酶固定修饰和改造

1、关于酶的固定修饰与改造第一张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月游离酶的缺点1. 酶是蛋白质，在水溶液中（细胞外）稳定性差（热、酸碱、有机溶剂对其有影响）；2. 不能回收，一般不能反复使用，常使产物中混杂酶蛋白，不易与产物分离，不利于产物的提纯和精制；3. 酶活性不够高；4. 分离纯化困难；5. 具有抗原性。第二张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月第一节 固定化酶与固定化细胞一、酶的固定化二、细胞的固定化三、辅酶的固定化第三张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月一、酶的固定化（一）概念及其优缺点 固定化酶(immobilized enzyme): 是指将水溶性酶经过化学或物

2、理手段处理，固定在载体上，在一定的空间范围内起催化作用，并能反复和连续使用的（不溶于水）酶。水溶性酶水不溶性载体水不溶性酶（固定化酶）固定化技术第四张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月酶固定化的基本要求 尽可能的保持酶的活性和专一性； 固定化载体应该与酶结合较为牢固，不与底物、产物发生反应，达到多次回收和反复使用； 酶固定化后产生的位阻应该较小，不妨碍酶与底物接近； 成本尽可能低。第五张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月固定化酶的优缺点优点：（1）可多次使用；（2）可以装塔连续化生产（反应）；（3）不溶于水，易于与产物分离，纯化简单；（4）稳定性好，提高产物质量；（5）提供了研

3、究酶动力学的良好模型。（6）应用范围广。缺点：（1）首次投入成本高；（2）大分子底物较困难；（3）固定化过程中往往会引起酶的失活。第六张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月（二）酶固定化的方法固定化方法吸附法共价结合（偶联）法交联法包埋法网格型微囊型离子交换吸附物理吸附法 无载体固定法多方法联用第七张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月第八张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月第九张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月第十张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月第十一张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月各类固定化方法的特点比较比较项目吸附法共价结合法 交联法

4、包埋法物理吸附共价键结合离子键结合 制备难易易难易 较难较难固定化程度弱强中等 强强活力回收率较高低高 中等高载体再生可能不可能可能 不可能不可能费用低高低 中等低底物专一性不变可变不变 可变不变适用性酶源多较广广泛 较广小分子底物、药用酶第十二张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月1. 吸附法 根据吸附剂的特点分:物理吸附法和离子交换吸附法（1）物理吸附法（physical adsortion）：通过酶与载体之间的范德华力、氢键、疏水作用力等将酶与载体联系起来的方法。第十三张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月吸附法作用力：范德华力、氢键、疏水作用力选择载体的原则：有机载体和无机

5、载体。 要有巨大的比表面积； 要有活泼的表面； 便于装柱进行连续反应。常用载体：氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石、纤维素、骨胶原、火棉胶、淀粉等。第十四张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月吸附法的类型根据吸附剂的特点分: 物理吸附法和离子交换吸附法（2）离子交换吸附(结合)法（ion binding）： 通过离子效应，将酶分子固定到含有离子交换基团的固相载体上的固定化方法。 作用力：离子键 常用载体：DEAE-Cellulose （二乙氨乙基-纤维素）；DEAE-dextran gel （ 二乙氨乙基 -葡聚糖凝胶）；CM-cellulose （羧甲基纤维素；car

6、boxymethyl cellulose）。第十五张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月吸附法的优缺点优点：条件温和，操作简便，酶活力损失少。缺点：结合力弱，易解吸附。第十六张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月2. 包埋法定义：将酶或含酶菌体用物理的方法包埋在各种具有特定网状结构（多孔）载体（高聚物）中，使酶固定化的方法称为包埋法。第十七张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月包埋法的类型分为：凝胶包埋法和微胶囊包埋法（1）凝胶包埋法（网格型包埋法）：将酶包埋在交联的水不溶的高分子凝胶细微网格中。 常用的凝胶可分为天然凝胶和人工凝胶。如海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、琼脂凝胶、卡拉

7、胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光交联树脂等合成凝胶。第十八张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月凝胶包埋法的种类聚丙烯酰胺凝胶包埋法：将酶包埋在聚丙烯酰胺凝胶中。海藻酸钙包埋法：凝胶包埋法常用的载体有利用海藻提取物海藻酸钠制成凝胶。琼脂糖凝胶包埋法：利用熔化的琼脂在温度低于50凝固的特性来包埋酶。第十九张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月使用的多孔载体及其特点凝胶包埋条件酶活性强度天然凝胶琼脂;海藻酸钙;角叉菜胶;明胶温和不变差合成凝胶聚丙烯酰胺、光交联树脂聚合反应部分失活高第二十张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月（2）微胶囊包埋法（半透膜包埋法） 微胶囊包埋即

8、将酶包埋在各种高聚物制成的半透膜微胶囊内的方法。 半透膜：直径几十微米到几百微米，厚约25nm。 半透膜孔径小于酶分子孔径，小于半透膜孔径的小分子底物和产物可以自由进出，被称为“人工细胞”。 它使酶存在于类似细胞内的环境中，可以防止酶的脱落，防止微囊外的环境直接接触，从而增加了酶的稳定性。 常用于制造微胶囊的材料有聚酰胺、火棉胶、醋酸纤维素等。第二十一张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月（3）纤维素包埋法 常用于大规模生产。通过多孔喷丝头形成中空纤维，将酶包埋在纤维内。第二十二张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月包埋法的优缺点 优点： 在于它是一种反应条件温和、很少改变酶结构但

9、是又较牢固的固定化方法。 缺点： 只有小分子底物和产物可以通过高聚物网架扩散，对那些底物和产物是大分子的酶并不适合。 这是由于高聚物网架会对大分子物质产生扩散阻力导致固定化酶动力学行为改变，使活力降低。第二十三张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月3. 共价结合（偶联法）（Covalent binding or covalent coupling） 共价结合（偶联）法是目前研究中最为活跃的方法。（1）原理：酶蛋白分子上的功能基团与载体（固相支持物）表面上的反应基团之间以共价键的作用而实现结合的固定化方法。（借助共价键将酶的非活性必需侧链基团和载体的功能基团进行偶连）。（2）载体选择的要求

10、： 尽量选择亲水性强的载体； 载体结构疏松，表面积大，有一定的机械强度； 载体必须有在温和条件下与酶共价结合的功能基团； 载体没有或很少有非专一性吸附； 载体容易获得，能反复使用。第二十四张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月共价结合（偶联法）（3）酶蛋白可以形成共价键的基团： 游离氨基、游离羧基、 巯基、 咪唑基、 酚基、 羟基、 甲硫基、 吲哚基、二硫键。 酶蛋白N末端的- 氨基或赖氨酸残基的- 氨基。 酶蛋白C末端的- 羧基、天门冬氨酸残基的-羧基以及谷氨酸残基的-羧基。 半胱氨酸残基的巯基。 丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的羟基。 组氨酸残基的咪唑基。 色氨酸残基的吲哚基。 苯丙氨酸

11、和酪氨酸残基的苯环。第二十五张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月共价结合（偶联法）（4）常用的载体： 天然高分子、人工合成的高聚物、无机载体。亲水载体优于疏水载体。 天然高分子衍生物: 纤维素、琼脂糖、葡聚糖凝胶；亲和性好，机械性能差。 合成聚合物： 聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、尼龙；机械性能好，但有疏水结构。第二十六张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月共价结合（偶联法）（5）载体活化（偶联）的方法： 溴化氰法：即用溴化氰将含有羟基的载体，如纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等，活化生成亚氨基碳酸酯衍生物，然后再与酶分子上的氨基偶联，制成固定化酶。 叠氮法：即载体活化生成叠氮化合物，再与

12、酶分子上的相应基团偶联成固定化酶。 烷基化反应法：以卤素为功能团的载体可与酶蛋白分子上的氨基、巯基、酚基等发生烷基化或芳基化反应而使酶固定化。 重氮法：重氮法是将酶蛋白与水不溶性载体的重氮基团通过共价键相连接而固定化的方法，是共价键法中使用最多的一种。 硅烷化法：可在二氧化硅表面引入氨基，活化的表面可以利用一些中间分子（如二氯硫化碳）进一步和酶分子发生连接反应。第二十七张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月4. 交联法 交联法（cross-linking）是利用双功能或多功能试剂在酶分子之间、酶分子与惰性蛋白间或酶分子与载体间进行交联反应，形成网状结构的酶固定化方法。 由于酶蛋白的功能团

13、，如氨基、酚基、巯基和咪唑基，参与此反应，所以酶的活性中心构造可能受到影响，而使酶失活明显。但是尽可能地降低交联剂浓度和缩短反应时间将有利于固定化酶活力的提高。 此法与共价结合（偶联）法利用的均是共价键，不同之处是什么？ 交联法不使用载体！第二十八张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月交联法常用试剂 戊二醛、己二胺、异氰酸衍生物、N,N-乙烯马来亚胺、双重氮联苯胺和N,N-乙烯双顺丁烯二酰亚胺等。 其中应用最广泛的是戊二醛，它的两个醛基都可以与酶或蛋白质的游离氨基形成席夫碱(shiff base) ，从而使酶分子之间相互交联形成固定化酶。第二十九张，PPT共一百零五页，创作于2022年6

14、月共价交联法的四种形式（1）酶直接交联法：（2）酶辅助蛋白交联： 当可得到的酶量有限，可以使用第二个“载体”蛋白来增加蛋白质浓度，从而使酶与惰性蛋白共交联的方法。第三十张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月共价交联法的四种形式（3）吸附交联法： 此法先将酶吸附在硅胶、藻土、氧化铝、球状酚醛树脂或其他大孔型离子交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交联，用此法所得固定化酶也可称为壳状固定化酶。（4）载体交联法： 用多功能试剂的一部分功能基团化学修饰高聚物载体，而其中的另一部分功能基团偶联酶蛋白。第三十一张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月四种固定化酶制备方法的特点小结指标物理吸附包埋法

15、共价结合法共价交联法物理吸附法离子吸附法制备易易较难难较难结合程度弱中等强强强酶活力回收高，易流失高高中中底物专一性无变化无变化无变化有变化有变化再生可能可能不可能不可能不可能固定化费用低低中高中第三十二张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月（三）固定化酶的评价(一) 固定化酶(细胞)的活力测定 固定化酶通常呈颗粒状，一般用于测定自然酶活力的方法改进后才能用于测定固定化酶。 (二) 蛋白总量测定 1.双辛可宁酸法(Bicinchoninic acid;BCA法) 2.考马斯亮蓝法:(三) 偶联率及比（相对）活力测定第三十三张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月（三）固定化酶的评价(

16、四) 固定化酶的操作半衰期 在连续测定条件下，固定化酶(细胞)的活力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间，以t1/2表示。是衡量稳定性的一项重要指标。(五) 相对酶活力 具有相同酶蛋白量的固定化酶活力与游离酶活力的比值。第三十四张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月（四）固定化酶的性质和影响因素1. 固定化酶的形状 固定化酶的形式多样，依不同用途有颗粒、线条、薄膜和酶管等形状。 其中颗粒占绝大多数，它和线条主要用于工业发酵生产，如装成酶柱用于连续生产，或在反应器中进行批式搅拌反应； 薄膜主要用于酶电极，应用于分析化学；酶管机械强度较大，适用于工业生产。第三十五张，PPT共一百零五页，创

17、作于2022年6月（四）固定化酶的性质和影响因素2. 固定化对反应体系造成的效应 酶经过固定化后引起的性质改变，不外乎两种原因：一是酶本身的变化，二是受固定化载体的物理或化学性质的影响。（1）构象效应：酶分子在固定化过程中，酶分子与载体相互作用使得酶的活性中心或变构中心构象发生变化。（2）屏蔽效应：酶经固定化后，载体会成为底物或者其他效应物结合到活性中心或者变构中心的空间障碍，可以通过加入连接臂的方式进行改善。第三十六张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月固定化酶的性质和影响因素（3）微扰效应：酶固定化后，载体固有的性质会引起紧邻固定化酶的微环境的变化，使酶的催化能力及酶对效应物作出调节

18、反应的能力发生改变。（4）分配效应：由于载体的亲水或者疏水特性以及带电特征使底物、产物或其他效应物在每所处的微环境和宏观体系间发生不等分配，改变了酶反应体系的组成平衡。（5）扩散限制效应：指底物、产物和其他效应物在酶的微环境区与宏观体系之间迁移和运转速度受到限制的一种效应。第三十七张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月3. 固定化酶（细胞）性质的改变 （1）固定化酶的活力在大多数情况下比天然酶下降，其专一性也会受到影响发生改变。 活力下降的原因： 酶分子在固定化过程中，由于构象效应或调节中心空间构象发生变化或者屏蔽效应造成酶的空间构像发生了变化，活性中心无法与底物结合； 部分活性中心的氨

19、基酸残基参与了与载体的结合，导致部分酶完全丧失了活性； 固定化后的空间障碍效应的影响； 内扩散阻力的影响使底物分子与活性中心的接近受阻； 包埋法时被高分子物质半透膜包围。第三十八张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月固定化酶（细胞）性质的改变（2）固定化后酶稳定性提高 稳定性提高的原因： 固定化后的酶与载体多点连接，可防止酶分子伸展变形； 酶活力的缓慢释放； 反应开始只有部分酶起作用，其余部分仅在开始起作用的酶变性后才起作用； 抑制自降解，提高了酶稳定性。第三十九张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月固定化酶（细胞）性质的改变（3）固定化酶（细胞）的最适pH变化 酶固定化后，对底物

20、的最适pH曲线常常发生偏移。 变化规律： 一般来说，带负电荷载体制备的固定化酶，其最适pH值较游离酶偏高；反之，若使用带正电荷载体的话，其最适pH值较游离酶偏低，即向酸性偏移。 原因：一是酶本身电荷在固定化前后发生变化；二是由于载体电荷性质的影响致使固定化酶分子内外扩散层的氢离子浓度产生差异；三是由于酶催化反应产物导致固定化酶分子内部形成带电荷微环境。一般来说，产物为酸性时固定化酶的最适pH比游离酶高一些；产物为碱性时，固定化酶的最适pH比游离酶低一些，产物为中性时，最适pH一般不改变。第四十张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月固定化酶（细胞）性质的改变（4）固定化酶（细胞）的最适温度

21、的变化 固定化酶的最适反应温度多数较游离酶高，如色氨酸酶经共价结合后最适温度比固定前提高515，但也有不变甚至降低的。固定化酶的作用最适温度会受固定化方法以及固定化载体的影响。 酶反应的最适温度是酶热稳定性与反应速度的综合结果。因为固定化后，酶的热稳定性提高，所以最适温度也随之提高，这是很有利的结果。第四十一张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月固定化酶（细胞）性质的改变（5）酶固定后动力学参数(米氏常数；Km)的变化 米氏常数Km反映了酶与底物的亲和力。酶经固定化后，酶蛋白分子的高级结构的变化以及载体电荷的影响可导致底物和酶的亲合力的变化。固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电性能变化

22、。 简单说，由于高级结构变化及载体影响引起酶与底物亲和力变化，从而使Km变化。而这种Km变化又受到溶液中底物离子强度影响：离子强度升高，载体周围的静电梯度逐渐减小，Km变化也逐渐缩小以至消失。第四十二张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月固定化酶（细胞）性质的改变（6）固定化酶底物特异性发生变化 固定化酶的底物特异性与底物分子量的大小有一定关系。 一般来说，当酶的底物为小分子化合物时，固定化酶的底物特异性大多数情况下不发生变化。例如，氨基酰化酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖异构酶等，固定化前后的底物特异性没有变化；而当酶的底物为大分子化合物时，如蛋白酶、-淀粉酶、磷酸二酯酶等，固定化酶的底物特异

23、性往往会发生变化。 这是由于载体引起的空间位阻作用，使大分子底物难以与酶分子接近而无法进行催化反应，酶的催化活力难以发挥出来，催化活性大大下降。第四十三张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月二、细胞的固定化1. 概念： 固定化细胞（immobilized cell）：固定在载体上并在一定空间范围内进行生命活动（生长、繁殖、新陈代谢）的细胞。第四十四张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月二、细胞的固定化2. 固定化细胞（原生质体）的意义： (1) 使用固定化细胞省去了酶的分离手续，可显著降低成本。 (2) 固定化细胞为多酶系统，无须辅因子再生。 (3) 细胞固定化后对不利环境的耐受性

24、增加，细胞可重复利用，简化了细胞培养过程。 (4) 保持酶在细胞内的原始状况，增加了酶的稳定、特别是对污染因子的抵抗力增加。 (5)细胞生长快而且多，可以连续发酵，节约了成本，而且在蒸馏和提取前不用分离去细胞，能一边排出发酵液，一边进行培养，排除了产物抑制和消耗。 (6) 固定化细胞（原生质体）去除了细胞壁的扩散障碍，有利于氧的传递，营养成分的吸收和胞内产物的分泌。第四十五张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月固定化细胞同时也存在些缺点 (1) 必须保持菌体的完整，防止菌体自溶，否则，将影响产品纯度。 (2) 必须防止细胞内蛋白酶对所需酶的分解，同时，需抑制胞内其他酶的活性防止副产物的形

25、成。 (3) 细胞膜、细胞壁会阻碍底物渗透和扩散。第四十六张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月（一）植物细胞固定化 植物细胞比菌体细胞娇嫩得多，需要温和的固定化方法。 1. 吸附法：吸附法是将植物细胞吸附在泡沫塑料的孔洞或裂缝内，或吸附于中空纤维外壁上。 2. 包埋法： 包埋法是将植物细胞包埋于琼脂、海藻酸钙、聚丙烯酰胺、明胶和角叉菜胶等多孔凝胶中。第四十七张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月（二）动物细胞固定化 动物细胞比菌体细胞、植物细胞更娇嫩，需要最温和的固定化方法。目前,动物细胞固定的方法有吸附法和包埋法两种，其中吸附法用的最多。 1. 吸附法：由于大多数动物细胞属于附

26、着细胞，它们在培养过程中趋向于附着固体表面。因此，吸附法特别适合于制备固定化动物细胞。主要载体及固定方法有： （1）转瓶法：转瓶是由玻璃或塑料制成。 （2）微载体法：微载体是指直径为100 200 um，相对密度接近于1.0 的颗粒固定化载体。它是由表面带有电荷的葡聚糖、明胶、纤维素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯或玻璃等材料制成的。 （3）中空纤维法：中空纤维由聚丙烯、硅化聚碳酸脂等高分子聚合物制成。第四十八张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月（二）动物细胞固定化2. 包埋法： 包埋法根据载体与方法不同，亦有凝胶包埋法和半透膜包埋法两种。 （1）凝胶包埋法：用于动物细胞固定化的凝胶主要有琼脂糖

27、凝胶、海藻酸钙凝胶和血纤蛋白等。 （2）半透膜包埋法：利用高分子聚合物形成的半透膜将动物细胞包埋，形成微囊形固定化动物细胞。第四十九张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月三、辅酶的固定化 由于辅酶与酶的结合不牢固，必须考虑将辅酶固定化。 1. 原因： （1）有机辅因子中具有某些特殊的化学基团，参与酶的催化反应； （2）有机辅因子在使用过程中要流失，并且不能自行再生； （3）有机辅因子价格昂贵 工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留和再生。 2 . 固定化方法与酶相似，一般采用载体结合法和包埋法。如利用溴化氰法、碳二亚胺法以及重氮偶联法等共价偶联，或将其进行适当的化学修饰后固定在超滤器中。

28、 3. 辅酶固定化必须解决辅酶在多个酶之间传递的障碍。第五十张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月辅酶NAD+在琼脂糖凝胶上的固定化第五十一张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月第五十二张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月第二节 化学酶工程一、酶分子的化学修饰二、模拟酶三、抗体酶四、印迹酶第五十三张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月生物酶工程与化学酶工程 1. 生物酶工程 (1) 采用基因重组技术，利用微生物、动植物细胞作为生物反应器大量生产酶。 (2) 通过基因工程技术，使酶基因发生定位突变，产生遗传性修饰酶(突变酶)。 (3) 设计新酶基因，合成自然界不曾有的新

29、酶。 2. 化学酶工程 (1) 自然酶：是指由生物材料中分离出来的酶。 (2) 化学修饰酶又称“生物分子工程” ：是通过对酶分子实行“手术”以达到改构和改性的目的。 (3) 固定化酶：是将酶分子通过吸附、交联、包埋及共价键结合束缚于某种特定支持物上而发挥酶的作用。具有能反复使用、产物易纯化、可用微电脑控制，实行自动化连续化生产等优点。 (4) 人工合成酶：模拟酶的催化功能，用化学方法合成具有专一性的催化剂。第五十四张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月一、酶分子的化学修饰 通过各种方法可使酶分子结构发生某些变化，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子的修饰。 通常把把改变酶蛋白一

30、级结构的过程称为改造，把侧链基团的共价变化称为修饰。（一）酶分子化学修饰的定义： 通过对主链的 “切割”、“剪切” 和侧链基团的 “化学修饰” 对酶蛋白进行分子改造，以改变酶分子的结构、理化性质及生物活性，这种应用化学方法对酶分子进行种种 “手术” 的技术，称为酶分子的化学修饰。第五十五张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月酶分子的化学修饰（二）酶分子修饰的意义 1. 改变活性部位的构象； 2. 提高酶的生物活力 （activity）； 3. 增强酶的稳定性（ stability）； 4. 降低或消除酶类药物的抗原性 （immunological property）； 5. 改变酶学性质

31、：研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响（ structure ）。第五十六张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月（三）酶化学修饰的原理、方法及修饰剂1. 酶化学修饰的原理 对酶分子进行修饰必须在修饰原理、修饰剂和反应条件的选择以及酶学性质等方面都要有足够的了解。 （1）酶的稳定性：热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、pH、抑制剂等。 （2）被修饰的酶：活性中心基团、辅因子等。其他如分子大小、性状、亚基数等。 （3）修饰条件的选择：修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行，并尽量不破坏酶活性功能的必需基团，使修饰率高，同时酶的活力回收高。 pH与离子强度

32、：pH决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。由于它们的解离状态不同，反应性能也不同。 修饰反应的温度与时间：严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专一性的修饰反应。 反应体系中酶与修饰剂的比例：第五十七张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月酶化学修饰的原理、方法及修饰剂 （4）修饰剂的选择：选择修饰剂时要求具有较大的相对分子量，对蛋白质的吸附具有良好的生物相容性和水溶性，修饰剂表面有较多的活性基团，还要考虑修饰剂上的反应基团的活化方式和活化条件，以及修饰后酶活性的半衰期。 修饰剂的选择在很大程度上使依据修饰目的而定。 修饰剂的大小也是选择时要考虑的。第五十八张，PPT共一百零五页，创作

33、于2022年6月酶化学修饰的原理、方法及修饰剂2. 酶化学修饰的方法：（1）酶分子侧链基团的化学修饰： 氨基的化学修饰： 来源：Lys, Arg, His, Gln。 修饰反应：酰基化与烷基化。 酰基化修饰剂: 三硝基苯磺酸（TNBS）、丹磺酰氯（DNS）。 烷基化修饰剂：2,4二硝基氟苯（DNFB）、碘乙酸、碘乙酰胺、亚硝酸等。 羧基的化学修饰： 修饰羧基的反应专一性较差。常用水溶性碳化二亚胺修饰天冬氨酸和谷氨酸。可定量测定酶分子中羧基的数目。第五十九张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月酶化学修饰的原理、方法及修饰剂 巯基的化学修饰 来源：Cys 修饰反应:烷基化 修饰剂：碘乙酸(I

34、AA)、碘乙酰胺(IAM)、N-乙基马来酰亚胺(NEM)(常用的专一修饰巯基试剂)。 咪唑基的化学修饰 来源：His 修饰反应:酰基化与烷基化 酰基化修饰剂:常用焦碳酸二乙酯（diethyl paracarbonate）； 烷基化修饰剂：碘乙酸。第六十张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月酶化学修饰的原理、方法及修饰剂 胍基的化学修饰 来源：Arg 修饰反应：本质上是羰基对氨基酰基化。 修饰剂：二羰基化合物 丁二酮、 1,2环己二酮、苯乙二醛。 吲哚基的化学修饰 来源：Trp 修饰反应：氧化反应 修饰剂： N-溴代琥珀酰亚胺 酚羟基的化学修饰 来源：Tyr 修饰反应：芳香环取代反应 修饰

35、剂：碘、硝化试剂（四硝基甲烷） 甲硫氨酸残基的化学修饰：第六十一张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月酶化学修饰的原理、方法及修饰剂（2）酶分子表面的化学修饰 聚乙二醇对酶的修饰：聚乙二醇(PEG)用得最多的是分子量在500020,000范围内的修饰剂，因为该类分子既能溶于水，又可以溶于大多数有机溶剂，是两亲分子，无免疫原和毒性，体内不残留。 实际使用过程中多采用单甲基聚乙二醇(MPEG)的衍生物。如MPEG均三嗪类、MPEG的琥珀酰亚胺类、MPEG氨基类衍生物。 右旋糖酐及右旋糖苷硫酸酯对酶的修饰：是由葡萄糖通过-1,6 -糖苷键形成的多糖，具有较好的水溶性和生物相容性，可作代血浆用。

36、第六十二张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月酶化学修饰的原理、方法及修饰剂 糖肽对酶的修饰：是纤维蛋白酶或蛋白水解酶降解纤维蛋白或球蛋白获得。 具有生物活性的大分子对酶的修饰：常用的是肝素。是一种含硫酸酯的黏多糖。 蛋白质或其它大分子对酶的修饰：主要是血清蛋白质。第六十三张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月（四）修饰酶的化学性质1. 修饰酶的稳定性得到提高；2. 修饰酶的抗原性得到降低；3. 修饰酶的最适pH值变化得更有应用价值；4. 修饰酶的动力学性质：通常Km值改变。第六十四张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月二、模拟酶第一节 模拟酶概论第二节 模拟酶的理论基础和策

37、略第三节 模拟酶的分类和制备第六十五张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月第一节 模拟酶概论 模拟酶：根据酶的作用原理，用人工的方法合成的具有活性中心和催化作用的非蛋白质结构的化合物。 1. 模拟酶的金属辅基：模拟酶研究的重要内容之一就是模拟酶分子中的金属辅基的作用。 2. 模拟酶的活性功能基：模拟活性中心的几个活性功能基团。 3. 模拟酶的高分子作用方式：利用高分子化合物作为模型化合物的骨架，引入活性功能基来模拟酶的高分子作用方式。 4. 模拟酶与底物的作用：利用合成的化合物来模拟酶的空间结构。如冠醚化合物空穴。 5. 模拟酶的形状：第六十六张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月

38、第二节 模拟酶的理论基础和策略1. 模拟酶的酶学基础 酶的作用机制：过渡态理论 模拟酶的设计：一方面基于酶的作用机制；另一方面要基于对简化的人工体系中识别、结合和催化的研究。第六十七张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月第二节 模拟酶的理论基础和策略2. 超分子化学基础 主-客体化学：主体和客体在结合部位的空间及电子排列的互补。 超分子：该分子形成源于底物和受体的结合，这种结合基于非共价键相互作用，当接受体与络合离子或分子结合形成具有稳定结构和性质的实体，形成超分子。 功能：分子识别、催化、选择性输出。第六十八张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月第二节 模拟酶的理论基础和策略3.

39、 设计要点（1）设计前： 酶活性中心-底物复合物的结构； 酶的专一性及其同底物结合方式的能力； 反应的动力学及各中间物的知识。 （2）设计中： 为底物提供良好的微环境； 催化基团必须相对于结合点尽可能同底物的功能团相接近； 应具有足够的水溶性，并在接近生理条件下保持其催化活性。第六十九张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月第三节 模拟酶的分类和制备一. 根据Kirby分类法 1. 单纯酶模型：化学方法通过天然酶活性的模拟来重建和改造酶活性。 2. 机理酶模型：通过对酶作用机制诸如识别、结合和过渡态稳定化的认识，来指导酶模型的设计和合成。 3. 单纯合成的酶样化合物：化学合成的具有酶样催化

40、活性的简单分子。二. 按照模拟酶的属性 主-客体酶模型；胶束酶模型；肽酶； 抗体酶；分子印迹酶模型；半合成酶。第七十张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月胶束酶模型第七十一张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月水解酶模型模拟唯铁氢化酶模型第七十二张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月三、抗体酶（一）抗体酶的概念： 抗体酶（abzyme）又称催化抗体（catalytic antibody），是指通过一系列化学与生物技术方法制备出的具有催化活性的抗体，它除了具有相应免疫学性质，还类似于酶，能催化某种活化反应。将这类具催化能力的免疫球蛋白称为催化抗体，即抗体酶。 它是利用现代生物学

41、、化学的理论与技术交叉研究的成果，是一种对其 可变区赋予了酶的属性的具有催化功能的抗体分子，是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物。第七十三张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月抗体与酶的异同 相同点：都是蛋白质，都有特异性。 不同点：（1）抗体无催化活力，酶有催化活力。（2）本质差别：酶是能与反应过渡态选择结合的催化物质，抗体是和基态紧密结合的物质。（3）酶的活性和合成受到代谢调节，种类有限。 抗体只有在抗原存在时才产生，种类无限。第七十四张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月（二）抗体酶的催化特性 1. 抗体酶的理论基础 过渡态理论认为，酶与底物的结合经历了一个易于

42、形成产物的过渡态，实际上是降低了反应所需的活化能。第七十五张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月（二）抗体酶的催化特性 利用抗体能与抗原特异结合的原理，以过渡态类似物作为半抗原来诱导与其互补构象的抗体，使其具有催化活性; 这样产生的抗体能特异地识别反应过程中真正的过渡分子，可观察到抗体催化相应底物发生化学反应，降低反应的活化能达到催化反应的目的。第七十六张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月2. 抗体酶的特点（1）与天然酶相比抗体酶的特点 能催化一些天然酶不能催化的反应： 有更强的专一性和稳定性：催化抗体作为一种具有酶和抗体双重功能的新型生物大分子，用作分子识别元件，具有优于酶和抗

43、体的突出特点。 催化作用机制不同：目前不太清楚。第七十七张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月（2）抗体酶和非催化性抗体作用的比较 更高的反应特异性： 反应的可逆性： 反应的量效关系：抗原与抗体结合需要比例合适，任何一种过多都不利于反应；抗体酶与底物结合，在其它条件均合适的情况下，增加抗体浓度显著加速酶反应。 反应过程：均可分为结合阶段和反应阶段。第一阶段无差别，第二阶段抗体酶催化底物分解，底物分子有变化。第七十八张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月（三）抗体酶的催化机理（1）过渡态理论与抗体酶：（2）抗体酶催化的三种重要反应机制 水解作用机制： 基团转移： 连续反应机制：（3）

44、抗体酶催化反应的介质效应 酯解反应中介质效应 ： 抗体酶在有机溶剂中具稳定性。 脱羧反应中介质效应 ：有机溶剂引起脱羧反应速率增加。 酰基转移反应中介质效应 ：在疏水溶剂中，活性较高。第七十九张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月（四）抗体酶催化反应的类型1. 转酰基反应:2. 水解反应:3. Claisen重排反应:烯丙基醚在高温下重排成邻烯丙基酚的反应。4. 酰胺合成反应:5. Diels-Alder反应:又名双烯加成，由共轭双烯与烯烃或炔烃反应生成六元环的反应，是有机化学合成反应中非常重要的碳碳键形成的手段之一，也是现代有机合成里常用的反应之一。 6. 转酯反应:7. 光诱导反应:

45、8. 氧化还原反应:9. 脱羧反应:10. 顺反异构化反应:第八十张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月（五）抗体酶的制备方法 将抗体转变为酶可通过诱导法、拷贝法、引入法、化学修饰法等途径。 1. 诱导法是利用反应过渡态类似物为半抗原制作单克隆抗体，筛选出具高催化活性的单抗即抗体酶。 2. 拷贝法主要根据抗体生成过程中抗原-抗体互补性来设计的。 3. 引入法则借助基因工程和蛋白质工程将催化基因引入到特异抗体的抗原结合位点上，使其获得催化功能。 4. 化学修饰法对抗体进行化学修饰，使抗体与催化基团相连。第八十一张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月（六）抗体酶的应用前景1. 将不可能

46、发生的反应变为可能；2. 使苛刻条件下的反应变为温和条件下的反应；3. 可选择性的催化平行反应中的某一反应，大大增加产品的产率；4. 用于快速分析氨基酸序列；5. 用病毒蛋白水解过程中的过渡肽类似物诱导抗体酶，可作为药学上的接种疫苗；6. 指导未知酶的寻找；7. 抗体酶在帮助戒毒方面的应用 ：用人工抗体酶的被动免疫也许能阻断可卡因上瘾，达到戒毒目的 ；8. 抗体酶用于肿瘤治疗：目前正在发展一种称为抗体介导前药治疗（ADEPT）技术，即将能水解前药【前药( prodrug)是指由具有生物活性的药物经化学修饰后转变为体外无活性的化合物。】释放出肿瘤细胞毒剂的酶和肿瘤专一性抗体相偶联，这样酶就会通过

47、和肿瘤结合的抗体而存在于细胞的表面。抗体酶就会将前药迅速水解释放出抗肿瘤药物，从而提高肿瘤细胞局部药物浓度，增强对肿瘤的杀伤力，达到提高肿瘤化疗效果的目的。第八十二张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月印迹酶1分子印迹概念： 制备对某一化合物具有选择性的聚合物的过程。第八十三张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月印迹酶2分子印迹技术过程：（1）选定印迹分子和功能单体，使二者发生互补反应；（2）在印迹分子-单体复合物周围发生聚合反应；（3）用抽提法从聚合物中除掉印迹分子。3分子印迹酶：（1）通过分子印迹技术可以产生类似于酶的活性中心的空腔，对底物产生有效的结合作用，并可以在结合部位的

48、空腔内诱导产生催化基团，并与底物定向排列。（2）性质：遵循米氏方程，催化活力依赖反应速度常数。第八十四张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月印迹酶4. 表面分子印迹：（1）无机物为载体的表面印迹：（2）固体材料的表面修饰：（3）蛋白质的表面印迹：第八十五张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月第三节 生物酶工程一、酶基因的克隆和表达二、酶分子的改造三、融合酶第八十六张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月一、酶基因的克隆和表达第八十七张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月酶基因克隆的操作过程培养含有用酶的生物质粒等基因工程载体目的酶基因克隆载体重组载体宿主细胞转化子目的基因

49、克隆获取选择导入培养筛选、鉴定第八十八张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月“ 纵 向 ” 体 系“横向”体系电泳层析离心分光光度基因操作其它分（分离目的基因）切（切割目的基因和载体）接（连接目的基因和载体）转（转化宿主细胞）筛（筛选阳性克隆）表（表达目的基因）构建基因文库（DNA文库和cNDA文库）；PCR法；化学人工合成法；从mRNA中获得。利用限制性内切酶特异性切开载体和目的基因。利用DNA连接酶连接目的基因和载体。重组DNA导入原核和真核细胞不一样：制备感受态细胞、转化感受态细胞。1. 利用载体的选择标记来筛选，如蓝白斑；2. 利用PCR法来鉴定导入片段与目的基因片段长度的一致；

50、3. 利用核酸杂交法；4. 利用目的基因的表达蛋白与转化细胞的表达蛋白是否一致。（一）酶基因克隆的主要操作步骤第八十九张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月（二）酶基因常用的克隆方法1. 根据已知序列克隆基因：2. 根据已知探针克隆基因：3. 未知序列的基因打靶：（1）随机引物PCR；（2）差别显示PCR（DD-PCR）;（3）代表性差式分析PCR（RAD-PCR；一种差减杂交）。第九十张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月（三）酶的异源表达1. 酶基因在原核生物中的表达（1）原核生物基因表达系统的特点 只有一种RNA聚合酶； 表达是以操纵子为单位的； 转录与翻译偶联，是连续进行的； 一般不含内含子； 基因表达控制主要在转录水平； 大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上含有真核生物缺乏的转译起始密码子及SD序列。（2）原核生物基因表达载体：（3）影响原核生物基因表达系统表达效率的因素：很多；如启动子结构、转译起始序列、启动子同克隆基因间