复旦药学专业课课件相关专业复试看药物分析定量分析

1、第四章 药物定量分析与分析方法验证（二） 干法破坏1、高温炽灼法将有机物灼烧灰化以达分解的目的。将适量样品置于瓷坩埚或铂坩埚中，加入无水碳酸钠、氢氧化钙或轻质氧化镁等以助灰化，混匀后，先小火加热使样品完全炭化，然后高温灼烧，使其完全灰化。本法适用于湿法不易破坏完全的药物以及不能用硫酸进行破坏的有机药物。2、氧瓶燃烧法(oxygen flask combustion method)系指将有机药物放入充满氧气的密闭的燃烧瓶中进行燃烧，并将燃烧所产生的待测物质吸收于适当的吸收液中，然后根据待测物质的性质，采用适宜的分析方法进行鉴别，检查或含量测定。适用于含卤素、硫、氮、硒等有机药物的分析本法简便、快

2、速、破坏完全，尤其用于微量样品分析基本原理有机物充O2烧瓶燃烧产物吸收液 分析仪器装置和设备（1）燃烧瓶（2）称样材料及称样方法 无灰滤纸：适用于固体样品 纸袋：适用于液体样品（3）氧气：采用钢瓶氧气，防止导气管污染。（4）吸收液 作用：定量吸收供试品的燃烧分解产物，使其转变为便于测定的价态。 选择原则：被测物质的种类及所用分析方法。药物破坏后吸收液定量方法含氟氟化氢水茜素氟蓝比色法含氯氯化氢NaOH水溶液银量法含溴溴+溴化氢NaOH水溶液+还原剂SO2银量法含碘各种价态碘NaOH水溶液+还原剂SO2银量法含硫三氧化硫H2O2溶液重量法含磷五氧化二磷水磷钼蓝比色法含硒四价硒+少量六价硒硝酸溶液

3、二氨基萘比色法3、注意事项：（1）燃烧瓶：大小适宜、干净、有防爆措施（2）氧气要充足：燃烧完全（不得有黑色炭化物）（3）产生烟雾应完全被吸收：充分振摇烟雾颜色：碘，紫色；溴，红棕色；氟、氯,白（4）测定氟化物：石英制燃烧瓶 正确选用燃烧瓶的目的在于：样品能在足够的氧气中燃烧分解完全；有利于将燃烧分解产物较快地吸收到吸收液中；防止爆炸的可能性。 待分解样品量 燃烧瓶的体积 35mg（微量分析） 150250ml 2030mg（半微量分析） 300500ml 5060mg 1000ml 0.60.7g或更多 2000ml或特殊结构的燃烧瓶第二节 定量分析方法特点一、容量分析法（一）容量分析法的特点

4、 操作简单、快速； 比较准确； 仪器普通易得。1. 滴定度（T）的概念 每1ml滴定液相当于被测物质的量(mg)2. 滴定度的计算 aA + bB cC + dD T = Ma/bB3. 百分含量的计算（原料药） （1）直接滴定法 D% = V F T/W 100% F = 实际标定的浓度/规定的浓度 （二）容量分析法的计算问题（2）生成物滴定法T滴定度，每1ml滴定液相当于被测组分的mg数 A% = V F T/W 100%T计算时，需考虑A，C，D三者间的化学剂量关系A + B C C + D E （D为滴定剂）（3）剩余滴定法T滴定度，每1ml滴定液相当于被测组分的mg数 V滴定时，供试

5、品消耗滴定液的体积（ml） V0滴定时，空白消耗滴定液的体积（ml）F浓度校正因子 ms供试品的质量 例：双相滴定法测定苯甲酸钠含量。取本品0.3220g,加水15ml，乙醚30ml与甲基橙3滴，用0.1062mol/L盐酸滴定，至水层显橙红色，分取水层，置具塞锥形瓶中，加乙醚20ml，振摇，继续滴定至持续橙红色，消耗盐酸体积21.00ml。计算盐酸滴定液的滴定度？样品中苯甲酸钠含量？苯甲酸钠分子量144.1。99.80%片剂含量测定结果的计算 例：烟酸片含量测定 取本品10片,精密称定为3.5840g,研细,精密称取0.3729g,置100 mL锥形瓶中,置水浴加热溶解后,放冷.加酚酞指示剂

6、3滴,用氢氧化钠滴定液（0.1005mol/L),滴定至粉红色,消耗25.02 mL.每1mL氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)相当12.31mg的烟酸. 求供试品中烟酸的标示百分含量（标示量0.3g/片）标示量%=V T F 平均片重W 标示量 100 %=25.02 12.31/1000 0.1005/0.10.3584 0.3729 0.3= 99.17%100 %干酵母片含量测定：取本品10片，精密称定，重5.0160g，研细，精密称取片粉0.5001g，凯氏定氮法测定，以2%硼酸溶液50ml为吸收液，甲基红-溴甲酚绿为指示剂，用硫酸滴定液（0.05mol/L）滴定，消耗硫酸滴定液（F

7、=1.029）14.28ml，空白消耗0.08ml，每1ml硫酸滴定液（0.05mol/L）相当于1.401mg的氮，蛋白质中氮含量为16%，干酵母片规格为0.3g，回答下列问题： （1）2%硼酸溶液50ml是否需精密量取？为什么？ （2）若要求相当于干酵母0.5g的片粉，根据上述有关条件，计算应称取片粉多少克？ （3）凯氏定氮法中硫酸、无水硫酸钠、硫酸铜分别起什么作用？ （4）求干酵母片中蛋白质含量相当于标示量的百分含量？42.79% 二、光谱分析法 （一）紫外-可见分光光度法（200nm-760nm) 1. 特点 灵敏度，可达10-4g/ml-10-7g/ml 准确度，RSD（%）为2%-

8、5% 仪器价格低廉操作简单，易普及，应用广 2. 定量：朗伯-比耳定律 A = E1%1cmCL 3. 仪器校正和检定波长校正：用汞灯中较强谱线237.38, 253.65, 275.28, 296.73, 313.16, 334.15, 365.02, 404.66, 425.83, 546.07nm与576.96nm或用仪器中氘灯的486.02nm与656.10nm进行校正。汞灯谱线吸收度的检定：用K2CrO7(60mg)+0.005mol/L H2SO4液至1000ml 波长(nm) 235(最小) 257(最大) 313(最小) 350(最大) E1%1cm 124.5 144.0 4

9、8.62 106.6 123.0-126.0 142.8-146.2 47.0-50.3 105.5-108.5杂散光检查： 试剂 浓度(g/ml) 测定波长 透光率(%) NaI 1.00 220nm 0.8 NaNO2 5.00 340nm 0.8 4. 对溶剂的要求: 220240nm 241250nm 251300nm 300nm以上 溶剂+吸收池A 0.41 0.20 0.10 0.05 5. 测定方法 要求供试品溶液的A应在0.3 0.7，狭缝宽度为半峰宽的1/10 常用方法 对照品比较法：Cx=(Ax/Ar)Cr; 含量%=Cx D/W 100 %吸收系数法： Cx=Ax / (

10、E1%1cm)x 100；含量%= Ax / (E1%1cm )x 100 D/W 100 %计算分光光度法：VA的三点校正法比色法：加入相应的显色试剂定量计算方法：（1）对照品比较法（2）吸收系数法 （二）荧光分光光度法1. 特点 灵敏度高，可达10-10g/ml-10-12g/ml 在低浓度进行测定，防止自熄灭作用,F与C不成正比的情况用基准物溶液校正仪器灵敏度，防止样品液荧光衰减 灵敏度高，但干扰因素多制备荧光衍生物，可提高其灵敏度和选择性用样品量少 2.荧光分析仪 有二个单色光器激发单色光器与发射单色光器；且激发光源、样品池和检测器成直角。含量测定 常用的方法对照品比较法:Ci = (

11、Ri-Rib)/(Rr-Rrb)Cr Ch.P收载地高辛片、利血平片、洋地黄毒苷片。 （三）色谱分析法 按分离原理分为：吸附；分配；离子交换；排阻色谱 方法分类 按分离方法分为：PC；TLC；柱色谱；GC，HPLC。 （一）HPLC法 1. 对HPLC仪器一般要求 色谱柱、流动相按品种项下要求。 色谱柱的理论板数：n = 5.54(tR /Wh/2)2 分离度：R = 2（tR2 tR1)/(W1 + W2); 要大于1.5 重复性：RSD2% 拖尾因子：T = W0.05h/2d1 应在0.95 1.05 2. 系统适用性试验 内标法加校正因子测定供试品中主成分含量3. 测定方法 标准曲线法

12、 外标法测定供试品中主成分含量 外标一点法 含量= CRAXAR 外标一点法：一种浓度对照物对比样品中待测组分含量前提：截距接近0，对照品浓度与待测组分浓度接近内标法：对内标物要求：a内标物须为原样品中不含组分b内标物与待测物保留时间应接近且R1.5c内标物为高纯度标准物质，或含量已知物质校正因子（f）=AS/CSAR/CR含量（CX）=fAS/CSAX内标法优点：进样量不超量时，重复性及操作条件对结果无影响只需待测组分和内标物出峰，与其他组分是否出峰无关 。内标法缺点：制样要求高；须寻找合适内标物外标法特点： 不需要校正因子，不需要所有组分出峰 结果受进样量、进样重复性和操作条件影响大 每次

13、进样量应一致，否则产生误差 色谱操作：醋酸氢化可的松的含量采用HPLC法测定：取本品对照品适量，精密称定，加甲醇定量稀释成每ml约含0.35mg的溶液。精密量取该溶液和内标溶液（0.30mg/ml炔诺酮甲醇溶液）各5ml，置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，取10ul注入液相色谱仪，记录色谱图。 另取本品适量，同法测定，按内标法计算含量。已知：对照品取样为36.2mg，样品取样为35.5mg，测得对照液中醋酸氢化可的松和内标的峰面积分别为5467824和6125843，样品液中药物和内标的峰面积分别为5221345和6122845，计算本品的含量 5467824/36.2/(612584

14、3/s)=5221345/c2/(6122845/s)含量=C2/35.5*100%97.42%（二）GC法1. 对GC仪器一般要求 色谱柱、流动相、柱温、载气、检测器，均按品种项下要求。2. 测定法 除了HPLC方法外，还有标准加入法。需验证的分析项目1. 鉴别试验；2. 杂质定量或限度检查；3. 原料或制剂中有效成分含量测定；4. 制剂中其它成分（降解产物、防腐剂等）的测定；5. 溶出度、释放度等功能检查中的溶出量等的测试方法。 第三节 药品分析方法的验证 准确度 精密度（包括重复性、中间精密度和重现性） 专属性 检出限 定量限 线性 范围 耐用性验证内容一、准确度 （Accuracy）

15、是指用该方法测定结果与真实值接近的程度，用回收率表示（一）含量测定方法的准确度 1. 原料药 可用已知纯度对照品或样品进行测定；或与已建准确 度的另一方法测定的结果进行比较。 2. 制剂 要考察辅料对回收率的影响。采用在空白辅料中加入原 料对照品的方法作回收率试验，然后计算RSD。 （二）杂质定量测定方法：标准加入法或主成分百分含量法；明确表示单个杂质或杂质总量相当于主成分的重量比或面积比 （三）数据要求测定高、中、低三个浓度（n=3）, 共9个数据来评价，回收率的RSD2%；用UV和HPLC法时，一般回收率可达98%102%；容量法可达99.7%100.3%。 二、精密度（Precision

16、） 是指在规定的测试条件下，同一个均匀样品，经多次测定结果 之间的接近程度。 （一）精密度表示方法 1. 偏差(deviation , d) d = 测得值-平均值=Xi-X 2. 标准偏差（standard deviation, SD或S） S =(Xi X)2/(n-1)1/2 3. 相对标准差(relative standard deviation, RSD) RSD=标准偏差/平均值100%=S/X 100%（二）重复性、中间精密度及重现性 1. 重复性 在相同条件下,由一个分析人员测定所得结果的精密度。 2. 中间精密度 在同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备测定结果的精密

17、度。 3. 重现性 在不同实验室由不同分析人员测定结果的精密度。 三、专属性 （Specificity） 是指在其他成分(如杂质、降解产物、辅料等)可能存在下，采用的方法能准确测定出被测物的特性。鉴别反应、杂质检查、含量测定方法，均应考察其专属性。（一）鉴别反应 应能与其它共存的物质或相似化合物区分，不含被测组分的样品均应呈现负反应。（二）含量测定和杂质测定 色谱法和其他分离法，应附代表性的图谱，以说明专属性。图中应注明各组分的位置，色谱法中分离度应符合要求。在能获得杂质的情况下，可加到试样中，考察对结果的干扰。在杂质和降解物不能获得的情况下，可用已验证的方法和药典方法进行对照；也可用对试样加

18、速破坏的方法进行验证。 是指试样中被测物能被检测出的最低浓度或量，是限度检验效能指标。它无需测定，只要指出高于或低于该规定的浓度或量即可。 （一）常用的方法1.非仪器分析目视法 用已知浓度被测物，试验出能被可靠地检测出的最低浓度或量。2.仪器分析方法 GC和HPLC法： LOD = S/N = 2或3 四、检测限 （limit of detection，LOD） 是指样品中被测物能被定量测定的最低量，其测定结果应具一定准确度和精密度。杂质和降解产物进行定量测定时，要求LOQ。 常用信噪比法确定定量限，一般以S/N=10时，相应的浓度进行测定。 五、定量限 （limit of quantitat

19、ion，LOQ） 是指在设定的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度。 UV法：首先制备一个标准系列，浓度点n=5; A=0.3-0.7，建立回归方程C=aA+b; r0.999。 HPLC法：制备一个标准系列，浓度点n=5-7; 以C对h或A或与内标物的峰面积之比，建立回归方程r0.999。 六、线性 （linearity） 是指达到一定精密度、准确度和线性、测试方法适用的高低限度或量的区间。原料药和制剂含量测定：范围应为测试浓度的80%-120%。制剂含量均匀度检查：范围应为测试浓度的70%-130%。溶出度或释放度中的溶出量测定：范围应为限度的20%。 七、范围 （Range） 是指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。典型的变动因素有：被测溶液的稳定性、样品提取次数、时间等。 HPLC法变动因素有：流动相组成与pH，色谱柱，柱温，流速等。 GC法变动因素有：色谱柱，固定相，担体、柱温、进样口和检测器温度等。 八、耐用性 （durability）分析方法效能指标的要求 1、非定量方法：用于鉴别试验、杂质的限量检查，只对专属性、耐用性和检测限有要求，其余均无须要求。 2、用于原料药中主成分或制剂中有效成分含量测定及溶出度测定，除了检测限和定量限外，其余均要求。 3、杂质测定或制剂中降