微生物培养基的配制和灭菌

1、微生物培养基的配制和灭菌1.明确培养基的配制原理和方法，掌握其配制的一般方法和步骤。2.了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。3.熟悉分离、培养微生物前的有关准备工作及操作方法。目的1、培养箱（生化培养箱、恒温培养箱）2、恒温干热箱3、高压灭菌锅4、净化工作台、生物安全柜5、pH计6、 冰箱（低温冰箱或冷柜）7、温度计、天平8、集菌仪微生物检验常用仪器9、其它物品：天平、牛角匙、电炉、pH试纸、量筒、玻棒、烧杯、锥形瓶（三角瓶）150ml、试管、培养皿、吸管、纱布、牛皮纸、绳索或者橡皮筋、各种试管塞和锥形瓶塞、标签、记号笔等 1.合成培养基：由各种纯化学物质按一定

2、比例配制而成。 2.半合成培养基：有一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而成。 3.天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成。从培养基的物理状态可分为 1.液体培养基：不加凝固剂的液体状态培养基。 2.固体培养基：在液体培养基中加入2%左右的凝固剂的固体状态的培养基或农副产品培养基。 3.半固体培养基：在液体培养基中加入0.20.5%凝固剂而成的半固体状培养基常用凝固剂为琼脂（其次为明胶）据组成成分可分为: 按状态分类 液体培养基：一种或多种成分组成的水溶 液（如：蛋白胨水，营养肉汤）。 固体培养基和半固体培养基：含有不同浓 度固化物（如琼脂、明胶）的液体培养基 增菌培养基：通常为液体培养基

3、，能够给 微生物的繁殖提供特定的生长环境。 选择性增菌培养基：能够允许特定的微生 物在其中繁殖，而部分或全部抑制其他微 生物生长的培养基。 分离培养基：支持微生物生长的固体或半 固体培养基。 选择性分离培养基：支持特定微生物生长 而抑制其他微生物生长的分离培养基。 鉴别培养基(特异性培养基)：能够进行一项 或多项微生物生理和/或生化特性鉴定的培 养基。 鉴定培养基：能够产生一个特定的鉴定反 应而通常不需要进一步确证实验的培养基 按制备方法分类 商品化即用型培养基：以即用形式或融化 后即用形式置于容器内供应的液体、固体 或半固体培养基。 商品化脱水合成培养基：使用前需加水和 进行处理的干燥培养基

4、。 自制培养基：依据完整配方的具体成份配 制的培养基。 试剂：用于微生物检验的染色剂和培养基配套试剂.培养基及试剂质量保证 证明文件（生产企业提供的文件）： 培养基或试剂的各种成分、添加成分名称 及产品编号； 批号； 最终pH值(适用于培养基)； 储存信息和有效期； 产品合格证明； 包装的完整性； 外购培养基 概述：应严格按照供应商提供的贮存条件、 有效期和使用方法进行培养基和试剂的保 存和使用。 脱水合成培养基及其添加成分：通过观察 粉末的流动性、均匀性、结块情况和色泽 变化等判断脱水培养基的质量的变化。若 发现培养基受潮或物理性状发生明显改变 则不应再使用。 培养基贮存 实验室应保存有效的

5、培养基目录清单，清单应包括以下内容： 容器密闭性检查； 记录首次开封日期； 内容物的感官检查。 商品化即用型培养基和试剂：应严格按照 供应商提供的贮存条件、有效期和使用方法进行保存和使用。培养基贮存实验室自制的培养基：在保证其成分不会 改变条件下保存，即避光、干燥保存，必 要时在5 3 冰箱中保存。 建议：平板不超过2周，瓶装及试管装培养基 不超过3个月，除非某些标准或实验结 果表明保质期比上述的更长。 培养基贮存培养基的贮存应建立经验证的有效期。观 察培养基是否有颜色变化、蒸发/脱水或微 生物生长的情况，当培养基发生这类变化 时，应禁止使用。 培养基使用或再次加热前，应先取出平衡 至室温。

6、培养基贮存称量：按照配方正确称取各种原料放于烧杯杯中。溶化：在烧杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解。调pH值：用1N NaOH或1N HCl调pH，用pH试纸对照。分装：用量筒分装，注意不要污染硅胶塞。包扎，标签，注明何种培养基。灭菌摆斜面（如果需要）检查：培养基灭菌后必须在370C下恒温培养24h，确定无菌生长，方可使用。（沉降菌用）培养基的配制方法和步骤正确制备培养基是微生物检验的最基础步 骤之一，应遵守良好实验室规范和生产厂 商提供的使用说明； 使用商品化脱水合成培养基制备培养基时， 应严格按照厂商提供的使用说明配制（如 重量/体积、pH、灭菌条件等）； 使用各种基础成分制备培养基时，

7、应按照 配方准确配制，并记录相关信息（如成分 含量、制造商、批号等）。 培养基的实验室制备 1.蛋白胨很易吸湿，在称取时动作要迅速。称量完成后要密闭瓶塞。2.称多种培养基时严防混杂，一把牛交匙用于一种培养基，或称取一种培养基后，洗净，擦干，再称取另一培养基。瓶盖也不要盖错。3.在琼脂溶化过程中，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器。同时，需不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦，配制培养基时，不可用铜或铁锅加热溶化，以免离子进入培养基中，影响细菌生长。培养基的配制和灭菌过程中的注意事项称重和溶解 小心称量所需量的脱水合成培养基（必要 时佩戴口罩或在通风柜中操作，以防吸入 含有有毒物质的培养基粉末）； 先

8、加入适量的水，充分混合（注意避免培 养基结块），然后加水至所需的量后适当 加热，并重复或连续搅拌使其快速分散， 必要时应完全溶解； 含琼脂的培养基在加热前应浸泡几分钟。 分装 将配好的培养基分装到适当的容器中，培养基量不超过容 器的体积的2/3。 pH 值的测定和调整 先用pH试纸测试，必要时在灭菌前进行调整，用pH计测pH值， pH值应在标准pH0.2范围内；灭菌前可调高0.2； 一般使用浓度约为40 g/L（约1 mol/L）的 氢氧化钠溶液或浓度约为 36.5 g/L（约1 mol/L）的 盐酸溶液调整培养基的pH； 灭菌高压蒸汽灭菌法干热灭菌法加压蒸汽灭菌法 其步骤如下： 1.加水：灭

9、菌器内加入一定量的水，将用防水纸包扎好的物品放入其中。 2.通电：接通电源，进行加热。 3. 排气：排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待排出大气后关闭排气阀；或关闭排气阀，待压力上升到0.5kg/cm2时再打开排气阀，待压力回复到0时再关闭排气阀。 4.恒温灭菌：当压力达15bl/in2（即1.05kg/cm2）时，此时灭菌器内的温度为1210C，维持30min。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物时，应适当降低压力，延长时间。 5.结束：灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品。高压蒸汽灭菌高压灭菌锅；生物指示菌法（常用）、化学变色纸片及高

10、压灭菌锅温度计等方法进行检测。生物指示菌法是一种高压灭菌锅的效果显示法。高压灭菌锅由专人按作业指导书操作，并做好每一次的作业记录。高压灭菌锅使用时，内置物品不能太多，单位体积内的内容物（每瓶内的培养基）不能太多。同时应注意内容物不同耐受温度。总的暴露时间最好不要超过45min。高压灭菌锅5.在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸气的温度低于饱和蒸气的温度。影响灭菌效果。湿热灭菌： 湿热灭菌在高压锅或培养基制备器中进行， 高压灭菌一般采用121 2灭菌15 min， 具体培养基按食品

11、微生物学检验标准中的 规定进行灭菌； 培养基体积不应超过800 ml，否则灭菌时 可能会造成传热效果不佳； 干燥灭菌箱日常工作记录中应包括以下信息：开始的时间、到达灭菌温度时的时间、取出的时间（或关闭时间）。干燥灭菌箱的温度校准；用参考温度计进行温度测试。干燥灭菌箱校准时间一般为一年。干燥灭菌箱干热灭菌法：电热烘箱作为干热灭菌器灭菌培养皿，试管，吸管。一般1802小时，1604小时，25030分钟。根据灭菌的东西选择温度时间，有纸包装不能用高温，以免纸燃烧引起火灾。 融化后的培养基放入4750的恒温水浴 锅中冷却保温(可根据实际培养基凝固温度适 当提高水浴锅温度)，直至使用； 融化后的培养基应尽快使用，放置时间一般 不应超过4 h，敏感的培养基尤应注意，融化 后保温时间应尽量缩短，如有特定要求可参 考指定的标准； 倾注到样品中的培养基温度应控制在约45 左右。 根据培养物性质及温度要求，培养箱应分别设置（以用途和温度分）细菌30-35，真菌25培养箱的温差要求，一般显示值与实测值相差不大于1，箱体内各点温差（内部的温度均衡性）以及温度波动同样不大于2。培养箱 平板的制备和储存： 倾注融化的培养基到平皿中，使之在平皿 中形成厚度至少为3 mm（直径90 mm的平 皿，通常要加入18 ml20 ml琼脂培养基）；