克隆抗体技术原理及流程

1、克隆抗体技术原理及流程(二)三、操作流程脾细胞材料免疫过的血清抗体滴度高的Balb/c鼠。1640培养液2.5%FCS1640 营养液操作方法拉颈或用CO2处死小白鼠将小鼠放于70%酒精中浸泡消毒，取出固定于板上，在无菌条件下取脾。把脾放入5ml含有2.5%FCS的1640液中，冰浴下轻轻洗去脾上的红血球。用镊子轻轻挤压脾，做成脾细胞悬液，用毛细管将悬液移入小试管中。直立小试管3min，使大块的结缔组织下沉，把细胞悬液移入离心管中。以2.5%FCS1640充满离心管，并以400g离心7min10min (与此同时应开始制备骨 髓细胞)。把沉淀用约10ml的新鲜培养液再悬浮重复、步骤。计算细胞，

2、以台盼兰染色用相差显微镜检查，活细胞数应高于80%为合格骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞能产生并分泌大量的免疫球蛋白，这样的瘤细胞融合后，可能影响或降低所分泌 抗体的滴度，所以必须选育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤细胞选择骨髓瘤细胞的条件：该瘤细胞系的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系，以便两者的组织相容性抗原一致；骨髓瘤细胞必须是静息状态，不产生Y球蛋白或不分泌到细胞外；骨髓瘤细胞生长需要一个较高的细胞密度，最好106个细胞/ml；生长速度快，繁殖时间短。目前常用的Balb/c小鼠产生的骨髓瘤细胞株有：S194/5XXO BU 1；SP2 / 0Ag14 (简称 SP2)；P2X? Ag8 -6-5-3

3、 (简称 653)；FO以653最为常用，它是由矿物油4甲基一15烷（Pristane,降植烷）诱发出来的一 种浆细胞瘤（Minerol Oil plasmacy toma MOPC）并经过培育形成一株8-氮鸟嘌吟有抵抗 力的亚系。骨髓瘤细胞一般由有关单位直接引入，保存于-195C液氮罐中，试验时复苏、增 殖、传代即可由于骨髓瘤细胞是半贴壁状态，很容易脱落，因此不需要胰酶处理。为了防止 出现返祖现象，在融合前，可将培养基内加入15g/ml8 一氮鸟嘌吟。取约1X1076X107 对数生长期（即培养15h20h）的骨髓瘤细胞，在室温离心（400g） 10min，沉淀以2.5% FCS1640液再

4、悬浮并计数。（三）饲养细胞在体外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖，必须加入 其它活的细胞才能使其生长繁殖，加入的细胞称之为饲养细胞（Feeder cell）。在细胞融 合和单克隆的选择过程中，就是在少量的或单个细胞的基础上使其生长繁殖成群体，因此在 这一过程中必须使用饲养细胞。许多种类的动物细胞都可以做饲养细胞，如正常的脾细胞、 胸腺细胞、腹腔渗出细胞等，常选用腹腔渗出细胞，其中主要是巨噬细胞和淋巴细胞。应用腹腔渗出细胞的好处是：一方面做饲养细胞，另一方面巨噬细胞可以吞噬死亡的细 胞和细胞碎片，为融合细胞的生长造成良好的环境。腹腔细胞的来源可以是与骨髓瘤细胞同 系鼠。也可以是

5、其他种类的小鼠，如C57鼠，昆明小白鼠等。材料（1）小鼠（Balb/c或C57小白鼠）若干只。（2） 11.6%蔗糖溶液（经10磅30min 高压灭菌）。操作方法（1）拉颈处死小鼠。（2）70%酒精浸泡消毒10min。（3）用手术剪将小鼠腹部剪开一小口，剥开皮肤，露出腹腔.（4）用注射器将4ml 11.6%蔗糖溶液注入腹腔，用手指轻揉1min仍用该注射器回抽腹腔 液体，加入离心管。（5）1 000r / min 离心 10min。（6）取上清，以HAT选择培养液将细胞制成悬液。台盼蓝染色计数活细胞，使每毫升含40 万个活细胞。（7）以1ml吸管将细胞种入微量培养皿，每孔0.05ml，含2万个细

6、胞，放入CO2培养箱培 养，即可供细胞融合和克隆化之用。如果在融合后发现在培养孔中饲养细胞数量少，则可以 在细胞换液时再加入一些。（四）融合细胞.融合剂细胞融合的方法有物理法，如电融合、激光融合，化学融合法和生物融合法，如仙台病毒， 此处例举化学融合法中的一种即聚乙二醇融合法。聚乙二醇(PEG)，在分子量为200700时，呈无色、无臭的粘稠状液体，分子量大于1 000 时，呈乳白色蜡状固体，能溶于水、乙醇及其他许多有机溶剂，对热稳定，与许多化学药品 不起作用。用作细胞融合剂的聚乙二醇一般选用分子量为4 000者，常用浓度为50%， pH8.0pH8.2 (用10%NaHCO3调整)，分子量小的

7、PEG，融合效应差，又有毒性，分子量过 大，则粘性太大，不易操作。50%浓度，pH偏碱时融合效应最高。也有采用30%50%浓度 的PEG加上10%二甲亚飒。不同批号的PEG，即使分子量相同，但融合率却有明显差异，选用时必须注意。每批都必须 进行细胞毒性试验后方可应用。要买高纯度的，一般选供气相色谱用的PEG2.融合过程融合的方法很多，常用的有转动法和离心法。.试剂与材料供融合用的脾细胞及骨髓瘤细胞。1640 培养液 100ml完全 1640 液 100ml2.5%FCS1640 液 50ml。HAT 培养液 100ml。50 % PEG :取分子量4 000，高纯度的PEG10g放入25ml瓶

8、中高压灭菌，使用前用预热 于40C的1640液10ml等量(W/V)混合，以酚红检查pH，一般不必调pH。如pH有改变， 可用HCl或NaHCO3调整。10ml和50ml的灭菌沉淀管或瓶。40孔塑料培养盘。2.操作方法准备好脾细胞。 在50ml沉淀管中混合108脾细胞和107小鼠骨髓瘤细胞，并加入50ml 2.5%FCS1640 液。 室温400g离心3min，使细胞沉淀。移去上清液轻敲管底部，使沉淀流动，把沉淀管放于40r水浴中，使其达融合温度。加预热至40 r的50 % PEG 0.8ml，用1ml吸管缓慢滴加，边加边摇沉淀管，肉眼观察可见有颗粒出现，滴加过程要求持续2min 加1ml16

9、40液，边加边摇动，持续1min。重复一次。加1ml 1640液，边加边摇动，持续0.5min。.技术上的误差常常导致融合的失败。例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要 失败的。2.融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜 的无菌操作技术四、杂交瘤细胞的保存(一)保存当获得产生所需的单克隆抗体的杂交瘤细胞后，必须将一部分杂交瘤细胞保存， 否则在连续传代的过程中，可能产生突变或染色体的漂移以至丧失固有特性或丢失产生抗体 的特性。另外在长期的培养过程中，难免不发生污染以至于毁灭。所以必须冷藏保存一部分。保存方法如下：材料细胞：取对数生长期的细胞10%二甲基亚

10、飒保护液(二甲基亚飒能损坏滤器，而又被高压所破坏，所以不能过滤或 高压消毒。其本身就是毒品，无菌)：含10%二甲基亚飒、20%灭活胎牛血清，70%RPMI 1640 液。20%FCS1640 培养液：含青霉素 100U/ml，链霉素 100g/ml。灭菌的2ml安瓶等操作方法去掉细胞培养瓶中的旧的培养液，加入10%FCS1640液，使细胞悬浮。1 000r/min离心10min，去上清。细胞沉淀用10%二甲基亚飒保护液制成悬液，使成 1.0X107 细胞/ml。取样，台盼兰染色，计数活细胞，应在95%以上。用注射器将细胞分装安瓶，每瓶0.5ml1.0ml，熔封安瓶放 4C 2h。放液氮罐气态部分(-70C) 1