实验一 质粒DNA的提取和鉴定

1、质粒DNA的提取和纯化 生化与分子生物学系1分子生物学从分子水平上研究生命现象物质基础的学科。研究细胞成分的物理、化学的性质和变化以及这些性质和变化与生命现象的关系，如遗传信息的传递，基因的结构、复制、转录、翻译、表达调控和表达产物的生理功能，以及细胞信号的转导等。 2基因工程3移液器和EP管4质 粒质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，独立于染色体之外的、能自主复制的双链环状脱氧核糖核酸物质。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性，如对抗生素的抗性等。F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。 能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子

2、代，一般不整合到宿主染色体上。现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的，常含抗生素抗性基因，是重组DNA技术中重要的工具。 5分类：单拷贝质粒；多拷贝质粒；紧密控制型；松弛控制型；67质粒DNA的提取方法碱裂解法；煮沸裂解法；酚氯仿抽提法； 概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理。8基本思路培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离质粒DNA(有时还要求纯化质粒DNA，根据实验所需)电泳检测；9碱裂解法的基本原理十二烷基磺酸钠(SDS) 可使细胞膜裂解。经SDS处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核

3、酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性，而共价闭合环状DNA(Covalently closed circularDNA，简称cccDNA)的两条链不会相互分开。当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。10实验步骤1、将含有质粒DNA的细菌在LB培养基中培养过夜。取1.5ml LB培养液倒入1.5mleppendorf管中，4下12000g离心30秒。 2、弃上清，将管倒置于卫生纸上数分钟，使液体流尽。 3、菌

4、体沉淀重悬浮于100l溶液中（需剧烈振荡）。 4、加入新配制的溶液200l，盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次，以混匀内容物（千万不要振荡），冰浴2分钟。 5、加入150l预冷的溶液，盖紧管口，颠倒混匀，冰浴中5分钟，4下12000g离心10分钟。6、上清液（450uL）移入干净eppendorf管中，加入等体积的饱和酚（1:1），充分颠倒混匀，4下12000g离心10分钟。 117、将水相（400uL）移入干净eppendorf管中，加入等体积酚/氯仿，颠倒混匀，12000rpm离心10min。8、将水相（350uL）移入干净eppendorf管中，加入2倍体积的无水乙醇，振荡混

5、匀后置于-20冰箱中20分钟，然后4下12000g离心10分钟。 9、弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入0.5ml 70乙醇洗沉淀一次，4下12000g离心5-10分钟。 10、吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干燥10分钟或室温干燥。 11、将沉淀溶于10l TE缓冲液（pH8.0，含20g/ml RNaseA）中，储于-20冰箱中。12LB液体培养基（Luria-Bertani）称取蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeastextract）5g，NaCl10g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5，加去离子水至总体积1升，高压下蒸气

6、灭菌20分钟。13溶液I50mmol/L葡萄糖，25mmol/ L T r i s. Cl（pH8.0），10mmol/LEDTA（pH8.0）。溶液可成批配制，每瓶100ml，高压灭菌15分钟，储存于4冰箱溶液I：重悬细菌；葡萄糖：比重大，使细菌不易沉淀；TrisHCl：缓冲体系；EDTA：螯合金属离子；14溶液0.2mol/LNaOH（临用前用10mol/LNaOH母液稀释），1SDS溶液II破膜，变性基因组DNA和蛋白质；SDS破膜作用，变性蛋白质；NaOH破膜，变性基因组DNA；15溶液5mol/LKAc60ml，冰醋酸11.5ml，H2O 28.5ml，定容至100ml，并高压灭菌。

7、溶液终浓度为：K+3mol/L，Ac5mol/L。溶液III中和溶液，复性质粒DNA；16酚/氯仿（1:1）酚变性蛋白质；氯仿萃取溶液中的酚； 分为两层，上层为水层，下层为酚氯仿混合液。吸取时不要震荡。17乙醇无水乙醇（2倍体积）沉淀质粒DNA；70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，除去沉淀中的盐分；1819核酸的定量260 nm，1OD值相当于：双链DNA浓度为50g/ml单链DNA浓度为40g/mlA260/A280 = 1.8（DNA）A260/A280 = 2.0（RNA）20电 泳 Electrophoresis 21一、定义电泳带电粒子在直流电场中向着电性相反电极移动的现象。电泳分析技术利

8、用电泳现象进行物质分离的技术。22二、电泳分析技术发展概况 1809年 发现电泳现象 1937年 Tiselius 自由界面电泳 1948年 Wieland 滤纸电泳 1980年 毛细管电泳 (capiliary electrophoresis)23三、电泳分析技术的分类1.根据被分离样品的量多少 分析电泳 制备电泳2.根据电泳电压的高低 常压电泳 0500 V 高压电泳 5003000V3.根据电泳中是否使用支持物 自由电泳不使用支持物，在溶液中进行。 区带电泳使用支持物244. 按支持物的物理性状不同滤纸及其他纤维薄膜电泳，如醋酸纤维素、玻璃纤维、聚氯乙烯纤维凝胶电泳，如琼脂、琼脂糖、硅胶

9、、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳粉末电泳，纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳丝状电泳，如尼龙丝、人造丝电泳255. 按支持物的装置形式不同平板式电泳垂直板式电泳垂直柱式电泳266.根据电泳系统pH是否连续连续pH电泳指电泳过程中pH保持不变；不连续pH电泳指电极缓冲液和电泳支持物的不同区段也有不同的pH ； 27电泳技术的特点:凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分离,并可进行定性或定量分析;样品用量极少;设备简单;可在常温进行;操作简便省时;分辨率高.28四、电泳的基本原理一个分子，如能解离或能吸附带电质点，在电场中便会向正极或负极移动。 29移动速度以蛋白质分子为例: F= EQ （Q：有效电荷; E

10、：电位梯度） F=6rv （F：摩擦阻力; v：在介质粘度中半径为r的颗粒的移动速度） F=F EQ=6rv E Q v= 6r 30 迁移率（Mobility)带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。 V Q M = = E 6r 31五、影响电泳速度的因素1.电场强度（E） E电流热效应支持介质上的水分蒸发样品的热变性 E电泳速度慢延长电泳时间样品扩散区带模糊不清分辨率下降2. 带点颗粒的半径 r 阻力电泳速度变慢3. 支持物介质吸附作用；电渗作用；分子筛作用缓冲液 离子强度（I）：I缓冲能力越大缓冲液所载的分电流增加，而样品所载的电流相应减少电泳速度减慢 pH：pH值决定了化合物解离的程度，

11、也决定了质点所带的净电荷。32电泳在一定电场强度下，DNA分子的迁移取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型(相对分子质量不同的DNA片段泳动速度不一样)，且DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。33琼脂糖凝胶从琼脂中除去带电荷的琼脂胶后，剩下的不含磺酸基团、羧酸基团等带电荷基团的中性部分，结构是链状的聚半乳糖，易溶于沸水，冷却后可依靠糖基间的氢键引力形成网状结构的凝胶。凝胶的网孔大小和凝胶的机械强度取决于琼脂糖浓度。因此琼脂糖凝胶可作为分子筛，常用于凝胶层析和电泳。 34电泳鉴定其中超螺旋结构泳动最快；其次为线性结构；最慢的可能是复制中间体（没