血管内皮细胞生长因子与碱性成纤维细胞生长因子联合应用对鼠牙周膜成纤维细胞增殖与碱性磷酸酶活性的影响

1、血管内皮细胞生长因子与碱性成纤维细胞生长因子联合应用对鼠牙周膜成纤维细胞增殖与碱性磷酸酶活性的影响 中国组织工程研究 第21卷 第4期 20170208出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research February 8, 2017 Vol.21, No.4 www. CRTER.org 血管内皮细胞生长因子与碱性成纤维细胞生长因子联合应用对 鼠牙周膜成纤维细胞增殖与碱性磷酸酶活性的影响 研究原著 曹 宇1，王莉莉2 (1沈阳市第六人民医院口腔科，辽宁省沈阳市 110000；2锦州医科大学附属口腔医院修复科，辽宁省锦州市 121004) 引用

2、本文：曹宇,王莉莉. 血管内皮细胞生长因子与碱性成纤维细胞生长因子联合应用对鼠牙周膜成纤维细胞增殖与碱性磷酸酶活性的 影响J.中国组织工程研究，2017，21(4):580-585. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.04.015 ORCID: 0000-0002-1451-9087(曹宇) 文章快速阅读： 文题释义： 牙周组织工程：是将种子细胞在体外进行培养扩增，将扩增的细胞与具有良好生物相容性、可降解性和可吸收的生物材料(支架)按一定的比例混合，形成细胞-材料复合物，将此复合物植入机体牙周病损区，以达到修复创伤和重建功能的目的。 生长因子：是一类通过与特异

3、的、高亲和的细胞膜受体结合，调节细胞生长与其他细胞功能等多效应的多肽类物质。存在于血小板和各种成体与胚胎组织及大多数培养细胞中，对不同种类细胞具有一定的专一性。 摘要 方法：体外培养大鼠牙周膜成纤维细胞并鉴定其胚胎来源，第4代细胞用于实验；检测不同浓度血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子对大鼠牙周膜成纤维细胞增殖的影响，并从中确定显效浓度及最大效应浓度；将细胞分为5组，分别为A组：对照组，为含体积分数2%胎牛血清的DMEM；B组：血管内皮细胞生长因子最大效应浓度组；C组：碱性成纤维细胞生长因子最大效应浓度组；D组：血管内皮细胞生长因子显效浓度与碱性成纤维细胞生长因子显效浓度联合应用；E

4、组：血管内皮细胞生长因子最大效应浓度与碱性成纤维细胞生长因子最大效应浓度联合应用。于3，7，14 d后，测定5组细胞的碱性磷酸酶活性。 结果与结论：培养的大鼠牙周膜成纤维细胞生长状态良好，来源于中胚层；随着血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子质量浓度的增加，大鼠牙周膜成纤维细胞增殖能力也随之提高(P 0.01)。血管内皮细胞生长因子的显效浓度为10 g/L，最大效应浓度为100 g/L；碱性成纤维细胞生长因子的显效浓度为 0.1 g/L，最大效应浓度为10 g/L；当血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子联合作用于大鼠牙周膜成纤维细胞时，实验各组A值均高于对照组。在应用3 d和7

5、 d时，但D组A值显著低于E组(P 0.05)，14 d时2组差异无显著性意义。结果说明，在一定作用时间内，最大效应浓度联合应用对碱性磷酸酶的活性能起到明显的协同作用，但超过某一时间，显效浓度同最大效应浓度对于牙周膜成纤维细胞碱性磷酸酶活性没有差异。这可能与两因子的作用时效及牙周膜细胞的受体有关。 关键词： 组织构建；组织工程；碱性成纤维细胞生长因子；血管内皮生长因子；牙周膜成纤维细胞；体外培养；增殖；碱性磷酸酶 主题词： 成纤维细胞生长因子2；血管内皮生长因子；牙周膜；碱性磷酸酶 基金资助： 辽宁省科技厅自然科学基金优秀人才培育项目(2014022003)；辽宁省大学生创新训练项目(2015

6、10160000045) 580 P.O. Box 10002, Shenyang 曹宇，女，1974年生，辽宁省鞍山市人，汉族，2001年中国医科大学毕业，副主任医师，主要从事口腔医学研究。 通讯作者：王莉莉，博士，副主任医师，锦州医科大学附属口腔医院修复科，辽宁省锦州市 121004 中图分类号:R318 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2017)04-00580-06 稿件接受：2016-12-12 Cao Yu, Associate chief physician, Department of Stomatology, the Sixth Peoples Hospita

7、l of Shenyang, Shenyang 110000, Liaoning Province, China Corresponding author: Wang Li-li, M.D., Associate chief physician, Department of Prosthodontics, the Affiliated Stomatological Hospital of Jinzhou Medical University, Jinzhou 121004, Liaoning Province, China www.CRTER.org 110180 www.CRTER.org

8、Effects of vascular endothelial growth factor combined with basic fibroblast growth factor on periodontal ligament fibroblast proliferation and alkaline phosphatase activity in rats Cao Yu1, Wang Li-li2 (1Department of Stomatology, the Sixth Peoples Hospital of Shenyang, Shenyang 110000, Liaoning Pr

9、ovince, China; 2 Department of Prosthodontics, the Affiliated Stomatological Hospital of Jinzhou Medical University, Jinzhou 121004, Liaoning Province, China) Abstract BACKGROUND: Basic fibroblast growth factor (bFGF) can enhance fibroblast proliferation and collagen deposition, and vascular endothe

10、lial growth factor (VEGF) can improve blood perfusion and metabolic level of pathological tissues. Additionally, both of them can boost the alkaline phosphatase activity under given conditions. OBJECTIVE: To evaluate the effect of bFGF combined with VEGF on the periodontal ligament fibroblast prolif

11、eration and alkaline phosphatase activity in rats. METHODS: Rat periodontal ligament fibroblasts were cultured in vitro, its embryonic origin was identified and passage 4 cells were used for the following experiments. Effects of bFGF and VEGF with different concentrations on the rat periodontal liga

12、ment fibroblast proliferation were detected to determine the minimum and maximum effective concentrations. Cells were divided into five groups: group A (control group) with DMEM containing 2% fetal bovine serum; group B as maximum effective concentration of VEGF group; group C as maximum effective c

13、oncentration of bFGF; group D as minimum effective concentration of bFGF combined with minimum effective concentration of VEGF group; group E as maximum effective concentration of bFGF combined with maximum effective concentration of VEGF group. At 3, 7 and 14 days, the alkaline phosphatase activity

14、 in each group was detected. RESULTS AND CONCLUSION: Rat periodontal ligament fibroblasts derived from the mesoderm grew well. Rat periodontal ligament fibroblast proliferation was increased with the VEGF and bFGF concentration increasing (P 0.01). The maximum and minimum effective concentrations of

15、 VEGF were 100 and 10 g/L, and the maximum and minimum effective concentrations of bFGF were 10 and 0.1 g/L. The absorbance values in the groups D and E were higher than those in the group A. The absorbance values of the group D were significantly lower than those of the group E at 3 and 7 days (P 0

16、.05). To conclude, the combination use of the maximum effective concentration of VEGF and bFGF can play a significant synergistic effect on the alkaline phosphatase activity at a given time, but the minimum and maximum effective concentrations show no significant differences if not in the given time

17、, which may be related to the time-effectiveness of these two factors and the receptors of periodontal ligament cells. Subject headings: Fibroblast Growth Factor 2; Vascular Endothelial Growth Factors; Alkaline Phosphatase; Tissue Engineering Funding: the National Science Foundation for the Talents

18、of Liaoning Science and Technology Department, No. 2014022003; the Innovation Training Program of College Students of Liaoning Province, No. 201510160000045 Cite this article: Cao Y, Wang LL. Effects of vascular endothelial growth factor combined with basic fibroblast growth factor on periodontal li

19、gament fibroblast proliferation and alkaline phosphatase activity in rats. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2017;21(4):580-585. 0 引言 Introduction 社会在不断进步，人们的保健意识也在不断增强，但是牙周疾病的发病率仍居高不下1。牙周病是一种慢性炎症破坏性非特异感染性疾病，影响其治疗效果的主要因素就是牙周组织损伤后，炎症抑制了牙周正常组织的再生及重建2。这些年来，学者一直致力于通过组织工程技术来促进牙周组织的再生及重建3-6。种子细胞、支架材料、生长因子是

20、实施该技术的三大元素7。近些年来，生长因子受到了越来越多的关注8。在众多的生长因子中，碱性成纤维细胞生长因子及血管内皮细胞生长因子发挥了非常重要的作用9。前者可以提高成纤维细胞的增殖及胶原的沉积能力10-11，后者可改善病变组织的血流灌注和新陈代谢水平12，且两者在适当的浓度、时间作用下，均可增强碱性磷酸酶的活性13-14。碱性成纤维细胞生长因子与血管内皮细胞生长因子单独作用于牙周膜成纤维细胞已有过报道，但是两者联合应用的报道尚不多见15。文章通过单独应用不同浓度的这两种因子作用于大鼠牙周膜成纤维细胞，确定出显效浓度及最大效应浓度，进一步以实验确定的浓度将两种因子联合应用，探讨其对大鼠牙周膜成

21、纤维 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 细胞的碱性磷酸酶活性的影响。 1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计 分组对照细胞学实验。 1.2 时间及地点 实验于2015年12月完成于锦州医科大学实验中心完成。 1.3 材料 1.3.1 实验动物 2月龄、体健、体质量100-120 g的SD雄性大鼠由锦州医科大学动物研究中心提供，动物研究中心许可证号：SCXK(辽)2003-2007。 1.3.2 主要试剂及材料 含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液、胰蛋白酶(Hyclone，美国)、PBS(Amresco，美

22、国)、碱性成纤维细胞生长因子及血管内皮细胞生长因子(Cytokine，USA)、碱性磷酸酶测定试剂盒；25 cm2与75 cm2培养瓶、24孔板与96孔板、15 mL 离心管；一次性滤器。 1.3.3 主要仪器 CO2孵箱(Shellab，美国)、ZHJH- C1118C 型超净工作台(上海智城分析仪器制造有限公司)、CKX41 型倒置相差显微镜、DT5-1低速离心机(北京时代北利离心机有限公司)；酶联免疫检测仪：国营华东电 581 www.CRTER.org 子管厂产DG3022A型；5y2002 型电子天平(上海良平仪器仪表有限公司)。 1.4 实验方法 1.4.1 大鼠牙周膜成纤维细胞的

23、培养及胚胎来源的鉴定取2月龄SD大鼠，分离其上下颌骨及磨牙，漂洗10次，刮取根中部1/3的牙周膜组织，剪成1 mm1 mm的碎屑，采用酶消化法结合组织块法，将消化后的组织块平铺于培养皿内，将此培养皿倒置放置于CO2孵箱内(37 ，体积分数5%CO2，100%湿度)。待细胞覆盖培养皿底达60%时，进行首次传代。用0.25%胰酶进行消化，于倒置显微镜下观察细胞形态的变化，待细胞回缩呈圆形时，弃掉胰酶，再加入含15%体积分数胎牛血清的DMEM 2 mL，反复吹打，重新分散细胞。将细胞悬液移入培养瓶中，继续培养。以后待细胞长满瓶底时，按12进行传代。第3代细胞用于细胞来源鉴定及后续实验。 1.4.2

24、血管内皮细胞生长因子对大鼠牙周膜成纤维细胞增殖作用的影响 取生长状态良好的第3代大鼠牙周膜成纤维细胞，消化、离心后将其调整为细胞浓度为2107 L-1的细胞悬液。在96孔板的每个孔中滴加100 L的细胞悬液，并补充体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液至 200 L，并于CO2孵箱内(37 ，体积分数5%CO2，100%湿度)孵育24 h后，将原培养液弃去，PBS冲洗3次。将孔板细胞随机分为8组，其中6组分别注入不同浓度的血管内皮细胞生长因子，即为实验组(A组：0.5 g/L；B组：10 g/L；C组：25 g/L；D组：50 g/L；E组：100 g/L；F组： 200 g/L)，1个阴性对

25、照组(不含血管内皮细胞生长因子组)，1个空白对照组(只含DMEM培养液)，每组6孔，CO2孵箱内常规培养。3 d后弃去上述培养液，注入MTT液 (5 g/L)20 L，CO2孵箱中孵育4 h，终止培养后，各孔内均加入150 L二甲基亚砜，震荡摇匀，以使孔板中的结晶物质充分的溶解。于490 nm波长下检测各孔的A值，结果取均值，从中选出显效浓度及最大效应浓度。 1.4.3 碱性成纤维细胞生长因子对大鼠牙周膜成纤维细胞增殖作用的影响 取生长状态良好的第3代大鼠牙周膜成纤维细胞，消化、离心后将其调整为细胞浓度为2107 L-1的细胞悬液。在96孔板的每个孔中滴加100 L的细胞悬液，并补充体积分数1

26、0%胎牛血清的DMEM培养液至 200 L，并于CO2孵箱内(37 ，体积分数5%CO2，100%湿度)孵育24 h后，将原培养液弃去，PBS冲洗3次。将孔板细胞随机分为6组，其中4组分别注入不同浓度的碱性成纤维细胞生长因子，即为实验组(A组：0.1 g/L；B组： 1 g/L；C组：10 g/L；D组：100 g/L)，1个阴性对照组(不含血管内皮细胞生长因子组)，1个空白对照组(只含DMEM培养液)，每组6孔，CO2孵箱内常规培养。3 d后弃去上述培养液，注入MTT液(5 g/L)20 L，CO2孵箱中孵育 4 h，终止培养后，各孔内均加入150 L二甲基亚砜，震荡摇匀，以使孔板中的结晶物

27、质充分的溶解。于490 nm波长 582 下检测各孔的A值，结果取均值，并绘制生长曲线，从中选出显效浓度及最大效应浓度。 1.4.4 血管内皮细胞生长因子与碱性成纤维细胞生长因子联合应用对大鼠牙周膜成纤维细胞碱性磷酸酶活性的影响 取生长状态良好的第3代细胞用于此实验，将其制成2107 L-1的细胞悬液。根据1.4.2及1.4.3实验结果，分为5组，A组：对照组为含体积分数2%胎牛血清的DMEM；B组：血管内皮细胞生长因子最大效应浓度组；C组：碱性成纤维细胞生长因子最大效应浓度组；D组：血管内皮细胞生长因子显效浓度与碱性成纤维细胞生长因子显效浓度联合应用；E组：血管内皮细胞生长因子最大效应浓度与

28、碱性成纤维细胞生长因子最大效应浓度联合应用。每组6孔，接种于96孔板中，每孔滴加100 L此细胞悬液，于CO2孵箱内(37 ，体积分数5%CO2，100%湿度)常规培养，每3 d换液1次。待细胞生长融合至培养板底的70%-80%时，各组加入含有相应浓度生长因子的成骨诱导液(成骨诱导液成分：含50 mg/L维生素C、1105 mol/L 地塞米松、10%胎牛血清、1102 mol/L -甘油磷酸钠的DMEM 培养液)，每3 d换液1次。分别于诱导7 d后的第3，7，14天检测各组的碱性磷酸酶活性。于405 nm波长下检测各孔的A值，按以下公式计算出碱性磷酸酶的活性： 碱性磷酸酶=(测定孔吸光度-

29、空白孔吸光度)/(标准孔吸光度-空白孔吸光度)酚标准品浓度/待测样本蛋白浓度，结果取均值。 1.5 主要观察指标 大鼠牙周膜成纤维细胞形态；血 管内皮细胞生长因子对大鼠牙周膜成纤维细胞增殖的影响；碱性成纤维细胞生长因子对大鼠牙周膜成纤维细胞增殖的影响；两种因子联合应用对大鼠牙周膜成纤维细 胞碱性磷酸酶活性的影响。 1.6 统计学分析 应用SPSS 17.0统计软件对实验数据进行检测，计量资料以x_ s来表示，对于各组间的差异比较，采用单因素方差分析进行统计，以P 0.05为差异有显著性意义。 2 结果 Results 2.1 细胞形态学观察 大鼠牙周膜成纤维细胞原代培养 2 d后，可见其从组织

30、块边缘游出，生长状态良好。细胞呈长梭形、纺锤形，呈现多形性。传代后的细胞逐渐纯化，生长旺盛，形态理想，呈现出成纤维细胞的典型形态。经波形丝蛋白及角化蛋白的免疫组化染色证实，此牙周膜成 纤维细胞来源于中胚层。 对加入不同浓度血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子的大鼠牙周膜成纤维细胞进行镜下观察，培养24 h后，各组细胞生长正常，细胞形态呈梭形或多角形，偶有细胞脱落。培养72 h后，见各组细胞仍 全部贴壁生长，细胞轮廓清晰，核浆比例正常，胞质均匀(见图1，2)。 P.O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CRTER.org www.CRTER.org 图 1

31、加入血管内皮细胞生长因子细胞培养72 h(100) Figure 1 Cells cultured for 72 hours after the addition of vascular endothelial growth factor (100) 图2 加入碱性成纤维细胞生长因子细胞培养72 h (200) Figure 2 Cells cultured for 72 hours after the addition of basic fibroblast growth factor (200) 2.2 血管内皮细胞生长因子对大鼠牙周膜成纤维细胞增殖作用的影响 不同质量浓度血管内皮细胞生长

32、因子作用于大鼠牙周膜成纤维细胞3 d后，大鼠牙周膜成纤维细胞的增殖能力均受到了不同程度的影响。随着血管内皮细胞生长因子质量浓度的增加，大鼠牙周膜成纤维细胞的增殖能力也随之提高，当质量浓度为200 g/L时，A值没有进一步增高，但各实验组A值与对照组相比，均有显著性差异(P 0.01)。血管内皮细胞生长因子的显效浓度为10 g/L，最大效应浓度为100 g/L(见表1)。 表1 培养3 d后不同质量浓度血管内皮细胞生长因子对大鼠牙周膜 成纤维细胞增殖作用的影响 (x_ s) Table 1 Effects of different concentrations of vascular endot

33、helial growth factor on the periodontal ligament fibroblast proliferation after 3-day culture 组别 A值 空白对照组 0.0030.001 阴性对照组 0.1950.024 A组 (0.5 g/L) 0.2030.012 B组(10 g/L) 0.2320.099a C组 (25 g/L) 0.2500.075a D组 (50 g/L) 0.2660.006a E组 (100 g/L) 0.2790.101a F组 (200 g/L) 0.2570.034a 表注：与对照组相比， aP 0.01。 2

34、.3 碱性成纤维细胞生长因子对大鼠牙周膜成纤维细胞增殖作用的影响 不同质量浓度碱性成纤维细胞生长因子作用于大鼠牙周膜成纤维细胞 3 d后，随着血管内皮细胞生长因子质量浓度的增加，各组的A值也随之增加，但10 g/L组A值高于其余各组(P 0.01)，各实验组A值与对照组相比，均有显著性差异(P 0.05)。碱性成纤维细胞生长因子的显效浓度为0.1 g/L，最大效应浓度为10 g/L(见表2)。 2.4 两种细胞因子联合应用对大鼠牙周膜成纤维细胞碱性磷酸酶活性的影响 各组随着培养时间的延长，A值也在随之增长，碱性磷酸酶的活性亦随之增强。在培养3 d时，除血管内皮细胞生长因子(100 g/L)组外

35、，其余各组与对照组相比，均有显著性差异(P 0.05)。7，14 d时，实验各组与对照组相比，亦均有显著性差异(P 0.05)。但血管内 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 皮细胞生长因子10 g/L+碱性成纤维细胞生长因子 0.1 g/L组与血管内皮细胞生长因子100 g/L+碱性成纤维细胞生长因子10 g/L组相比，在3 d和7 d时，前者A值低于后者(P 0.05)，见表3，图3。 表 2 培养3 d后不同浓度碱性成纤维细胞生长因子对大鼠牙周膜成 纤维细胞增殖作用的影响 (x_ s) Table 2 Effects of different

36、 concentrations of basic fibroblast growth factor on the periodontal ligament fibroblast proliferation after 3-day culture 组别 A值 空白对照组 0.0090.001 阴性对照组 0.2010.035 A组(0.1g/L) 0.2380.026a B组(1 g/L) 0.2920.013b C组(10 g/L) 0.3750.008b D组(100 g/L) 0.3220.060b 表注：与对照组相比，a P 0.05，bP 0.01 表3 血管内皮细胞生长因子与碱性成纤

37、维细胞生长因子联合应用对 大鼠牙周膜成纤维细胞碱性磷酸酶活性的影响 (x_ s) Table 3 Effects of vascular endothelial growth factor combined with basic fibroblast growth factor on the alkaline phosphatase activity of rat periodontal ligament fibroblasts 组别 3 d 7 d 14 d 对照组 0.1780.025 0.2320.028 0.3060.011 血管内皮细胞生长因子(100 g/L) 0.1890.018

38、 0.2670.009a 0.3450.027a 碱性成纤维细胞生长因子(10 g/L) 0.2010.007a 0.2880.016a 0.3820.019b 血管内皮细胞生长因子10 g/L+ 碱性成纤维细胞生长因子0.1 g/L 0.2170.021b 0.3030.010b 0.4110.012b 血管内皮细胞生长因子100 g/L+ 碱性成纤维细胞生长因子10 g/L 0.2550.031bc 0.3910.013bc 0.4290.015b 表注：与对照组相比，aP 0.05，b P 0.01。与血管内皮细胞生长因子10 g/L+ 碱性成纤维细胞生长因子0.1 g/L组相比，c P

39、 0.05。 对照组 (100 g/L) 碱性成纤维细胞生长因子(10 g/L) 血管内皮生长因子(10 g/L)+碱性成纤维细胞生长因子(0.1 g/L) 血管内皮生长因子(100 g/L)+碱性成纤维细胞生长因子(10 g/L) 值A 3 d7 d14 d时间 图3 两种因子联合应用对大鼠牙周膜成纤维细胞碱性磷酸酶活性的 影响 Figure 3 Effects of vascular endothelial growth factor combined with basic fibroblast growth factor on the alkaline phosphatase activ

40、ity of rat periodontal ligament fibroblasts 图注：各组随着培养时间的延长，A值也在随之增长，碱性磷酸酶的 活性亦随之增强。血管内皮细胞生长因子100 g/L+碱性成纤维细胞 生长因子10 g/L组碱性磷酸酶的活性最强。 583 www.CRTER.org 3 讨论 Discussion 成纤维细胞是牙周组织的重要细胞成分，它可以诱导牙周组织内的成纤维细胞发挥潜在的生物学功能，其在牙周组织的修复过程中发挥了重要的作用16-17。在某些条件下，牙周膜成纤维细胞可以分化为成牙本质细胞、成牙骨质细胞、成骨样细胞18。由此可见，牙周膜成纤维细胞具有完全修复牙周

41、组织炎症缺损、形成新附着的能力19。基于牙周膜成纤维细胞的这种多向分化的能力，它被广泛的应用于牙周再生领域20。 牙周组织再生中的一个至关重要的过程就是使牙周膜成纤维细胞在根面获得黏附及足够的冠方迁移。但这一过程受众多因素的干扰，如细胞本身的增殖能力以及各种多肽生长因子对细胞活动的调控等21。碱性成纤维细胞生长因子是一种重要的促进有丝分裂的生长因子，具有诱导形态发生和分化的能力22-23。在正常生理和病理活动中，它能够参与生长发育及组织创伤的修复24。对于牙周炎来说，最终的治疗目的是为了恢复损伤的牙周组织，使牙周组织重建，形成新的附着，碱性成纤维细胞生长因子可以促进创伤的愈合及组织的修复，可以

42、促进牙周组织的修复和再生。动物实验证明，将碱性成纤维细胞生长因子用于牙周组织的重建中，它可以诱导牙髓、牙周膜成纤维细胞发生趋化作用，促进细胞DNA的合成，调节细胞基质的分泌25。血管内皮细胞生长因子是由牛垂体细胞体外培养分离出来的一种糖蛋白，它能够增强微血管的通透性，促进血浆蛋白的渗出，使血浆蛋白直接或间接的改变细胞外基质的成分，促进牙周膜成纤维细胞的迁移26-27。也有实验证实，它在骨组织再生中也能起到调节作用，促进牙周膜成纤维细胞成骨相关基因的表达，使其矿化能力得到增强28。 对于牙周组织工程来说，选择合适的生长因子至关重要。合适浓度的生长因子可以使细胞的调节作用发挥到最佳，对牙周组织的再

43、生起到最大的帮助。但既往的实验发现，对于血管内皮细胞生长因子的有效浓度，结果不尽相同29-30。实验中将不同浓度的血管内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子刺激于大鼠的牙周膜成纤维细胞，发现，各浓度的这两种因子对牙周膜成纤维细胞都有一定的促进作用。其中，随着血管内皮细胞生长因子浓度的提高，其增殖能力也在提高，但质量浓度到达200 g/L时，尽管也有增殖能力，但没有得到与浓度呈正相关的提高。与对照组相比，其显效浓度为10 g/L，最大效应浓度为 100 g/L，在一定范围内呈一定的浓度依赖性。同样，碱性成纤维细胞生长因子对牙周膜成纤维细胞的增殖也有一定的促进作用，随着碱性成纤维细胞生长因子浓度

44、的增长，其增殖能力也在不断提高，但其增殖的峰值出现在10 g/L时，显效浓度为0.1 g/L。说明当碱性成纤维细胞生长因子到达一定浓度剂量的时候，即使再提高浓度也不会对牙周膜成纤维细胞的增殖能力有所帮助，这与Luo等31实验结果相一致。以上实验再次证实了这2种因子对牙周膜成纤维 584 细胞具有一定的促增殖作用，但这也与生长因子的浓度有一定关系。 为了提高实验结果的可信性，根据相关文献报道初步确定了2种因子的浓度范围。从浓度范围中，测定出了2种因子各自的促增殖最大效应浓度及显效浓度用于后续的实验。研究证实，将血管内皮细胞生长因子与碱性成纤维细胞生长因子以各自的显效浓度和最大效应浓度分别联合应用

45、于大鼠牙周膜成纤维细胞，发现对于碱性磷酸酶活性的影响具有一定的协同效应。在3，7，14 d与对照组的A值相比，碱性磷酸酶活性均高于对照组，说明2种因子的联合应用并没有抑制牙周膜成纤维细胞的碱性磷酸酶活性。而且，在3，7 d时，最大效应浓度两因子联合应用(血管内皮细胞生长因子100 g/L+碱性成纤维细胞生长因子10 g/L)的效果明显高于显效浓度两因子联合应用(血管内皮细胞生长因子10 g/L+碱性成纤维细胞生长因子0.1 g/L) (P 0.05)，最大效应浓度组的碱性磷酸酶活性并没有预期所设想的随着浓度的提高而相应的提高。分析其原因，这可能是随着时间的增长，碱性成纤维细胞生长因子对牙周膜细

46、胞具有抑制成骨的作用，相应的减少了牙周膜细胞表面的碱性成纤维细胞生长因子受体，降低了碱性磷酸酶的活性32，出现了与显效浓度组无差异的结果。 作者贡献：实验设计及评估为通讯作者王莉莉，实验实施为曹宇，是盲法评估。 利益冲突：所有作者共同认可文章无相关利益冲突。 伦理问题：实验动物在戊巴妥纳麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。 文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。 文章外审：本刊实行双盲外审制度，文章经国内小同行外审专家审核，符合本刊发稿宗旨。 作者声明：文章第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据

47、(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。 文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。 开放获取声明：这是一篇开放获取文章，文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。根据知识共享许可协议“署名-非商业性使用-相同方式共享3.0”条款，在合理引用的情况下，允许他人以非商业性目的基于原文内容编辑、调整和扩展，同时允许任何用户阅读、下载、拷贝、传递、打印、检索、超级链接该文献，并为之建立索引，用作软件的输入数据或其它任何合法用途。 4 参考文献 References 1 Li LW, Wong HM, Sun L,et al.Anthro

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