临床PCR检验标本的处理、保存及核酸提取方法

1、2018-5-14检验科临床PCR检验标本的处理、保存及核酸提取方法肿病瘤原分新个体子产生体核遗前儿化酸传诊筛检检检断查测测测唐羊无四新新液组性乙呼药耳氏水创病生生态织病肝吸物染聋烟台市烟台山医院检验科崔金鹏色筛细产筛儿儿活检三等道代基项病谢体因查胞前查耳遗检测原酶微检核聋传体检缺测型基代失分因谢测筛析检病查测筛查病人识别病人准备设备校准PCR扩增性能评价精密性重复性携带污染标本采集采集质量评价标本运送标本评价标本保存核酸提取质量评价实验室外l 血清（浆）l 全血结果评价报告发放指导诊断l 痰实验室内l 拭子l 脓液Analytical Phase Post-analyticall 体液l 干

2、血片l 组织l 骨髓穿刺样本/细针穿刺细胞常规项目ll对于DNA测定的标本，可按照一般的血清标本处理程序，对测定影响不大。对于RNA测定的标本（如HCV），抗凝后6小时内分离血浆，如使用血清标本，则需尽快(2小时内)分离血清，72h内提取RNA则可放置在4下。标本的短期（15天内）保存可在-20下，较长期保存应在-70下。ll抗凝剂不能有肝素尽快分离血浆是核酸不被降解的关键步骤。室温下不同保存时间对血清 HCV-RNA检测的影响较小12018-5-14血清反复冻融对HCV-RNA检测的影响较小不分离血清对弱阳性标本 HCV-RNA检测的影响较大Circulating cell-free DNA

3、SerumSerumEDTA-plasmaEDTA-plasma内源性DNase活性测定外源性DNase I的降解能力Circulating cell-free DNABRAF A1/A2-105bpBRAF A1/B2-288bp反复冻融血浆2次以上对cfDNA影响较大22018-5-14Circulating cell-free DNA全血保存于Streck采血管3天后分离血浆Circulating cell-free DNA1. 使用EDTA抗凝采血管，不能使用肝素 ;2. 检测样品应为血浆而非血清，避免标本反复冻融；3. 采血后混匀动作要轻柔 ;4. 如果不能及时处理应使用专用采血管，

4、 标本运送时常温运送；5. 应根据试剂或试管的说明书进行必要的调整。l 全血标本主要是提取单个核细胞中的核酸：基因组DNA、线粒体DNA和总RNA等l 单个核细胞的制备途径：1. 使用淋巴细胞分离液分离制备2. 使用红细胞裂解液裂解全血中的红细胞，再经过生理盐水洗涤即可得到白细胞l 单个核细胞如果不提取核酸，可保存于 -70。l 严禁反复冻融，如果不能保证低温则应使用专用采血管l 需要提取细胞内总RNA的标本，应迅速保存于 -70下，否则应使用含有RNA保护成分的专用采血管保存。室温保存不同时间对RNA总量的影响不同温度保存对RNA总量的影响32018-5-14全血-循环肿瘤细胞循环肿瘤细胞富

5、集技术稀有性抗原特异性非典型形态阴阳性富集技术比较阳性富集阴性富集lll用PCR方法检测性病病原体时（衣原体、支原体、淋球菌、梅毒螺旋体、HPV和流感病毒等）临床标本一般为拭子。CTC标本取材是关键，衣原体等病原体感染上皮细胞，因此取材一定要取到细胞。白细胞磁珠处理时将拭子置于适量的生理盐水中，充分震荡洗涤后，室温静止 5-10分钟，取上清，离心后的沉淀，经生理盐水洗涤一次后，沉淀可用于核酸提取免疫染色l使用具有细胞保护液的专用保存管保存样本。42018-5-14粘稠脓液水样脓液ll临床标本置于经过处理的滤纸片上，如靶核酸为 DNA，可室温保存数月至数年，如靶核酸为 RNA，则可稳定数周。分枝

6、杆菌非分枝杆菌直接离心同痰液加入适量生理盐水保存在滤纸上的标本，保存时间长，还可因为标本中的 PCR抑制物如血红蛋白、酶、免疫球蛋白等吸附于滤纸上，而不对后面的扩增检测造成影响。震荡，静置取上清后离心沉淀沉淀沉淀ll不管是全血、血清（浆），还是尿液、粪便、分泌物等均可此种方法。采血后，室温静置4小时，血片彻底干后再保存。核酸提取RNA稳定和储存溶液l经典方法原理：短时间内迅速渗入细胞，特异性抑制细胞内的Rnase活性，从而保证RNA的完整性。l煮沸法商品化试剂盒注意：a. 使用前标本不能冷冻；ll硅吸附法磁珠法b. 将组织切成任一方向小于 5mm的薄片，并浸于约5倍体积的RNAlater溶液中

7、；c. 细胞标本使用RNAlater时需要注意；d. 如果要保存在-20或者-80则需要先在4过夜对其核酸提取的有效性进行评价材料准备破碎细胞核酸释放与纯化AC优点：提取的DNA纯度高沉淀或吸附核酸，进一步纯化核酸溶解于缓冲液或水中缺点：操作复杂DNA损失严重不适于模板量较小的标本52018-5-14应用： 质粒提取小分子量环状DNA问题：病原体DNA的提取时所使用煮沸法与质粒提取时所使用的煮沸法是否相同？原理：1. 血清等溶液在加热处理后蛋白质和 DNA均会变性不同，主要区别如下：2. 线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的 DNA虽然也会变性，但冷却时即恢复其天然构象1. 病原体基因组DNA远大于质粒DNA2. 提取病原体DNA时的煮沸是为了将病原体 DNA和蛋白质彻底变性，将其基因组DNA释放到溶液中，煮沸时间较长一般为 10min，而提取质粒时煮沸7：完整性较好6-7：部分降解6：完整性较差RNA完整性的影响因素室温条件下，全血细胞RNA的完整性受到破坏纯DNAOD260/OD280=1.8一般1.8-2.0之间纯RNAOD260/OD280=2.0一般1.9-2.1之间92018-5-14OD320：主要反映溶液的浊度，其值应该为 0，其吸光度通常作为baseli