提供。1.2仪器203柔性反响釜，德国进口;小型板框压滤机，浙江省海宁市丰源过滤设备;DZF-6050型离心喷雾枯燥器，常州市一步枯燥设备厂;L-10AD凝胶色谱仪，日本岛津;血糖仪，上海荣盛生物技术提供。1.3动物3月龄雄性昆明小鼠，体质量2030g，军事医学科学院实验动物中心提供。2方法2.1降解实验2.1.1纤维素酶的降解实验在搅拌的情况下，将200g壳聚糖按150(/V)混合，参加适量冰醋酸溶解后，快速升温至所

7、需温度，加纤维素酶进展恒温降解。到达预定时间后迅速升温至100使酶失活，取样稀释过滤、用凝胶色谱分析产物的平均分子量3。实验以酶糖比n、pH和温度T为主要影响因素设计L9(34)正交实验，得最正确组合工艺条件为n=0.1，pH=4.6，T=50。2.1.2H22氧化降解工艺条件确实定在纤维素酶降解的根底上升温至预定温度，参加H22后继续降解，到预定时间后取样、过滤分析产物平均分子量。最后在确定的最正确复合降解工艺条件下对壳聚糖进展降解，卸料降温，板框压滤、喷雾枯燥后待用。2.2降解物对糖尿病小鼠生化指标的影响2.2.1高血糖模型的复制及分组小鼠禁食12h，四氧嘧啶生理盐水溶液(2%)腹腔注射(

8、一次性给药)，剂量为180g/kg，72h后空腹尾尖取血，血糖仪测血糖，大于11l/L的小鼠入选糖尿病模型。取10只正常小鼠为正常组。将造模成功的小鼠随机分成5组，每组10只，分别为模型组，壳聚糖原料组(100g/kg)，低剂量降解产物组(100g/kg)，高剂量降解产物组(200g/kg)，拜糖苹治疗组(20g/kg)。灌胃1次/d，连续给药28d。正常组和模型组灌胃生理盐水。2.2.2动物标本留取每天观察各组小鼠的进食量、饮水及尿量;给药14d和28d后尾尖取血，血糖仪测血糖;实验完毕后小鼠被断椎处死，取肝、肾组织，用滤纸吸干外表血迹后称重。2.3统计学分析用SPSS13.0软件进展统计分

9、析，所得数据用s表示，组间差异采用t检验。转贴于论文联盟.ll.3结果3.1纤维素酶的降解过程研究为了考察纤维素酶的催化降解过程，在正交实验确定的最正确组合条件下对壳聚糖进展降解，产物的平均分子量随时间的变化情况见图1。图1纤维素酶降解过程图1说明，在开场降解的0.75h内，产品平均分子量迅速下降。这也证实了纤维素酶对壳聚糖主要进展内切降解反响。随着反响的进展，壳聚糖聚合度减小，产物平均分子量下降趋势变缓。这与产物浓度的增加在一定程度上抑制了降解反响的进展有关。当降解到达3h后，产物的平均分子量下降趋势非常微弱，维持在2万左右。因此，可在纤维素酶降解3h后，引入H22进展降解。3.2H22氧化

10、降解工艺条件确实定3.2.1温度对降解过程的影响在纤维素酶降解的根底上，不同温度条件下H22氧化降解壳聚糖过程见图2。图2温度对H22降解过程的影响图2说明，引入H22后产物平均分子量迅速下降，降解速率根本上与温度呈正比。这可能是壳聚糖分子内部尚存在少量易断裂“弱键，如：少数链节上具有呋喃环构造、存在少数戊糖的环状构造、或存在少数开环的半缩醛链节构造。之后产物平均分子量下降比拟平缓，且温度越高进入平缓阶段越早。此外，在反响过程中还发现，在高于80条件下降解时，所得产物颜色随着降解时间的延长由淡黄色逐渐转变为褐色，且温度越高变化越明显。分析认为当壳聚糖降解到一定程度后，其空间构造由卷曲状转变成短

11、的直链状，氨基基团活泼性增强，易发生羰氨副反响。为了有效控制副反响消耗具有生物活性的氨基，确定后期H22氧化反响温度为75、时间为1.5h。3.2.2H22用量对降解过程的影响在纤维素酶降解的根底上，质量质量分数为30%H22的用量与壳聚糖用量的比值n对降解过程的影响见图3。图3H22用量对降解过程的影响由图3可以看出，在反响时间和温度一样的条件下，降解产物的平均分子量随H22用量的增加而下降。当用量比增加到0.8以后，下降趋势明显变缓。由此确定后续H22的最适用量比值为0.81.0(l/g)。此时，可获得平均分子量约为1700左右的降解产物。采用纤维素酶与双氧水复合降解壳聚糖与直接采用双氧水

12、降解相比，双氧水降解时间缩短将近50%，产品平均分子量低且颜色较浅4。分析认为，壳聚糖溶液经过纤维素酶初步降解后分子量有了很大降低，呈均相溶液，从而抑制了双氧水可能对局部壳聚糖过度降解。此外，降解时间缩短也很好地限制了副反响的发生。3.3降解产物的降血糖活性研究3.3.1一般情况的观察实验过程中各组小鼠体重、血糖及内脏重量的变化见表1。表1小鼠体重、血糖及内脏重量的变化与正常组对照，1P0.01，2P0.05;与模型组对照，3P0.01，4P0.05经四氧嘧啶注射造模成功后的糖尿病小鼠，出现饮食量增加、多饮多尿、体毛松散及精神萎靡等病症。未经治疗的模型组“三多病症尤其突出，体重也明显低于正常组

13、(P0.05)。低剂量降解产物和拜糖苹治疗组的一般病症得到明显改善，体重与正常组无显著差异。壳聚糖原料和高剂量降解产物治疗组的病症改善居中。3.3.2降解产物对糖尿病小鼠血糖的影响与模型组相比，壳聚糖原料治疗组血糖值虽然有所降低，但并不存在显著性差异。原因为壳聚糖本身分子量过大，不能被有效吸收所致。而高、低剂量降解产物和拜糖苹治疗组的14，28d血糖值明显低于模型组(P0.01)。其中，低剂量降解产物的降血糖效果甚至优于拜糖苹。由此说明壳聚糖原料经过本工艺降解后具有明显的降血糖生物活性，且起效较快。与正常组相比，单独使用降解产物并不能使血糖降到正常值。3.3.3降解产物对糖尿病小鼠内脏的影响由

14、表1中的数据分析可知，除拜糖苹治疗组外(P0.05)，其它治疗组的肝脏指数虽然高于模型组，但不存在显著性差异。这说明壳聚糖及降解产物对肝脏具有一定保护功能，但效果不显著。同时也证实了临床上广泛使用的拜糖苹降糖药具有对肝脏损害小的优点。对于肾脏，低剂量降解产物治疗组的指数与正常组较接近，而其它治疗组的肝脏指数与模型组接近，明显高于正常组(P0.01)。可见，使用一定剂量本工艺消费的低聚壳聚糖对糖尿病小鼠进展治疗时，可同时到达保护肝、肾的成效。有关低聚壳聚糖降糖作用机制目前尚不清楚。大多推测为，壳聚糖分子构造中的大量氨基调节机体内pH呈弱酸性，从而增强胰岛素的活性。也有人认为降解后的低聚壳聚糖对动

15、物机体内-葡萄糖苷酶具有一定抑制作用，阻碍了它从碳水化合物和有关多糖的非复原端切下葡萄糖5。根据本研究结果，降解产物的治疗效果与拜糖苹比拟接近，而拜糖苹正是-葡萄糖苷酶的抑制剂，因此，偏向于后者。4结论本研究提出了一种纤维素酶结合双氧水降解壳聚糖的复合降解方法。实验确定最正确工艺条件为：纤维素酶降解时酶糖比为0.2、pH4.6、反响温度为50、时间为3h，后续H22降解时30%H22用量与壳聚糖原料的比值为0.81.0(l/g)、75、时间为1.5h，所得降解产物的分子量约为1700。降解产物对糖尿病小鼠降血糖研究说明，用量100g/kg时具有明显的降血糖生物活性，且起效较快。其成效甚至优于拜糖苹。此外，对糖尿病小鼠进展治疗时，可同时起到保护肝、肾的成效。因此，该降解工艺不仅有效结合了非专一性酶和双氧水氧化降解的优势，具有本钱低，易于工业化，所得产品具有较高的生物活性。【参考文献】1魏新林，夏闻水.甲壳低聚