分析仪器、试剂分析师认证讲座（14）小川 善資

1、生物試料分析資料：分析機器試薬認定講座（14）酵素活性測定法分析構築法（）臨床医要望検査技師要望取入分析構築法小川 善資1)、沼上 清彦2)Summary Enzyme activity measurement for the laboratory tests are a widely used, in many casesdone with general-purpose automatic analyzers. They are used as screening tests and in tests incor-porating diagnostic criteria. Relative

2、 analysis methods are widely used to ensure the safety andaccuracy of these analytical values. However, unlike methods that quantify substance concentrations,there are factors that affect accuracy even in relative analysis. This is a point that needs to beproperly understood. One ideal type of test

3、construction is analysis systems that take into consider-ation the desires of the treating physician incorporating the test and that also meets with wishes of theperson doing the analysis. In other words, construction of an analytical system that has sufficient analyt-ical resolution and that also s

4、ufficiently meets the desires of both the treating physician and the personin charge of the analysis with respect to lower or upper measurement limits and the minimumconcentration for assay capacity. Since there is overlap in many parts of substance quantitativemethods, this discussion focuses on th

5、e parts that differ. The analyzable range and precision greatlydiffer depending on the performance of the device used, and the performance of analytical instrumentsmust be confirmed with each device. In this article performance is assumed and specific examples ofanalytical systems are proposed. A me

6、thod of constructing an analytical system for lactate dehydro-genase (LD) is also taken up.Key words: Routine assay, Assay system of enzyme activity, Automated analyzer,Molecular absorption1. 酵素活検査、診断基準取入検査。分析値安定性正確性確保、相対分析法広用。、物質濃度定量法異、相対分析行正確度影響与因子、点正理解必。検査法構築一理想、検査込診療医要 望汲取、併分析者希望叶分析。、分析分解能測定下限上限

7、関性測定広用検査、汎用自動分析装置測定多、要診療医分析担当者要 望十分叶分析構築。、物質定量法重 部分多、相違部分中心記述。使用装置性能、1)北里大学薬学部194-0042 東京都町田市東玉川学園 1-9-192)生物試料分析科学会常任理事 146 生物試料分析Vol. 38, No 2 (2015)分析範囲精密度。本稿性能仮定、分析具体例立案。上、乳酸（LD）活性測定法分析構築法取上。大変化、分析機器性能各自装置確認測要要2. 分析装置性能測定誤差関係汎用自動分析装置用、標準物質使用、相対分析酵素活、分析機器10程度異変、測定値様誤差表表示。物質濃度測定時同様、相対分析行系統誤差相殺、10程

8、度異変発生、多場合測定値影響与。物質定量相違恒温槽温度性測定行場合清正確性。下記示測定原理酵素E1測定場合取上。反応生成NADH340 nm吸光度増加速度酵素活性測定。E1A NADB NADH相対分析法酵素活性測定物質吸光度変化量間次式成立。、NADH340 nm吸光係数 6.310 l/mol/cm。3吸光度変化量総反応液量 10量酵素 性（U/L）6吸光係数2-1. 量著者、相対分析物質濃度測定記述1)、酵素活性測定相対分析行限、量変化物質定量同様、測定値影響与。2-2. 試薬分注量厳密言、試薬濃度変化活性差生出、相対分析用表分析機器誤差酵素活性測定誤差関係（10程度誤差発生場合発生測定

9、誤差関係）分析機器部位内容分取量正確測定値発生誤差測定誤差発生。部量直接分析誤差表。詰深刻誤差。分注量正確測定誤差明確表。測定誤差発生。希釈濃縮誤差表。試薬分注部活基常測定値連続。試薬流路漏温槽温度温度正確度温度上下 測定酵素温度依存性。吸光度測定精度測光正確性 影響。波長正確度影響。突然異度恒間差誤差発生。異度関汚汚突然、汚以外影響。試薬汚影響与。試薬情報、影響受組合排除必要原因。正確度再現性影響。反応管。信号経路 147 生物試料分析誤差相殺。、基素（LD）以外、多少基質濃度活性差出、測定誤差発生。質濃度至適条件選択、限酵2-3. 恒物質定量法恒温槽温度正確測定値影響与、酵素活性測定測定値

10、誤差与。原因標準液添加酵素検体中存在酵素温依存性多場合相違。物質定量場合、標準液純粋測定物質選別添加良、酵素場合、様精製酵素用、酵素性質相違、正測定値伝達。動物由来細菌由来酵素添加管理試料用場合、検体中酵素温度依存性相違。例、37測定、恒温槽温度実際40。血清中測定対象酵素熱弱、4010低値測定。一方、標準試料添加細菌由来酵素熱強、4037活性10高値測定。標準液酵素活性200 U/L検体中酵素活性100 U/L、40測定場合、標準液活性220 U/L分吸光度変化示（例0.022/min）。対検体測定90 U/L（0.009/min）分働示。、測定値次計算。温槽温度設定度正温度標準液（200

11、U/L）反応速度0.02/min検体（100 U/L）反応速度0.01/min（37）測定場合検体反応速度200100 U/L標準液反応速度（0.02/min）（0.01/min）検体中酵素 性40測定場合標準液（200 U/L）反応速度0.022/min検体（100 U/L）反応速度0.009/min検体反応速度検体中酵素 性 20081.8 U/L標準液反応速度（0.022/min）（0.009/min）誤差発生。、様問題引起原因一。、由来酵素用問題、単純。由来、相違温度依存性同一、遺伝子組換技術同一作成、温度依存性一致実験的確分。複雑問題。血清均等測定。両者温度依存性相違合。一方由来温度

12、依存性等添加、他方温度依存性相違、測定値大歪生。問題完全解決法。皆十分理解上、多方合意決解決方法思。濃度測定解決策一、中種類、両定量法困難、問題、解決術思。2-4. 波長正確性物質定量法同様、系統誤差、測定値影響現。 148 生物試料分析Vol. 38, No 2 (2015)基度基度活測定直線性2-5. 吸光度線性欠如装置正酵素活性測定。特吸光度減少速度測定方法影響大受。活性誤差受割合相違。具体的発生誤差記述参考下2)線性欠如吸光度高部分発生易、低部分発生難、直測定場合誤差発生。物質濃度測定場合、吸光度増加反応利用多、直線性吸光度測定限界、誤差発生。、大吸光度反応、測定可能範囲大（試薬項参照

13、）。試薬、測定可能範囲広特徴製品。、特徴。、最近装置長短縮、高吸光度測定、精密性保問題。吸光度測定上限倍吸光度測定分解能、感度1/2。、精密性保明確知必要 。要 、吸光度直線性有、精密性保各装置必要 。直恒度。恒度活直線部分度純菌度恒度清菌活活活活度算2-6. 吸光度測定正確性度直線性保、吸光度測定正確性測定値正確性影響与。度度2-7. 分析装置自動分析装置用、相対分析実施日常検査法正確度性能。先正確度影響及因子次。（正確度影響及性能）詰吸光度測定直線性欠如恒温槽設定温度正確性（精密度影響及性能）精密度影響及度度量、量減少試薬分注量変化純波長正確度量直接測定値。、量減少感度減少直接、原因。試薬

14、濃度至適条件設定、試薬濃度上昇低下得測定低、感度低下、原因可能性。、測定波長誤差測定光半値幅測定物質変化。、波長影響大受。、今回使用分析装置測定限界表設定。度度清度度度意度表今回使用自動分析装置測定吸光度変化速度上限下限（仮定）測定下限吸光 変化量吸光度分析分析分解能（正測定仕分吸光度測定上限吸光 変化量 0.1500/min0.0001/min差）0.0001/min 149 生物試料分析項以下記述仮定数値、設定光路長0.5 cm用、検出結果光路長1.0 cm結果表示。3. 試薬測定誤差関係3-1. 正確度酵素活性測定場合、物質濃度測定異、試薬変化測定値影響出。物質定量、系統誤差全相殺、酵素

15、活性測定、場合、。活性測定、血清中左右試薬問題存在可能性、単一測定条件設定場合問題発生、複数均等反応、合計活性求場合、大変難問題。、検体存在比相違、影響正理解極難問題。個別酵素議論解析不可能。具体的検査項目毎議論必要 。試薬発生問題、基本的系統誤差発生多、相対分析誤差解消起、個別酵素吟味必要 生。、項目毎議論。3-2. 測定反応上再現酵素活性測定法試薬濃度決定上行。理由影響因子多、互影響考慮試薬条件決定極困難作業。個別酵素具体的記述。3-3. 共役酵素用酵素活酵素活性、一般的測定原理単純測定誤差要 因排除、正確活性値測定。、測定操作簡単、測定操作法組。具体的LD活性測定法、乳酸酸方向反応、NA

16、DH生成速度性求。検体活性測定試薬活性測定、検体測定法全組合記述。測定 1精製水NAD 予備加温乳酸 試薬測定性測定法活測定 2検体NAD 緩衝液 検体測定測定 3検体乳酸 緩衝液 検体測定検体活検体活性測定 2検体乳酸 NAD 検体活性測定試薬測定何問題、一般的測定。次検体測定関考。測定検体中乳酸必存在、理論上測定。測定選択、補酵素酵素反応生、測定行意味。理論的、乳酸以性測定 1検体NAD 乳酸 検体活性測定外検体中存在何物質生反応検体考、測定実施、先説明通、測定。検体活選択。一般的操作法選択同活性値考方多思、実際測定活性値相違。理論的LDNAD結合、基質乳酸結合（Bi-Bi反応従）。、検体

17、活性測定性測定検体活性測定実施、検体活性測定実施理思、検体中LD反応物質存在、反 150 生物試料分析Vol. 38, No 2 (2015)応本来反応阻害剤、反応開始可能性、LD-NADH-乳酸複合体（LD活性強阻害剤、反応直線性失原因物質）形成可能性。、検体活性測定選択。、両者活性差何原因発生明確限、選択理由見。、逆反応酸乳酸反応測定考、同問題選択対象。結論、理論的検体正取方法無問題存在。、問題LD活性測定、臨床応用上問題、決大問題。、検体取、大誤差招患者血清出来（LD反応物質大変高濃度疾患、特定薬物、反応物質上昇可能性）不安残。、標準法作成悩課題、精度管理正考、管理試料試料作成上重 問題

18、。可能性、問題。、検体中乳酸存在測度活度異活活清活要基3-4. 共役酵素用酵素活共役酵素用測定法関初速度反応開始直後反応速度。警告広知渡、反応開始直後非直線部分認識知。、多市販試薬反応開始直後発生非直線部分出試薬開発進、現在様現象極力見試薬市販（Km値小酵素用、酵素添加量増加現象目立）。、今度共役酵素添加新問題発生可能性。試薬毎明測定値相違現象結果現。日本場合、標準物質共通使用、様試薬間差発生、共役酵素起因問題可能性最高感。、問題、力入気。性測定法活度活活純活活度活活活表試薬異常酵素活性測定誤差関係（10程度誤差発生場合発生測定誤差関係）試薬部分常内容測定値発生誤差LD基質阻害大酵素過剰基基質分解試薬口質添加活活開放水蒸発 影響有。活活濃縮誤差発生、多酵素影響。関補酵素分解試薬口試薬継足厳禁、NADNADH酵素開放水蒸発強力阻害剤形成。濃縮PALP問題複雑、別途記載。意ATP、ADP安定性悪要 注意安定剤添加量少、不安定多要 注意共役酵素安定剤添加。分解、劣化。共役酵素安定