基因克隆及常见问题

1、内容概要 DNA克隆技术简介 DNA克隆常见的问题与对应策略DNA 克隆的目的目的基因的序列测定及筛选研究基因表达增加目的基因的拷贝，降低后续实验的难度其他（如点突变、SNP等）网上检索引物设计DNA提取PCR扩增扩增产物纯化与克隆载体连接感受态E.coli制备转化、培养重组克隆筛选PCR或酶切鉴定测序检测生物信息学分析等质粒提取克隆实验的步骤连接克隆分类（以PCR产物克隆为例）TA克隆应用最广的非定向克隆方法。PCR产物带有A末端，可以用带有T末端突出的T载体直接连接。方法简便，不需酶切，对引物设计也没有要求。酶切连接克隆PCR引物设计时引入载体上的酶切位点，PCR产物经双酶切后定向克隆到目

2、的载体上。这种方法的优点是定向连接克隆，筛选方便。缺点则是PCR产物的酶切和判断比较困难，另外酶切连接过程本身也相当地费时费力。 DNA 克隆的几大要素目的DNA片段克隆载体连接酶感受态细胞Taq、HotStart Taq DNA 聚合酶扩增产物为粘末端，可直接进行TA克隆pfu DNA 聚合酶扩增的产物为平末端，不能直接TA克隆，可加A处理或平末端连接Taq Plus、Long Taq、Taq Platinum DNA聚合酶产物为部分加A，可直接用于TA克隆，但克隆效率比Taq酶低，建议加A处理不同DNA聚合酶的PCR产物 PCR特异性好单一条带： DNA产物纯化试剂盒超薄DNA产物纯化试剂

3、盒普通DNA产物纯化试剂盒大量DNA产物纯化试剂盒寡核苷酸DNA产物纯化试剂盒 96 DNA产物纯化试剂盒PCR特异性不好多种条带：凝胶回收试剂盒超薄琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒大量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒聚丙烯酰胺凝胶DNA回收试剂盒目的DNA片段纯化 多余引物、多余dNTP、多余镁离子等，可能会影响后续连接反应，建议纯化。所用洗脱液量对回收效率的影响DNA纯化常见问题及对策凝胶回收无产物或者回收率低回收DNA质量不好DNA纯化常见问题及对策凝胶无回收产物或回收率低电泳缓冲液老化，PH值升高起始量少PW未去除干净使用去离子水进行洗脱洗脱缓冲液用量过少使用新配制的

4、缓冲液进行制胶和电泳增加回收起始量空甩2分钟或于50度温箱中放置5-10分钟，充分去除PW最好用试剂盒配备的EB进行洗脱根据起始量使用合适体积的洗脱液回收DNA质量不好洗脱产物含有乙醇残留 洗脱时硅胶膜或硅胶树脂上有漂洗液残留，会使洗脱产物中含有乙醇，影响下游操作。在洗脱前可通过再次离心或置于50烤箱中 510分钟，彻底去除漂洗液。DNA纯化常见问题及对策DNA 克隆的几大要素目的DNA片段克隆载体连接酶感受态细胞 载体3端的T与PCR产物3端的A互补连接，同时3突出端可防止载体自身环化，大大提高PCR产物的连接和克隆效率。 二者区别：多克隆区域的酶切位点不同普通克隆T载体分光光度法 受缓冲体

5、系、样品稀释度、核酸二级结构、仪器本身等影响DNAmarker定量法 EB分子插入DNA分子碱基间 50ngDNA即可显现清晰条带 定量方便直观载体与片段的摩尔比1:3-1:8TIANGEN公司的MarkerMD100系列单一条带混合而成严格控制每条50ng特别加亮的100ngMD200系列 单一质粒DNA或噬菌体 DNA单酶切而成 按比例计算每条带的质量100 bp LadderDNA 克隆的几大要素目的DNA片段克隆载体连接酶感受态细胞T4 DNA连接酶作用机理 催化相邻DNA链的5-P末端和3-OH末端以磷酸二酯键结合的反应，需ATP作辅酶。 本酶不仅可以催化粘性末端之间或平滑末端之间的

6、DNA的连接，也可以催化DNA与RNA之间以及少数RNA之间的连接。 反应条件: 4 或16过夜对应载体: pBS-T、pGM-T反应组分反应体系 阳性对照 反应条件目的PCR 片段 2 7 l 4或者16过夜2226快速连接（0.52小时）对照插入片段（700 bp, 50 ng/l） 1 l T载体 1 l 1 l Ligase 0.5-1 l 0.5-1 l 10Ligation Buffer 1 l 1 l 无菌去离子水 补足到10 l 补足到10 l 连接体系DNA 克隆的几大要素目的DNA片段克隆载体连接酶感受态细胞感受态细胞感受态细胞的种类：化学转化、电转化感受态效率的测定保存：

7、-70冻存，避免反复冻融常用于制备感受态的 E.coli 宿主菌TIANGEN感受态细胞Top10：转化效率高达108，适用于高效DNA克隆和质粒扩增DH5a ：转化效率高达108，适用于高效DNA克隆和质粒扩增BL21 ( DE3)：适合含T7启动子的载体中目的基因的表达BL21 ( DE3) pLysS：适合毒性蛋白和非毒性蛋白的表达TA克隆-转化连接产物混合冰浴30 min42度 1-2 min37度复苏培养37度过夜培养根据重组载体的抗性标志抗氨苄青霉素、抗卡那霉素、lacZ基因PCR法用特定引物以转化细胞为模板进行扩增酶切法酶切，比较载体限制酶内切图谱的变化测序一般都会用测序对目的序

8、列做最后鉴定重组子的鉴定方法内容概要 DNA克隆技术简介 DNA克隆常见的问题与对应策略DNA克隆常见问题之一感受态细胞低效抗生素使用错误转化后立即涂板忘记温浴使用高效率的感受态细胞（106以上）复查质粒抗性，使用正确的抗生素转化后温浴45min左右，让抗性基因得以表达转化后无克隆产生原因对策DNA克隆常见问题之二A或T突出端丢失插入片段与载体比例不适 PCR 产物中含有抑制连接的成分 PCR 产物已经插入，但未破坏lacZ 基因的翻译框 连接的PCR片段中可能有引物二聚体连接时间不够；温度太高使用新扩增的PCR产物，避免引入核酸外切酶与片段载体的比例：1:3-1:8再次纯化PCR产物进行连接

9、适当延长连接时间；连接温度过高（28）可使背景增加室温连接时勿超过26 白斑少原因对策DNA克隆常见问题之三未加IPTG/X-Gal或其失效抗生素失活，敏感菌亦能生长用于制备感受态的菌株退 化，丢失了某些重要因子 检查平板是否含IPTG/X-Gal 以及平板是否新鲜制备 复查抗生素的抗性用于制备感受态的菌株，传代次数不能太多（20代以内为佳）只有白色菌落原因对策DNA克隆常见问题之四PCR产物不纯，非目的条带亦被克隆PCR部分产物发生A尾丢失PCR所用酶不在产物3端加A或只是部分加A片段与载体比例不适重新纯化PCR产物PCR扩增后，尽量少放置，直接进 行后续的回收连接，以防A尾丢失除Taq酶外，使用其它酶扩增的产物在用于TA克隆时都建议先加A, 再连接 调整片段与载体的比例，控制在1:3-1:8之间阳性克隆率低原因对策DNA克隆相关产品DNA克隆载体与连接转 化载体T4连接酶pBS-T连接试剂盒pGM-T连接试剂盒pCF-T连接试剂盒感受态细胞快速克隆试剂盒TOP10DH5目的片段凝胶回收试剂盒DNA MarkerDNA纯化试剂盒BL21BL21plysToll-free: 800-810-