现代生物技术制药工艺学

1、现代生物技术制药工艺学1第一讲 生物技术制药概论第二讲 基因工程生物构建第三讲 基因工程菌发酵制药工艺第四讲 基因工程动物细胞培养制 药工艺第五讲 基因工程药物检测与质量控制2第一讲 生物技术制药概论第一节 生物技术药物 一、生物技术药物 1.分类 生物技术药物：利用生物机体、组织、细胞，生产制造或从中分离得到的具有预防、治疗和诊断功能的药品，包括具有生物活性的初级代谢和次级代谢产物、天然活性化合物及其类似物。3生物药物： 20世纪80年代，用现代生物技术生产的治疗性药物，基于重组DNA技术和杂交瘤技术生产的药物，不包括直接从天然组织、血液等中提取的治疗性蛋白质。 随着生物技术的发展，以核酸为

2、基础的治疗性药物也属于生物药物。 除了治疗性药物外，也包括体外诊断试剂。 4 在制药领域，生物技术药物、生物技术产品、生物技术制品互换使用。 美国制药研究与制造者（PhTMA）在其相关的报告中经常使用生物技术药物。 生物技术药物包括重组DNA、单克隆抗体、杂交瘤和细胞系生产的药物，也包括细胞和组织来源的药物及基因治疗药物。虽然与生物药物的范畴有重叠，但生物技术药物的范围更大。生物药物是1520年以前药物的一个亚类，生物技术药物的历史较长、含义广。5 生物技术就是整合自然科学和工程科学，获得应用生物，生产细胞产品和分子产品。所以生物技术药物应该包括任何生物技术手段和方法（部分或全部）生产的药物，

3、包括传统生物技术方法，如非重组蛋白，从天然资源如微生物中分离提取的抗生素或半合成抗生素，植物来源的提取药物和细胞培养药物。 按照来源可把生物技术药物分为微生物药物、植物药物和动物（包括人）药物等。 6制造工艺：化学合成药物、生物合成药物、半合成药物和中药制造生产技术:微生物发酵药物、植物组织培养药物、动物细胞培养药物、动物组织和血液制剂药物、免疫抗体药物等。化学本质和特征：重组药物、基因药物、天然药物和合成、半合成药物。7重组药物：重组多肽和蛋白质药物、细胞因子、受体、单克隆抗体和基因工程抗体、重组疫苗和重组多价疫苗等。基因药物：反义核酸药物、基因治疗药物、DNA疫苗和核酶等。天然药物：来自动

4、物、植物、微生物和海洋生物的天然产物。生化药物：包括从动物组织或脏器等中分离提取的氨基酸类、多肽和蛋白质类、酶与辅酶类、核酸及其衍生物类、多糖类、脂类、生长因子类等8药物生物技术药物生物药物重组蛋白质是是单克隆抗体是是天然材料中直接提取的多肽、蛋白质是否治疗性基因药物是是反义寡核苷酸（直接化学合成）是否反义寡核苷酸（生物酶法合成）是是直接化学合成的多肽否否天然材料中获得的抗生素、半合成抗生素是否植物来源的天然药物或半合成药物是否细胞或组织制剂是否9 在有关法规中，经常出现的术语是生物制品 (中国、美国使用)或生物反应修饰剂（美国使用）、生物医药产品（欧盟使用）。 美国FDA对生物制品的定义是病

5、毒、治疗性血清、毒素、抗毒素、疫苗、血液、血液成分及其衍生物、变应原性制剂及类似产品、胂凡钠明及其衍生物，用于预防、治疗疾病。这个定义并没有包括所有生物来源的药物。传统的生物制品包括疫苗、类毒素、血液制品和代谢制剂，但现在也包括重组蛋白质和核酸药物。生物反应修饰剂是激素、神经活性物质、免疫活性物质的总称，它们在细胞水平上起作用。 10 中国的生物制品规程也对生物制品的定义： 以微生物、寄生虫、动物毒素、生物组织为起始材料，采用生物学工艺或分离纯化技术制备，并以生物学技术和分析技术控制中间产物和成品质量制成的生物活性制剂，包括菌苗、疫苗、毒素、类毒素、免疫血清、血液制品、免疫球蛋白、抗原、抗体、

6、变态反应原、细胞因子、激素、酶、发酵产品、单克隆抗体、DNA重组产品和体外免疫诊断制品等。 11生物制品分类：预防用生物制品治疗用生物制品诊断用品菌苗抗血清与抗毒素细菌学试剂疫苗血液制品免疫试剂类毒素细胞因子临床化学试剂122.重要的微生物药物 抗生素：链霉素，头孢霉素；链霉菌，青霉菌氨基酸：谷氨酸等20余种，放线菌，真菌维生素：维生素A，B2，霉菌，丙酸菌，酵母核苷酸和核苷：肌苷酸和肌苷，杆菌，放线菌，酵母，青霉酶：淀粉酶，纤维素酶，蛋白酶，天门冬酰胺酶，链激酶，葡激酶；米曲霉，黑曲霉，链霉菌酶抑制剂：洛伐他丁，辛伐他丁；曲霉，链霉菌免疫调节剂：环孢菌素A；光泽柱孢菌，链霉菌13抗生素:一类

7、在低浓度下就能选择性地抑制或影响其它生物的生命过程的次级代谢产物。天然抗生素约9000种，半合成抗生素有7000多种，具有临床应用价值的近500种，已经大规模工业生产的抗生素达100多种。14种类药物举例生产菌抗菌机理与应用内酰胺类头孢霉素 头孢霉抑制细胞壁氨基糖苷类链霉素链霉菌抑制蛋白合成大环内酯类红霉素链霉菌抑制蛋白合成多烯类两性霉素链霉菌破坏细胞膜四环素类四环素链霉菌抑制蛋白合成糖肽类万古霉素无枝酸菌抑制细胞壁多肽类杆菌肽杆菌破坏细胞膜蒽环类柔红霉素链霉菌抑制RNA和DNA合成。153.重要的植物药物很多植物来源的药物已经能化学合成，还有一部分直接分离提取，或修饰加工的半合成药物。其中部

8、分已经用植物细胞大规模培养进行生产。生物碱：阿托品，可卡因，吐根，奎宁，长春碱，长春新碱，喜树碱，秋水仙碱水杨酸：阿司匹林；萜类:紫杉醇香豆素:双香豆素甾体:地高辛，洋地黄苷酶：脲酶, 无花果蛋白酶164.重要的动物药物从动物组织或器官中直接分离提取，蛋白质类药物可以用基因工程技术制造，非蛋白质药物包括甾体类激素、皮质类甾体和前列腺素等，大多数已化学合成。胰腺：胰岛素，高血糖素，胰蛋白酶，胰酯酶，胰凝乳酶，Dnase，弹性蛋白酶脑：脑磷脂，神经磷脂垂体：生长素，促黄体激素，加压素，促卵泡激素，促皮质激素 肝脏：维生素，肝细胞生长因子，肝素，RNA17胸腺：胸腺素，胸腺肽血液：凝血酶，凝血因子，

9、血红素，血红蛋白，SOD，血浆，白蛋白，免疫球蛋白，纤溶酶甲状腺、鳃：降钙素胃黏膜：胃蛋白酶，胃膜素，双岐因子，凝乳酶尿：绒膜促性激素，尿激酶心脏：细胞色素C，辅酶Q蛋清：溶菌酶18二、重要的重组生物药物1. 激素类药物激素是由内分泌腺或特异细胞产生的含量极低一类小分子，通过信使功能，起专一生理效应。人胰岛素：胰岛细胞，前胰岛素原跨膜运输，切除23 aa信号肽，86 aa的胰岛素原。高尔基体形成二硫键，切除C肽，成熟的胰岛素分泌到胞外，进入血液循环。成熟的胰岛素由AB双链组成，A链21 aa，B链30 aa，3对二硫键。生理功能广泛，能促进糖原合成和糖酵解，产生ATP，降低血糖含量，保持能量供

10、应。重组人胰岛素:发达国家取代猪或牛胰岛素，用于临床，主要治疗I型糖尿病。19生长素:垂体前叶分泌的一种促进生长的激素。人生长素是191 aa的单链球蛋白，2对二硫键。生长素具有促进氨基酸的运输和蛋白质、核酸的合成代谢，刺激新骨形成和红细胞生成，加速生长。重组人生长素用于治疗侏儒病、慢性肾功能衰竭、烧伤、创伤等。心钠素即心房利钠多肽（心房利钠因子）：是一个家族，心钠素、脑钠素、C型利钠肽。心钠素家族的三个成员分子为环状结构，N端和C端为链状，1对二硫键在环内，存在高度保守序列和区域。人心钠素由28个氨基酸残基组成，人脑钠素由32个氨基酸残基组成。重组人心钠素日本上市，用于心衰治疗，我国也进入临

11、床实验。 20降钙素:甲状腺滤泡旁细胞产生的激素，生理功能是调节钙磷代谢，维持内环境的稳定。33 aa的多肽激素，不同种类活性差异较大，非脊椎动物如鱼类比哺乳动物的活性高。目前使用的是天然提取的猪、人、鳗鱼、化学合成的等。基因工程重组鲑鱼钙降素于1999年在欧洲上市。主要用于骨质疏松、高钙血症、Pagets病等，骨量减少，更新机能障碍等疾病的治疗。高血糖素：低血糖症；促甲状腺素：治疗和诊断促卵泡激素：停止排卵和超排卵21种类商品名胰岛素Humulin，Novolin，Humalog，Lantus生长素Humatrope，Nutropin，Saizen, Bio Tropin，Genotropi

12、n，Norditropin， Protropin, Serostim高血糖素Glucogen促甲状腺素Thyrogen促卵泡激素Conal F，Puregon, Follistin222.细胞因子药物细胞因子：各种细胞合成并分泌的小分子多肽类因子，调节机体的生理功能，参与细胞的增殖、分化、免疫、移植排斥、凋亡等过程。干扰素：IFN-， ，。IFN-约有25种亚型，165166 aa，2个二硫键，无N糖化位点。IFN-有4个亚型，166 aa，1个二硫键。IFN-有4以上个亚型，由143个氨基酸残基组成，无二硫键，2个N糖化位点。重组、干扰素均已上市，治疗白血病、慢性病毒感染如乙肝、丙肝、单纯疱

13、症病毒等，治疗多发性硬化症，治疗类风湿关节炎等。23白细胞介素:介导白细胞之间相互作用的一些细胞因子,现已命名至IL23。只有IL-2和IL-11被开发成基因工程药物而上市。IL2由133 aa组成，1个链内二硫键，糖蛋白。IL11由178 aa组成，无二硫键和糖基化。IL2用于癌症辅助治疗，IL11与GCSF联合使用，纠正化疗导致的粒细胞和血小板减少症。集落刺激因子:是指能刺激造血细胞在半固体培养基上形成细胞集落的细胞因子，是一类造血细胞生长因子。MCSF，GMCSF，MultiCSF，EPO，SCF，TPO等。24粒细胞集落刺激因子G-CSF是174 aa，2对二硫键。GM-CSF是127

14、 aa， 2对二硫键。M-CSF是522 aa，3对二硫键。它们都具有N糖化位点，有信号肽，分泌时被切除。重组人G-CSF、GM-CSF、M-CSF均已上市，刺激骨髓中粒细胞和巨噬细胞增殖，集落形成，增强免疫，用于血细胞减少症、再生障碍性贫血及化疗放疗癌症的辅助治疗。EPO是165 aa的高度糖基化蛋白，2个二硫键，糖基（主要为唾液酸）对活性至关重要。重组EPO用于治疗透析性贫血或其他贫血，是治疗肾功能衰竭导致贫血的首选药物。25SCF:重组人SCF主要作用于早期造血干细胞，范围广，但专异性差，还具有种属特异性，单独使用活性低。可与其他因子协同作用产生不同的联合效应。一般与G-SCF联合使用，

15、刺激粒细胞增殖。与EPO联合，刺激早期红细胞的增殖，对细胞肥大也有增殖作用。生长因子GF:对细胞生长具有促进作用的因子，表皮生长因子EGF、成纤维细胞生长因子FGF、转化生长因子TGF、血小板生成素TPO。EGF：53 aa，3对二硫键。重组人EGF已在国内外上市，大肠杆菌和酵母细胞表达。主要外用，治疗烧伤、溃疡和外伤及外周神经系统疾病。26FGF：碱性成纤维细胞生长因子bFGF和酸性成纤维细胞生长因子aFGF，等电点分别为5.4和9.8，它们的生物学活性相似。其实FGF是一个家族，其成员已经鉴定出22个，重组FGF主要外用，治疗烧伤及外周神经系统疾病。TNF：肿瘤坏死因子，杀灭肿瘤。巨噬细胞

16、产生TNF-，T细胞产生TNF-。TNF具有广泛生物学效应，参与免疫细胞激活和炎症反应，具有抗感染、抗病毒、抗肿瘤的作用。国外重组TNF已进入临床阶段，用于肿瘤治疗，与化疗联合使用。TPO：332 aa。重组TPO已进入临床阶段，主要用于肿瘤病人的化疗所致血小板减少症。27种类商品名IFN-1b赛诺金，干扰灵IFN-2aReferon A，福康泰，来福隆，迪恩安，因特粉，贝尔芬IFN-2bIntron A，Rebetron，Alfatronol，Virtron，安达芬，隆化诺，保守IFN-InfergenIFN-Betaferon，Betaseron，Avonex，RedifIFN-1bAct

17、immuneIL-2Proleukin，辛格尔，德路生，悦康仙，英路因，安特鲁克IL-11NeumegaEPOEpogen，Procrit，Neorecormon，宁红欣，依普定，益比奥GM-CSFLeukine，里亚尔G-CSFNeupogen，吉粒芬PDGFRegranexTNF-Beromun283.溶血栓药物类溶血栓药物是纤溶酶原激活剂PA通过激活无活性的血浆纤溶酶原PLG，形成有活性的纤溶酶PLM.催化血栓的主要基质纤维蛋白水解，使血栓溶解，畅通血管。纤溶酶原激活剂有:组织型纤溶酶原激活剂tPA; 尿激酶原激活剂uPA，哺乳动物产生的可直接激活PLG，而由细菌产生的链激酶SK和葡激酶

18、SAK，可间接激活PLG。TPA:527 aa的糖蛋白，有17对二硫键，3个糖基化位点。细菌表达产物野生型tPA分子量大，未形成产品。哺乳动物细胞（CHO）表达重组tPA已在美国于1987年上市，第一个用动物细胞大规模生产的重组蛋白质药物。29改型tPA:rPA和TNK-tPA。RPA:是tPA cDNA缺失突变后，用大肠杆菌表达的单链无糖基化蛋白质，355aa，效果与重组tPA相同，生产成本低，血浆中半衰期延长。TNK-tPA: 是tPA个别氨基酸突变后，由CHO表达的糖基化双链蛋白。527 aa。PA、tPA、rPA和TNK-tPA均已上市。uPA:是从人胚肾细胞培养液或新鲜尿液中提取的溶

19、栓药。单链尿激酶型纤溶酶原激活剂由411个氨基酸残基组成，有12对二硫键.目前美国Abbot公司从人胚肾细胞培养株生产scu-PA，德国Grunenthal公司用大肠杆菌表达scu-PA，活性高于哺乳动物细胞表达的糖基化scu-PA。30SK:从溶血性链球菌培养液中提取分得到，415 aa，是最早用于临床的溶栓药。SAK:金黄色葡萄球菌溶原性噬菌体所分泌的，136 aa，是单链无二硫键的蛋白质。直接从细菌培养液中分离纯化困难，含量很低。现已经克隆了该基因，并实现了大肠杆菌和枯草杆菌表达，工程菌的产量占总蛋白质的10%15。水蛭素:从水蛭中发现的一种凝血酶抑制剂，是溶血栓的有效辅助药物。天然水蛭

20、素是酸性多肽，含有65个氨基酸。水蛭素可用大肠杆菌和酵母表达，1998年美国、德国等批准重组脱硫酸酯水蛭素上市，应用于预防血栓和肝素相关的血小板减少症。314.受体、黏附分子药物细胞表面分子包括受体和黏附分子。受体与其配体结合后，经信号传导，引起细胞的功能和行为发生改变。黏附分子是由细胞产生的介导细胞与细胞间或细胞与基质间相互接触和结合的一类分子，分布于细胞表面。很多黏附分子就是受体。根据人类白细胞分化抗原的国际协作组会议的命名，把识别同一分化抗原的单克隆抗体归为同一个分化群CD，许多黏附分子和受体被命名为CD分子。在多数情况下，CD分子和黏附分子或受体的名称可以通用。32 重组CD分子与天然

21、的CD竞争性结合配体，作为阻断剂，封闭信号传导，治疗天然CD分子功能异常引发的疾病。与抗体相比，重组CD分子没有免疫应答反应，安全性好。但存在问题要求真核表达系统，技术设备和条件要求高，规模生产较困难，成本高；半衰期短，给药量大。其策略是采用与抗体结合，在CD分子的C端融合IgG的Fc片段，表达融合蛋白，形成免疫黏附素。已上市的有Immunex公司的可溶性TNF受体IIFc融合蛋白，用于治疗类风湿关节炎和慢性心衰。其他的进入临床阶段的可溶性CD54、可溶性IL4受体、可溶性LFA3/IgG1融合蛋白等。335.重组融合蛋白药物将两种或两种以上的功能蛋白质的基因重组，产生新的融合蛋白质，可发挥超

22、越其单分子的生物学活性。主要有细胞因子之间融合，如IFN-/IL-2、IFN-/TNF2、IL-2/IL-6、GM-CSF/IL-3。细胞因子与抗原或抗体之间的融合，如Id/GM-CSF、Id/IL2、Id/IL4等，细胞因子部分可大大提高Id部分的抗原性。细胞因子与毒素或抑制因子之间融合，白喉毒素/IL-2、GM-CSF/LIF等。上市的重组融合蛋白药物有Ontak，IL-2融合的白喉毒蛋白，靶向治疗皮肤T细胞淋巴瘤。Enbrel是TNF可溶性受体融合IgG片段，治疗类风湿性关节炎。34三、疫苗 主要用于健康人群的一类预防性生物药物。包括蛋白质、多糖、核酸等。 根据病原生物体分类： 菌苗:细

23、菌性抗原制剂;疫苗:病毒性抗原制剂，但现在统称为疫苗。 根据制造技术分类： 传统疫苗包括灭活疫苗、减毒活疫苗和亚单位疫苗；新型疫苗是指用基因工程技术研制的疫苗，基因工程亚单位疫苗、载体疫苗、核酸疫苗、多抗联合疫苗、重组多价疫苗等。35基因工程疫苗：用重组DNA技术克隆保护性抗原基因，用表达出的抗原产物或重组体本身制备成疫苗。基因工程亚单位疫苗用微生物表达抗原，纯化后制备成疫苗。最成功的是酵母和CHO表达的乙肝表面抗原，纯化后制备的乙肝疫苗，高效、价廉、安全，已取代了传统的血源疫苗。蛋白质工程疫苗是对抗原基因进行改造，如突变、缺失、插入等，增加免疫原性，扩大反应谱。核酸疫苗或基因疫苗是用能够表达

24、抗原的基因制备成的疫苗。其本质是核酸，可以是DNA，也可以是RNA。36基因工程载体疫苗和基因缺失活疫苗：本质是菌苗，把抗原的基因重组到微生物体内，筛选得到用表达抗原基因的重组微生物，进而以微生物为载体制备成疫苗。多为活疫苗，载体为指定的微生物菌株，如痘苗病毒、脊灰病毒、腺病毒、卡介苗等。也可用非复制型载体，即微生物进入人体后，不能繁殖，但能进行DNA的复制、转录和蛋白质的表达，能产生抗原刺激机体发生免疫反应，提高了载体的安全性。DNA疫苗：将外源目的基因片段构建在DNA质粒中，重组后的DNA导入机体后可表达目标蛋白，刺激机体的免疫系统，而达到预防某种疾病的生物制剂。DNA疫苗是质粒DNA，它

25、含有宿主疫苗应答的抗原基因。37细菌减毒活疫苗卡介苗，伤寒疫苗，霍乱疫苗，布氏菌疫苗，炭疽疫苗，痢疾疫苗病毒减毒活疫苗牛痘疫苗，脊髓灰质炎疫苗，麻疹疫苗，腺病毒疫苗，风疹疫苗，黄热病疫苗，腮腺炎疫苗，甲肝疫苗，流感疫苗，水痘疫苗，轮状病毒疫苗，乙脑炎疫苗38病毒全灭活疫苗流感疫苗，脊髓灰质炎疫苗，甲肝疫苗，乙脑炎疫苗，流行性出血热疫苗，斑疹伤寒疫苗细菌全灭活疫苗霍乱疫苗，百日咳疫苗，鼠疫疫苗，伤寒疫苗上市的灭活疫苗39病毒亚单位疫苗乙肝疫苗，流感嗜血杆菌疫苗细菌亚单位疫苗肺炎链球菌疫苗，沙门氏Vi多糖疫苗，无细胞百日咳疫苗，A型和C型脑膜炎球菌疫苗病毒结合疫苗类毒素细菌结合疫苗B型流感嗜血杆菌

26、疫苗，破伤风疫苗，百喉疫苗上市的亚单位和结合疫苗40二联疫苗甲乙型肝炎联合疫苗，乙型肝炎、B型流感嗜血杆菌联合疫苗，麻疹、风疹联合疫苗。三联疫苗百白破联合疫苗，无细胞百白破联合疫苗，三价口服脊髓灰质炎减毒活疫苗，三价脊髓灰质炎灭活疫苗，麻疹、流行性腮腺炎、风疹联合疫苗。上市的联合疫苗41四联疫苗百白破、B型流感嗜血杆菌联合疫苗，百白破、乙型肝炎联合疫苗，百白破、灭活脊髓灰质炎联合疫苗。五联疫苗百白破、B型流感嗜血杆菌、乙型肝炎联合疫苗，联合疫苗，百白破、灭活脊髓灰质炎、B型流感嗜血杆菌联合疫苗。42种类药物应用乙肝Recombivax乙肝疫苗二联疫苗Comvax Procomvax抗乙型流感、

27、乙疫苗肝联合疫苗Tritantix抗乙肝、白喉、破伤风、百日咳疫苗联合疫苗Twinix抗甲乙肝免疫剂联合疫苗Primavax抗白喉、破伤风、乙肝疫苗含有HBsAg的重组疫苗 43四、基因药物包括细胞因子、活性多肽、受体的基因，也称DNA药物。广义的基因药物还包括反义核酸和基因转录调控的药物，主要针对基因遗传缺陷引起的疾病。将具有治疗意义的正常基因重组到真核表达载体上，用一定方法导入体细胞内，利用胞内的原料，进行基因的转录表达，合成并分泌释放蛋白质或肽产物，替换或封闭其中异常或致病基因，得到治疗相关疾病的目的。基因药物可望治疗400余种遗传疾病。医药产业的第四次革命。基因药物还处于实验研究阶段，

28、许多技术和伦理问题44反义核酸药物是指用反义技术研制的药物。根据碱基互补原理，用人工合成或生物合成的特定互补寡核苷酸片段，与特定的基因或RNA发生杂交，抑制或封闭基因表达，阻断相应有害蛋白质的合成，干扰了遗传信息从核酸向蛋白质的传递，达到治疗疾病的目的。反义寡核苷酸药物是以4种核苷酸为基础化学合成。天然的寡核苷酸很容易被体内的核酸酶降解，因此在合成的同时进行化学修饰，改变物化学性质，降低核酸酶的敏感性，增加稳定性、生物利用度和靶基因的结合特异性。FDA批准ISIS/CIBA Vision公司Vitravene上市，第一个反义核酸药物，治疗艾滋病人晚期发生的视网膜炎。45第二节 现代生物技术制药

29、的特征 药物制造过程包括基础设施的设计和布局、生物药物来源、上下游过程和最终产品的分析等几个阶段。药物的制造必须受到高度严格控制，不仅药品安全、有效，而且制造过程的各个方面也都必须是安全、有效的。在制造过程中，药典和GMP几乎是指导性的中心，对产品安全和有效性起关键作用。 现代生物制药的特点是技术含量高、智力密集，全封闭自动化、全程质量控制，大规模生物反应器生产和新型分离技术综合利用。46一、生物药物的特性与制造技术的关系生物药物的特性 生物材料本身成分复杂，除多糖、蛋白质、核酸、脂类等高分子化合物外，还有糖蛋白等复合物。 生物药物具有高活性，活性与结构有密切关系。低分子量的生物药物的活性往往

30、取决于其手性异构体，不同的离体异构体其活性截然不同甚至相反。高分子量的生物药物活性不仅取决于其一级结构，还与其高级（二级、三级、四级）空间结构（即构象）密切相关，空间构象的破坏往往导致药物失活。47 酸、碱、有机试剂、重金属、热、光等因素敏感。所处的环境和介质影响其结构，生产中的机械剪切力、金属器壁的摩擦力、传热传质等过程不仅会影响细胞的活性与功能，也影响药物的活性。生产条件的变化对质量影响大，在工艺放大过程中应严格监测质量的动态变化，在分离纯化等过程必须采用措施防止变性失活。 生物药物具有低稳定性，易受物理化学和生物因素的影响而变性失去活性。细胞破碎后，打破了原有的亚细胞布局，不再存在细胞隔

31、室，药物失去了空间保护。一旦提取出来后，离体的药物，容易受到理化因素的攻击，变性失去活性。48 生物药物具有易污染性，生物药物本身是活性生物分子，很易被腐生降解的低等生物所取食，引起腐败降解，同时可能产生热源和过敏原。 生物药物具有用量少、价值高的应用性。生物药物在治疗、预防和诊断中的所用剂量较少，显示出很高的商业经济价值，驱动着生物药的不断创新和发展。49 影响生物药物活性的因素 蛋白药物是以生物活性为基础的，下游及其制剂过程必须把活性下降降到最低限度。加工过程尽可能缩短处理时间，加入稳定剂，提高蛋白质的稳定性。蛋白质丧失活性和不稳定的原因包括共价键与非共价键的破坏与生成，均可引起蛋白质不可

32、逆降解和不稳定。蛋白质部分或全部蛋白变性共价键变化外消旋化，异构化脱酰胺作用，亚胺形成二硫键交换，糖链变化氧化，水解，光降解聚集表面吸附沉淀非共价键变化伸展卷曲50 蛋白质在空气中发生自动氧化过程，由空气中的氧自发引起的游离基链式反应。温度对蛋白质是个很敏感的因素，温度升高使分子内的震动增强，从而破坏维系空间结构的次级作用使蛋白质变性。日光中的紫外线能量最大，生物药物样品受光催化的反应有变色、氧化和分解等。多数蛋白质在等电点范围内才稳定，超出此范围会迅速变性，液体样品保存时常用缓冲液控制pH值。51 有机溶剂存在时，它们的极性及介电常数小于水，使肽链内的静电斥力增加，造成蛋白质分子膨化或松散。

33、 在溶液中加入盐类化合物也会影响蛋白质构象的稳定性。在低浓度的中性生理盐溶液中对蛋白质的构象不发生影响。但盐浓度较高时，盐离子有可能改变蛋白质内部的极性基团或改变溶剂性质使蛋白质稳定性发生变化，出现沉淀。 表面活性剂，如十二烷基硫酸钠（SDS）在低浓度时可与蛋白质结合，其表面带有大量负电荷，阻止了复合物分子之间的聚集而不致凝集或沉淀。52 蛋白质的酸、碱水解是肽键的水解，使分子断裂成为分子量大小不等的肽段和氨基酸，在蛋白酶存在下会加速水解。即使非常有限的蛋白酶都会引起蛋白质活性的丧失。各种蛋白质对蛋白酶的敏感性与空间结构有关，紧密的结构能抵抗蛋白酶的攻击。保护蛋白质降解的策略是减少加工过程时间

34、、并在低温下进行操作，使用一些特异性蛋白酶抑制剂。蛋白酶要在下游的早期除去，在后期的残存将严重影响产品活性。PMSF:丝氨酸蛋白酶、某些半胱氨酸蛋白酶苯甲眯:丝氨酸蛋白酶；胃酶抑制素:天门冬氨酸蛋白酶EDTA:金属蛋白酶53脱酰胺作用：谷氨酰胺与天冬门酰胺侧链酰胺的水解，形成谷氨酸与天冬门氨酸。较高温度、极端pH能促进脱酰胺作用水解。脱酰胺化作用是胰岛素降解的主要途径。氨基N进一步攻击侧链羰基，引起亚胺形成。亚胺引入新的负电荷可影响三级结构和稳定性。 蛋白质用碱水解时，会使某些L-氨基酸变为D-氨基酸产生消旋作用。 蛋白质中的氨基酸侧链容易被一些氧化剂氧化，分子氧和氧自由基氧化。蛋氨酸可氧化成

35、蛋氨酸亚砜使蛋白质失活，半胱氨酸可氧化成半胱磺酸或二硫键。可在最终产品中充N2气或添加抗氧化剂。54 蛋白质聚集:蛋白分子结合的微观过程，可以是二聚体或大的低聚物，但仍保留在溶液中而影响生物活性。 由于疏水的和静电作用，蛋白质和多肽吸附于容器、滤器或输液系统的表面，蛋白质溶液浓度较低时，吸附损失相对较高。 蛋白质与吸附表面之间的相互作用随表面疏水性和蛋白质疏水性的增加而增加。 膜滤过是现行蛋白质药物制剂灭菌滤过最常用的方法，在膜上蛋白质的吸附与失活是一个值得特别关注的问题。55稳定蛋白质药物的策略 为了较长时间保存蛋白质溶液，常常加入一些稳定剂进行保护。液体样品可用惰气驱除液中残存的氧，高浓度

36、保存也是一条可行方法。蛋白质类：血清白蛋白、明胶；金属螯合剂：EDTA；氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、赖氨酸、苏氨酸糖类：葡萄糖、蔗糖、海藻糖、右旋糖苷多元醇：甘油、山梨醇、肌醇、聚乙二醇表面活性剂：聚山梨醇酯；中性盐：硫酸铵防腐剂：乙醇、苯酚、硫柳汞、醋酸苯汞、乙酯、抗氧剂：焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠、半胱氨酸56二、生物制药的研发1研发过程 生物制药研发的基本过程包括新药发现、原始特征、临床前试验、临床试验、制造与上市申请、批准获得许可证、销售、售后监测,几个重要过程。 新药发现的策略：随机筛选，基于作用机理的药物鉴定，但生物药物的研发往往是基于作用机理。单因素的生物活性物质直接缺乏所致疾病，如缺乏

37、胰岛素导致糖尿病，缺乏生长素会导致侏儒症，由此开发胰岛素和生长素药物。多因素综合的复杂疾病，癌症和炎症。细胞因子类的干扰素和白介素，刺激免疫、调节炎症，治疗复杂疾病。57在很多情况下，生物药物的发现都是生理生化功能和分子进展的理性考虑，更准确地来说，就是机体自身的活性物质作为药物。2000年，人类基因组测序的完成和蛋白组学研究的兴起，为基于基因组和蛋白组的生物药物设计，特别是蛋白质类和核酸类药物提供了大量的生物信息，成为药物研发的一个新热点。植物、微生物也是生物药物地重要来源。在20世纪50年代以前，大量的药物就是从植物中发现的，如地高辛、洋地黄毒苷、阿司匹林、可待因和紫杉醇等。目前，美国10

38、0多种药物（约占25）最初来源于植物，尽管某些药物现在已经通过化学合成或半合成得以制造。58 植物是潜在药物最丰富的来源，显花植物约26.5万种，到目前为止不到1的物种被用于药物筛选。有两条途径从植物中筛选生物药物。一条途径种是收集营养体部分，最直接的随机筛选， 虽然象紫杉醇这样的药物是相当成功的，但总体来说，成功率仍较低。另一条途径是靶向筛选，如民族药材学(ethnobotany)，研究植物与人之间的关系。在这方面可以借鉴中药的经验，以提高中选率。 微生物特别是细菌和真菌已经证明是抗生素和抗癌药物的一个重要来源。目前发现并描述的微生物药物近15000种，大约2/3由放线菌产生，不少药物用于临

39、床。59 合理药物设计已经越来越成为药物发现的常规途径。大规模系统筛选天然或合成物质，已获得了大批现代药物。 在已知药物靶标的三维结构时，根据药物与靶标的相互作用，进行计算机模拟修饰已知药物，从而设计新药。靶标往往是蛋白质或酶或受体，X射线晶体结构和NMR分析结果都可用于设计。 有很多分子模拟软件可供药物设计，这种设计的产物是小分子配体，如受体抑制剂，能准确进入靶标的活性位点区域，从而阻断受体活性，发挥药效。60 对传统的随机药物筛选的一个改进就是组合化学库的高通量筛选，组合文库在较短时间内相对容易和低价合成，实际上许多大型制药公司拥有数十万个天然和合成的化合物。对于短多肽，化学合成也很容易。

40、此外，各种生物文库，如噬菌体展示文库、酵母展示文库、酵母双杂交系统等可用于蛋白质类药物的筛选和发现。 对已发现的蛋白质药物进行突变改造和其他蛋白质如抗体、受体等融合，提高活性、延长半衰期是一种切实可行的途径。如IL-2的125位由半胱氨酸变为丝氨酸后，明显延长半衰期。干扰素IFN1c的86位氨基酸Cys突变后，失去形成二硫键巯基，提高了产物在大肠杆菌中表达的稳定性。61 Amegen公司在20世纪80年代发现的8种干扰素的基础上，进行同源性分析，发现完全的相同位点99个。从而设计合成了保守干扰素，对其中的数个氨基酸进行突变，只有在该位点出现频率高的氨基酸取代，共形成三种突变产物，其中IFNco

41、n-1（Infergen）于1997年批准上市。 多种溶栓蛋白药物的突变改造体也正在不同的试验研究阶段。 对于细胞因子类，改变其受体结合部位的氨基酸，提高受体亲和力和结合能力，能提高其生物活性。对IFN1c的受体结合域AB环31、32位进行突变取代后，提高了抗病毒的生物活性。62 一旦发现候选新药，就要鉴定其物理化学性质，如结构、分子量、稳定性等。常常需要组合23种高分辨率的色谱纯化方法，以获得均质的初始蛋白质。所鉴定的特征可用于生产制造中的质量控制。完成特性鉴定后，可申报专利。 临床前测试药物的安全性、质量和有效性，包括药物代谢谱、药物动力学谱、生物利用度、急毒和长毒，免疫毒性、致癌性、诱变

42、性、生殖毒性和致畸性等。 临床试验需要5年甚至更长时间，而且新药申请专利受到保护。 63 根据生物药物的特点，临床前和临床试验均所需药物为几百克至1公斤的活性成分即可。 设计最适生产过程用于药物评价并有利于以后的放大是十分重要的。 通常是实验室规模生产毫克级药物，用于研发和特征鉴定等。 小规模生产克级药物，用于临床前和临床试验 大规模生产百克至公斤级药物，用于商业药品销售。64第三节 生物制药的发展历程制药工业的历史大约只有60多年，但从开始就发展很快，目前全世界制药企业超过10000家，生产制造5000多种药物，其中约100家为跨国公司 现代制药工业的发展可追溯到20世纪之交，那时只有4种药

43、物：洋地黄用于治疗各种心血管疾病，奎宁用于治疗疟疾，吐根属植物提取物（活性成分为生物碱）用于治疗痢疾，水银用于治疗梅毒，但当时缺乏安全性和有效性。 随着生物学和有机化学的发展，能人工合成某些具有治疗作用化合物。65 1800：阿司匹林，从而导致了药物化学公司的诞生，Bayer和Hoechst公司。 直到1930年代，制药工业才开始大发展。磺胺类药物的发现和化学合成是最初标志，能有效治疗很多细菌的感染。大规模工业化生产胰岛素也成为现实。 1940年代大规模生产青霉素，此时，建立了很多现代的领头制药企业，如Eli Lilly、Wellcome、Glaxo、Roche等。早期的制药几乎都是化学合成的

44、。66一、天然生物材料的提取 早期的生物药物是来自动物脏器和血液，即脏器制剂，以李时珍所著的本草纲目和中国药用动物志为典型代表，分别收录药物1892种和药用动物1500余种。属单方入药，简单加工制造，几乎没有规模，是以原料药为主。制品纯度低，有效成分不明确。某些脏器制剂仍然在欧亚地区特别是第三世界国家和日本使用。 在20世纪50年代后，随着对动物脏器的有效成分和生理活性物质的全面了解，生产工艺技术提高，分离和纯化制剂技术也完善，改变了原来的混合制剂，成为高纯度单一特异性组分的生化药物制剂，猪牛胰岛素、前列腺酶及激素67二、传统微生物发酵阶段 1928年英国Fleming发现了抗菌物质，1940

45、年Florey Chain等提取并证明了青霉素的疗效。 起初沿用初级代谢产物的发酵条件，采用表面培养法生产青霉素。 随后研发了搅拌发酵沉没法生产成功，提高了供氧和通气量，菌株选育、培养和深层发酵、提取技术和设备的研究取得了突破性进展，给抗生素生产带来了革命性的变化，开始了微生物工业时代。以后链霉素、金霉素、红霉素等抗生素出现，抗生素成为制药业的独立门类。黑根霉一步生物转化孕酮为11a-羟基孕酮，实现甾体类激素工业化68三、酶工程技术的出现与应用 酶工程是酶学和工程学相互结合渗透发展形成的，以应用为目的，研发新酶并生产、分离和纯化，包括酶的固定化及酶反应器及酶的分子设计等。 在20世纪20年代，

46、就出现了酶工程，以自然酶制剂在工业上大规模应用的特征，原料以动植物为主。 1953年，Grubhoger Schleith 用重氮化聚氨基聚苯乙烯树脂对羧肽酶、蛋白酶、核酸酶等进行固定，产生了固定化酶技术。 69 1969年，千畑一郎等用固定化氨基酰化酶技术拆分了DL-氨基酸，生产L-氨基酸，随后固定化天冬氨酸酶生产L-天冬氨酸等，开创了固定化酶应用的局面。 以后相继出现了化学修饰酶、人工酶、有机相酶反应等化学酶工程和遗传修饰、改变及克隆酶等生物酶工程，并且以微生物为酶工程的主要来源。 在制药工业上的应用: 酶制剂直接或间接应用于医药;生物转化，给已有药物添加基团，增加药效和功能;细胞固定化技

47、术用于动物细胞培养制药;酶抑制剂是低分子物质，对微生物本身无害，在人体有生理活性，是药物研发的一个重要方向。 70 固定化大肠杆菌细胞（产生青霉素酰化酶）转化青霉素G、V，除去侧链生产无侧链青霉素，即6-氨基青霉烷酸。 固定化5-磷酸二酯酶水解转化酵母RNA，生产5-复合单核苷酸。 固定化氨基酰化酶拆分化学合成的DL-氨基酸，产生有活性的L-氨基酸。 已上市的酶抑制剂; 阿卡波糖,抑制葡萄糖苷酶活性，降血糖。 洛伐他汀抑制3-羟甲基戊二酰辅酶A还原酶，降胆固醇。71四、动物细胞培养技术1838年植物学家Schleiden和1839年动物学家Schwann首次把细胞作为植物、动物的基本结构单元，

48、创立了细胞学说，是19世纪的三大发现之一。 1885年德国Roux用生理盐水培养鸡胚组织，1897年Loeb用血清和血浆培养结缔组织细胞，1907年Harrison在无菌条件下离体成功地培养蛙胚神经组织，并使之生长，是现代动物细胞培养的开端。1923年Carrel发明了卡士瓶培养法，1951年，Earle等开发了培养基，动物细胞培养技术开始形成。72 动物细胞培养以成为重要的生物药物制造技术，目前所用动物细胞：昆虫细胞、哺乳动物细胞、鸡胚细胞等。 动物细胞培养生产的药物有：病毒疫苗，如乙肝疫苗、脊椎灰质炎疫苗、狂犬疫苗等；非抗体免疫调节剂，如干扰素、白细胞介素、巨噬细胞激活因子等；多肽生长因子

49、，如神经生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血清生长因子等；酶类，如组织血纤维溶酶原激活剂、VIII因子等；激素类如促黄体生成素、促滤胞素等。肿瘤特异抗原如癌胚抗原等；单克隆抗体；病毒杀虫剂如杆状病毒等；皮肤移植如单细胞培养等。73五、植物细胞培养技术与转基因植物制药 创始人德国Haberlandt于19世纪末期对植物细胞在培养液中培养，能存活一段时间。1902年他又对叶肉进行培养。 到30年代，利用组织培养可以使细胞分化成完整的植株，Gautheret对烟草细胞、Nobercourt对萝卜细胞、White对杨树细胞成功培养。 1958：Steward等从胡萝卜韧皮部组织培养出完整植株

50、，Visil Hildebrandt用烟草单细胞培养成可育完整植株. 1969：Nitch用花粉培养出单倍体植株， 1970：Steward用悬浮细胞培养出胡萝卜可育植株。 74 Routier和Nickell首先申请用植物细胞培养生产有机产物的专利。 70年代以后，越来越多的植物被用来细胞培养，快速繁育、离体保存和生产次生代谢产物。 用高度分化的组织仍能培养发育成完整植株，即细胞的全能性是今天培养技术的基础。 大规模细胞培养技术发展起来，如日本已开发20000升搅拌斧式反应器生产烟草细胞。 现在已生产的药物有奎宁、长春碱、吗啡、可卡因、莨菪碱、蛇根碱、阿托品、多巴、小檗碱等。农药有除虫菊脂、

51、鱼藤酮等，食品类有紫草宁、花青素和香精等。 75六、抗体工程技术 抗体是能与相应抗原特异性结合的具有免疫反应功能的球蛋白。 1890年Behring和北里柴三郎等发现了白喉抗毒素，并建立了血清治疗法，开始了第一代抗体药物，如破伤风抗毒素血清仍然在使用。 1937年Tiselius等电泳分离血清蛋白，发现抗体活性主要为球蛋白。在相当长的时间内，球蛋白成了抗体的同义词。 60年代，发现患骨髓瘤的病人血清中有与抗体分子结构类似的球蛋白，因此把具有抗体活性、化学结构与抗体相似的球蛋白通称为免疫球蛋白Ig。76 由于病原微生物含有多种抗原决定簇的抗原物质，因此制得的抗体是多种抗体的混合物，即多克隆抗体。

52、这些抗体制剂在使用中经常发生非特异性交叉反应而导致假阳性结果，同时产量低，难以满足临床需要。 1975年Kohler和Milstein把来自脾脏能产生抗体的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞，进行原生质体融合，得到了通过离体培养就能产生单一抗体的杂交细胞，即杂交瘤细胞。这是首次把杂交瘤技术应用于单克隆抗体的制备。与多克隆抗体相比，单克隆抗体具有高度特异性、均一性，而且来源稳定，可大量生产，成了抗体制备和生产的主要方法。单克隆抗体是第二代抗体。77 动物源性单克隆抗体在人体应用中，也存在抗原性，容易产生过敏反应，在体内易失效。人源单克隆抗体才是最终目标。因此产生了在基因水平对抗体结构进行改造的学科即抗体工程

53、，通过原核微生物或昆虫细胞表达抗体的功能部分，制备嵌合抗体，并对抗体改形、变小，完全人源化抗体，这就是所谓的第三代抗体。 1981年美国第一种单克隆抗体诊断试剂盒被批准进行商品化生产，至今品种已达数百种。至2002年，FDA批准的临床治疗性抗体药物10余种。78抗体类型商品名应用鼠源单克隆抗体Orthoclone器官移植排斥嵌合抗体Peopro冠状动脉成形术，心绞痛嵌合抗体RituxanB细胞型非霍奇金淋巴瘤嵌合抗体Simulect器官移植排斥嵌合抗体Remicade回肠炎，类风湿性关节炎人源化抗体Zenapax器官移植排斥人源化抗体Synagis婴儿呼吸道合胞病毒人源化抗体Herceptin

54、乳腺癌人源化抗体Campath慢性淋巴细胞白血病人源化抗体偶联物Mylotarg急性复发骨髓白血病鼠源抗体放射性偶联物ZevalinB细胞型非霍奇金淋巴瘤79七、基因工程技术 基因工程是在体外对生物的遗传物质基因进行剪切、拼接、重新组合，与适宜的载体连接，构成完整的基因表达系统，然后导入宿主生物细胞内，与原有遗传物质整合或以质粒形式单独在细胞中繁殖，编码产生人类所需的物质或创造新的物种，也可对疾病进行基因治疗。 1973年重组DNA技术的建立为标志，是科学技术史上的里程碑。应用于农业、医药、轻工、化工、环境等领域，成为人类解决粮食、能源、环境、制药的主要手段。80 1976年世界上第一家基因工

55、程技术开发药物的公司（Genentech公司）建立，开始了现代生物技术产业发展的新纪元。1982年世界上第一个基因工程药物重组人胰岛素获得FDA批准，由Eli Lilly公司正式生产，推向市场。 基因工程技术首先在医药领域实现产业化，到现在仍有6080集中在医药领域，占主要地位的是基因工程药物的研究和商品化。 研究开发的治疗药物是癌症、心脑血管疾病、艾滋病、遗传病等重大病而用常规方法又难以获得的药物。 81年代技术贡献者53DNA双螺旋模型Watson 和Crick58DNA半保留复制和中心法则Crick61遗传密码的碱基三联体Crick和Nirenberg67破译遗传密码Khorana和Ni

56、renberg71首家生物技术制药公司成立Cetus公司72体外重组DNAJackson和Berg73重组质粒在大肠杆菌中表达Boyer 和Cohen75细胞融合，单克隆抗体技术Kohler和Milstein76首家基因工程技术制药公司成立Genentech公司78大肠杆菌中表达出胰岛素Genentech公司8280转基因小鼠Gordon等82基因工程人胰岛素在美国上市Eli Lilly公司82转基因超级小鼠Palmiter等83基因扩增的PCR技术Mullis85植物转基因技术Horsch等86基因工程重组乙肝疫苗上市Merck公司87转基因鼠乳腺表达药物tPAGordon等8390人类基因

57、组计划开始美国97克隆动物绵羊多利，转凝血因子IX基因绵羊波利Wilmut等99中国加入人类基因组计划2000绘制出人类基因组“工作框架图”中、美、英、日、法、德等6国2001完成人类基因组“中国卷” 中国2003绘制出人类基因组“序列图”中、美、英、日、法、德等6国84第四节 生物制药的现状和展望 现代生物技术发展迅猛，日益影响和改变着人们的生产和生活方式。生物技术引入医药产业，使得生物医药业成为最活跃、进展最快的产业之一。 2000年全球生物技术药物销售额为300亿美元，美国约为200亿美元，其次是欧洲和日本。而与此同时，全球医药市场销售额年递增幅度却远低于生物药物的发展水平(近10%)，

58、显示出生物药物的良好发展势头，并呈现出加速的迹象。85一、 国外生物制药 全世界生物技术公司3600多家，主要集中在欧美，美国1450家，欧洲700家，加拿大330家，日本也有几百家。年产值超过10亿美元的生物技术公司有20余家。 美国是现代生物技术的发源地，又是应用现代生物技术研制新型药物的第一个国家，多数基因工程药物都首创于美国。年研究经费70亿美元以上。 1980年美国的生物技术产品的销额还是零增长，1991:59亿USD，1996:101亿USD，基因工程药物为80亿USD，1997:130亿USD，2001:270亿USD。8687美国2001年已达1450余家。从业人员达19万人。

59、形成规模化生产的有Amgen , Biogen, Chiron, Scheringplough, Eli Lilly, Merker, Genentech, HoffmanLa Roche, Smith Kline Beecham, Ortho Biotech等20余家公司，其中Genentech、Amgen、Biogen、Chiron和Genzyme的销售额名列前茅。888990912002年批准35种药物，另外有300多个品种进入临床实验或待批阶段。 到2002年底，FDA批准234种生物技术药物和疫苗（包括新的适应症）正式投放市场，其中新生物技术药物和疫苗为141种。9293二、国内生物

60、制药 20世纪80年代是我国生物制药的起步阶段， 1983年成立生物工程开发中心，“七五”期间投资成立了基因工程药物、生物制品、疫苗三个研究开发中心。项目主要集中在肝炎、疫苗、血液制品等产品，企业数目极少。 1986年我国生物技术尚处于研发的初期，仅有单克隆抗体诊断试剂盒、微生物农药等少数、少量产品，医药产品的产值约为0.2亿元，占生物技术产品销售额的8。 20世纪90年代，企事业单位齐头并进，大发展。国外主要的基因工程药物及疫苗，都能生产.94 到1996年医药产品的销售额达为2.2亿元，其中基因工程药物和疫苗占10.5。1998年，基因工程药物销售额达7.2亿。代表性的产品rhuIFN-1