槐耳浸膏对人肝癌高转移细胞系转移的抑制作用研究

1、槐耳浸膏对人肝癌高转移细胞系转移的按捺作用研究李立新叶胜龙王艳红孙瑞霞薛琼陈洁高东梅汤钊猷【摘要】目的探究槐耳浸膏按捺肝癌细胞转移的机制，为槐耳浸膏在临床上治疗肝肿瘤提供理论根据。要领将高转移潜能人肝癌细胞系H97H别离与槐耳浸膏1.0g/l，3.0g/l，5.0g/l，10.0g/l及DE含10%胎牛血清作用24h，测定其肿瘤细胞黏附率、活动按捺率及侵袭按捺率。效果各组H97H细胞经槐耳浸膏作用24h后，其细胞黏附率显着落落，而活动按捺率及侵袭按捺率显着上升，与比拟组比拟差异均有统计学意义，且槐耳浸膏浓度与肿瘤细胞黏附率、活动按捺率及侵袭按捺率均有相干性。结论槐耳浸膏能显着按捺肝癌细胞的黏附

2、、活动及侵袭本领，故可以阻抑肝癌细胞的转移。【关键词】槐耳浸膏肝癌细胞系转移按捺etastatiPtentialInhibitedithTraetesRbiniphilainHighlyetastatiPtentialHuanHepatellulararinaellsLinesAbstrat:PurpseTexplretheehanisfetastatiptentialinhibitedithTraetesrbiniphilainhuanhepatellulararinaellsandtprvidetheexperientalbasisfTraetesrbiniphilaintreatentf

3、rliveraner.ethdHighlyetastatiptentialhuanhepatellulararinaells(H97H)eretreatedithDEandTraetesrbiniphila(1g/l,3g/l,5g/land10g/l)fr24hrespetively.Theratesfellsadhesin,elltinandellsinvasinereeasured.ResultsAfterH97HellsinulatedithTraetesrbiniphilafr24h,theratesfellsadhesindereasedandellstinandellsinvas

4、ininreasedbviusly,ithsignifiantdifferenesbeteenTraetesrbiniphilagrupandntrlgrup.Theratesfellsadhesin,ellstinandellsinvasinererrelatedithnentratinfTraetesrbiniphila.nlusinTraetesrbiniphilaarkedlyinhibittheabilityfellsadhesin,tinandinvasininhighlyetastatiptentialhuanhepatellulararina,sitanarresttheeta

5、stasisfanerells.Keyrds:Traetesrbiniphila;hepatellulararinaells;etastasis；inhibitin槐耳是生长在中国古槐树上的一种药用真菌槐栓菌Traetesrbiniphilaurr，具有“治风、“破血、“益力的成果，民间多用于治疗癌症和炎症。由槐耳菌质经热水提获得到的槐耳浸膏含有多种有机身分和十余种矿物元素，其重要抗癌活性身分为卵白多糖PS?T。动物实行已证明槐耳浸膏具有显着按捺肿瘤生长和延伸荷瘤动物保存期的成果，其制品槐耳颗粒已普及应用于临床,并有大量报道证明其对肝癌、肺癌、食管癌、胃癌等肿瘤有奇特疗效1。但其抗癌机制迄今尚

6、未见全面报道，尤其是在抗肝癌转移和复发的底子研究方面所见报道少少。本研究目的即试图通过槐耳浸膏干预肝癌细胞的黏附、活动、侵袭等方面，较为体系地探究槐耳浸膏按捺肝癌细胞转移的机制，为临床治疗肝癌提供部门理论根据。1质料与要领1.1质料H97H肝癌细胞系由复旦大学肝癌研究所创立。接纳DE造就基含10%胎牛血清造就，每3d调换造就基。0.25%胰酶?EDTA消化液消化后1：3传代。纤连卵白fibrnetin，Fn和多聚赖氨酸购自Siga公司；小牛血明净卵白BSA购自Rhe公司；HEPES购自erk公司。DEDulbedifiedEagleediu购自Gib/Brl公司；胎牛血清FBS购自Hylne公

7、司；胰卵白酶购自Dif公司。FALN细胞造就板，造就瓶购自BetnDikinsn公司。starTransell造就板3422，孔径8.0，直径6.5购自rning公司。姬姆萨染液的构成为姬姆萨色素0.5g加甘油30l研磨，加甲醇500l，摇匀溶解。atrigelBaseentebraneatrix356237，PhenlRed?free购自BD公司。槐耳浸膏由江苏盖天力药业提供。将槐耳浸膏溶于DE含10%FBS中，使其溶度别离为1.0g/l、3.0g/l、5.0g/l和10.0g/l。0.22滤器抽滤待用。缓冲液A的构成为tris?Hl20l/L，pH7.4，氯化钠150l/L，氯化镁1l/L

8、，氯化钙1l/L，氯化锰1l/L。缓冲液B的构成为tris?Hl50l/L，pH7.4，氯化钠100l/L，氯化镁1l/L，氯化钙2l/L，氯化锰1l/L。黏附缓冲液B的构成为Hepes10l/LpH7.4，氯化钠140l/L，氯化钾5.4l/L，葡萄糖5.56l/L，3%BSA，氯化镁1l/L，氯化钙2l/L，氯化锰1l/L。1.2要领将Fn溶于缓冲液A10g/L，每孔参加0.1l。以100g/l多聚赖氨酸和1%BSA包被孔作为最大和最小黏附参照，4孵育留宿或天然枯燥，用缓冲液B洗板，黏附缓冲液B封阻30，2h，再用缓冲液B加1g/LBSA洗2次。已贴壁H97H细胞与槐耳浸膏1.0g/l，3

9、.0g/l，5.0g/l，10.0g/l及DE含10%胎牛血清作用24h，胰酶消化，1000r/in离心2in，弃上清，PBS洗3次。0.1%BSA溶液悬浮H97H细胞并调解为1106/l。每孔参加0.1l细胞悬液，37，5%2孵育3h。弃造就液，用黏附缓冲液B洗2次以去除未黏附之细胞。用3%多聚甲醛的PBS结实。用0.1l/L硼酸缓冲液pH8.5淋洗1次。参加含1%亚甲蓝的0.1l/L硼酸缓冲液0.1lpH8.5，室温安排20in。弃亚甲蓝，用硼酸缓冲液洗4次。每孔参加1l/LHl0.1l，37，40in。在酶标定量仪上用570n波长测定光密度值D570，盘算细胞黏附率。细胞黏附率=100%

10、用无血清DE造就液稀释Fn7.5g/l，按每孔50l匀称涂布于Transell小室滤膜上外貌。紫外线照耀4孵育留宿，利用前浸于无血清DE造就液中，37孵育2h待用。10%FBS?DE造就基通例造就细胞，待细胞铺满造就瓶底后，用无血清DE冲洗2次，加0.1%BSA?DE造就48h。离心去除细胞网络造就上清为肿瘤细胞趋化因子。过滤除菌，-20保存待用。已贴壁H97H细胞与槐耳浸膏1.0g/l，3.0g/l，5.0g/l，10.0g/l及DE含10%胎牛血清作用24h，胰酶消化，1000r/in离心2in，弃上清，PBS洗3次。0.1%BSA溶液悬浮H97H细胞并调解为1106/l。Transell

11、上室参加细胞悬液100l含1105个细胞，下室参加肿瘤细胞趋化因子600l，37，5%2孵育24h。孵育竣事后稍稍水洗，用棉签擦去滤膜上外貌未穿膜的肿瘤细胞。滤膜甲醇结实30in，姬姆萨染色，将膜固封于载玻片上。200倍显微镜下计数5个差异视野的穿膜细胞数，取均匀数，盘算活动按捺率。活动按捺率=100%用无血清DE造就液稀释atrigel基质2g/l，按每孔50l匀称涂布于Transell小室滤膜上外貌。余实行步调同以上趋化活动试验。在200倍显微镜下计数5个差异视野的穿膜细胞数，取均匀值，盘算侵袭按捺率。侵袭按捺率=100%1.3统计阐发接纳SPSS11统计软件包，应用单因素方差Bnferr

12、ni法阐发整理数据。应用成对查验相干性阐发ne?tail及成对查验相干性阐发t?tail查验槐耳浸膏浓度别离与肿瘤细胞黏附率、活动按捺率、侵袭按捺率之间的相干性。2效果2.1槐耳浸膏对细胞黏附本领影响H97H细胞与纤连卵白之间黏附力强，空缺比拟组细胞黏附率为75.561.343%。颠末槐耳浸膏作用24h后，细胞黏附本领显着落落图1。各槐耳浸膏组细胞黏附率别离为：1g/l组66.44%1.381%,3g/l49.23%2.067%,5g/l组36.66%1.892%,10g/l组30.12%1.741%。各组与比拟组比拟差异均有统计学意义(P0.01)。应用成对查验相干性阐发ne?tail及成对

13、查验相干性阐发t?tail查验槐耳浸膏浓度与肿瘤细胞黏附率成负相干，相干系数别离为-0.9P0.01和-0.914P0.01。2.2槐耳浸膏对细胞趋动的影响H97H细胞活动本领较强，比拟组穿膜细胞数为49.643.189/200倍视野。颠末槐耳浸膏作用24h后，活动本领显着落落，表现出较显着的活动按捺力(图2)。各槐耳浸膏组细胞活动按捺率别离为：1g/l组28.78%4.986%，3g/l组60.41%2.469%，5g/l组75.36%2.863%，10g/l组83.49%2.672%。各组与比拟组比拟差异均有统计学意义P0.01。应用成对查验相干性阐发ne?tail及成对查验相干性阐发t?

14、tail查验槐耳浸膏浓度与肿瘤细胞趋化活动按捺率成正相干，相干系数别离为0.863P0.01和0.977P0.01。2.3槐耳浸膏对细胞侵袭活动的影响H97H细胞侵袭力强，比拟组穿膜细胞数36.683.695/200倍视野。颠末槐耳浸膏作用24h后，侵袭力落落，表现出较显着的侵袭按捺作用图3。各槐耳浸膏组细胞侵袭按捺率别离为：1g/l组43.70%5.497%，3g/l组60.33%8.290%，5g/l组83.25%3.500%，10g/l组86.03%4.040%。各组与比拟组比拟差异均有统计学意义P0.01。应用成对查验相干性阐发ne?tail及成对查验相干性阐发t?tail查验槐耳浸膏

15、浓度与H97H细胞侵袭按捺率成正相干，相干系数别离为0.814P0.01和0.942P0.01。3讨论恶性肿瘤细胞的转移历程包罗肿瘤细胞黏附adhensin，细胞外基质extriellularatrix，E落解，细胞移行igratin三种根本征象13。肿瘤细胞之间及其与正常构造、细胞之间的黏附状态非常是肿瘤细胞侵袭的始动环节，它涉及多个黏附及去黏附历程。黏附历程包罗：肿瘤细胞与内皮细胞，内皮下基底膜及转移灶宿主细胞的黏附。去黏附历程包罗肿瘤细胞之间的去黏附及其脱离基底膜和内皮细胞。黏赞同去黏附历程的不竭瓜代是其侵袭的关键4，5。别的恶性肿瘤细胞在侵袭历程中必要不竭排泄种种卵白酶来落解细胞外基质

16、和基底膜，此中基质金属卵白酶如P?2，P?9等在这一历程中起着紧张作用。肿瘤细胞正是依赖这些卵白酶来不竭落解细胞外基质和基底膜，并通过自身的伪足活动，以及前述的黏赞同去黏附历程来产生侵袭和转移。因此，要操纵肿瘤细胞的侵袭和转移，就必需按捺肿瘤细胞与基质或基底膜或宿主细胞的黏附及其对基质或基底膜的落解以及自身的活动。Fn为基底膜和细胞外基质的紧张身分。肿瘤细胞从母体脱落伍，侵袭基底膜和细胞外基质，通过膜外貌受体可黏附于Fn上而产生活动和迁徙，使肿瘤扩散和转移。H97H细胞是由复旦大学肝癌研究所创立的高转移潜能人肝癌细胞株6。它体外侵袭力强，接种裸鼠后肺转移率为100%。本次实行接纳了该细胞株来检

17、测槐耳浸膏对肿瘤细胞黏附、活动、侵袭本领的影响。效果提示：经槐耳浸膏作用的H97H细胞的粘附率显着落落，两者之间存在剂量效应相干性。细胞黏附率随槐耳浸膏浓度的增长而落落，至10g/l时细胞黏附率较比拟组落落60.14%。经槐耳浸膏作用的H97H细胞的活动、侵袭本领显着落落，且细胞活动按捺率、侵袭按捺率与槐耳浸膏浓度均呈正相干。从以上实行效果，我们可以看到槐耳浸膏对H97H细胞的黏附、活动、侵袭本领均有显着的按捺作用，从而阻抑肿瘤细胞的转移为临床上槐耳浸膏防治肝癌的转移提供了理论根据。【参考文献】1庄毅.真菌抗癌药物槐耳颗粒的研制J.中国肿瘤，1999，812：540-543.2Stetler?stevensn,LittaElEinerD.Extraellularatrix:rlefatrixetallprteinasesinturinvasinandetastasisJ.FASEB,1993，7：1434-1440.3AznavrianS,urphyA,Stetle?stevensn,etal.leularaspetsfturellinvasinandetastasisJ.aner,1993，71(4)：1368-1382