龙眼LEAFY同源基因启动子的克隆与序列分析

1、龙眼LEAFY同源基因启动子的克隆与序列分析论文摘要：为了解龙眼LEAFY同源基因LLFY的表达调控规律，本研究应用染色体步移方法克隆了809bp 的LLFY启动子序列。用在线软件PlantCARE分析说明，该序列除含有启动子根本元件，如TATA-BOX、CAAT-BOX外，还含有参与生理周期调控、干旱诱导MYB结合位点、ABA响应元件、光响应元件等一些其他的调控序列，推测LLFY的表达受生理周期、干旱、光照等的调控。用 FootPrinter在线工具对龙眼等6个物种的 LEAFY同源基因启动子进行比拟, 发现不同植物的启动子具有保守性, 也存在差异, 说明LEAFY同源基因功能上的分化，LL

2、FY基因具有多种功能。论文关键词：龙眼,同源基因,启动子,序列分析LEAFYLFY基因是拟南芥中的花分生组织特性基因，在营养生长向生殖生殖转变过程起主要的调控作用，被认为结合了内外开花的诱导因素，是启动开花的枢纽。目前拟南芥中LFY的表达调控主要有长日照诱导、GA诱导、低温春化以及自动途径等四条途径，LFY的表达还受microRNA作用的调控因子SPL3的直接调控。木本植物的成花诱导与草本植物存在差异，对木本植物LFY同源基因表达调控的了解还十分有限。对不同物种LFY同源基因的研究说明，LFY同源基因作为花分生组织特性基因的功能是保守的，但在功能上出现分化。基因的启动子序列与基因的表达调控密切

3、相关，研究说明具有MADS结构域的调控因子SOC1直接与LFY的启动子结合调控LFY的表达，结合部位在LFY启动子的近端和远端两个位置，这两个位置含有CArG盒其中心序列为CCWGG。研究结果还显示同时与LFY启动子结合的还有调控因子AGL24，AGL24与SOC1结合在同一位置，SOC1的结合需要AGL24的配合。此外，LFY启动子的近端区域被认为含有应答GA的顺式作用元件。宗成文等别离了葡萄LFY基因的启动子片段，对序列进行分析并与拟南芥、烟草等LFY基因的启动子进行比拟，结果说明LFY同源基因启动子中转录元件是相对保守的，但也存在差异。龙眼(DimocarpuslonganL.)是重要的

4、亚热带果树，生产上存在大小年结果;和冲梢;等问题，都与花芽分化密切相关。研究说明，龙眼LFY同源基因LLFY的功能与龙眼花序的分化和维持有关，在冲梢;过程LLFY表达量下降，LLFY在叶芽中也有微弱表达。为进一步了解LLFY的功能和表达调控规律，本研究克隆LLFY上游的启动子序列并进行序列分析，为说明龙眼花芽分化的分子机制提供依据。1材料与方法1.1试验材料试材为红核子龙眼成年树幼嫩叶片，取材自福建农林大学校园。1.2龙眼叶片基因组DNA的提取龙眼叶片基因组DNA的提取参照曾黎辉等的方法。1.3染色体步移克隆LLFY5端启动子序列染色体步移使用TaKaRa公司的LAPCRinvitroClon

5、ingKit。首先，对已获得的LLFY基因组DNA序列进行分析，选用XbaI对龙眼基因组DNA进行酶切，然后与试剂盒提供的相匹配的接头连接；试剂盒提供相应的两条接头引物F1、F2，根据的LLFY序列设计两条3端引物R1和R2，R1：GGCAGCAGAGAGATGTAGGTTTGCTAT，R2：GCTGCTGTTTCTGTGTTCACGATACTG；以加接头的酶切产物为模板，进行两轮PCR扩增；第一轮PCR扩增条件为：94预变性3min，94变性30s，56退火2min，72延伸2min，35个循环，72延伸7min；第二轮PCR扩增条件为：94预变性3min，94变性30s，60退火2min，

6、72延伸2min，35个循环，72延伸7min；将获得的片段回收、纯化，与PMD18-TVector购自TaKaRa公司连接，转化，蓝白斑筛选后测序委托上海博亚英骏生物技术测序。1.4序列分析用DNAMAN软件拼接序列。应用在线软件PlantCARE对LLFY启动子序列进行转录元件分析，寻找转录因子结合位点(transcriptionfactor-bindingsites,TFBS)。在GenBank数据库中查找拟南芥、水稻、葡萄、山核桃、芒果等5个物种的LFY同源基因的启动子序列，应用在线FootPrinter3.0软件对这几个物种以及LLFY的启动子序列进行比拟。2结果与分析2.1LLFY

7、启动子的克隆采用染色体步移方法进行两轮PCR的扩增后，获得了一条约700bp特异性片段图1，测序结果说明该PCR产物大小为683bp，图2中下划线局部为启动子序列。将克隆到的序列与先前获得的LLFY局部5端非编码区序列进行拼接，得到LLFY起始密码子ATG上游的启动子序列共809bp，结果见图2。图1龙眼LLFY基因启动子第二轮PCR扩增产物M.DL2000marker;1.PCR扩增产物Fig.1SecondroundPCRproductofLLFYpromoterinlonganM.DL2000marker,1.PCRproduct2.2LLFY启动子序列的分析首先用PlantCARE软件

8、在线分析LLFY启动子区域的转录因子结合位点TFB及其功能，结果见表1。从表1可以看出，809bp的LLFY启动子片段中在-125等4个位置含有典型的TATA-box序列，在-98等6个位置含有CAAT-box序列，TATA-box和CAAT-box是启动子区域的根本顺式作用元件；在此序列中还发现在-595处有一个与生理周期调控有关的顺式作用元件，说明LLFY的表达与植株的生理周期有关；-182位置是厌氧诱导的顺式元件，序列中还有4个干旱诱导的MYB结合位点、1个光诱导MYB位点和ABA响应元件(ABRE)，这些调控序列的存在说明LLFY的表达可能受干旱、光照、氧气等环境因素以及激素ABA的调

9、控。此外，该序列中还发现一些光响应元件如GA-box、GAG-motif、I-box等。应用FootPrinter3.0软件对龙眼、拟南芥(NC_003076.8)、水稻AF397034.1、葡萄EF222286、芒果GU338039.1、山核桃DQ9892266个物种LFY同源基因启动子序列进行比拟，找出保守区域，绘出系统发生树。结果显示6个物种LFY启动子区域共有的保守基序有4个图3，保守区域数目不多，说明LFY同源基因间启动子序列差异较大。表1应用PlantCARE预测LLFY启动子顺式作用元件Table1Cis-actingregulatoryelementsanalysisofLLF

10、YpromotersequencebyPlantCARE 位点名称 Site Name 位置 Position 信号序列 Signal sequence 位点功能 Function of site CAAT-box -802、-527、-447、-98 CCAAT 启动子区域顺式作用元件 Common cis-acting element in promoter and enhancer regions -391、-190 gGCAAT TATA-box -689、-514、-211、-125 TATA 转录起始-30核心启动子元件 core promoter element around -

11、30 of transcription start circadian -595 CAANNNNATC 参与生理周期调控的顺式作用元件 cis-acting regulatory element involved in circadian control ARE -182 AAACCA 厌氧诱导必要的顺式作用元件 cis-acting regulatory element essential for the anaerobic induction MBS -579、-346 CAACTG 干旱诱导的MYB结合位点MYB binding site involved in drought-indu

12、cibility -169 CAGTTA -238 CAACTG MRE -246 TTAGGTT 光响应MYB结合位点 MYB binding site involved in light responsiveness ABRE -476 GCCACGCACT 脱落酸响应顺式作用元件cis-acting element involved in the abscisic acid responsiveness GATA-motif -442 CCCTATC 局部光响应元件 part of a light responsive element I -box -775 AAGATAAGGCT 局部

13、光响应元件 part of a light responsive element Sp1 -378 GGGAG 光响应元件 light responsive element MNF1 -376 AGGGCAC light responsive element 光响应元件 GAG-motif -112 CATCTCT 局部光响应元件 part of a light responsive element GA-motif -13 AAGGAAGA 局部光响应元件 part of a light responsive element Skn-1_motif -722 ATG AC 胚乳表达需要的顺式

14、作用元件 cis-acting regulatory element required for endosperm expression O2-site -776 GATGATATGG 玉米醇蛋白代谢途径顺式作用元件 cis-acting regulatory element involved in zein metabolism regulation -809 CATCATGCCAATGTAAATTAGCACTTGCAGATAGATGATAAGGCTAAAGCTGTAAACTTA CAAT-box I -box -749 TGTGTAAAGCGATTTCCATTTTTAGGAATGACTTG

15、GCACTTGCAGACAGCCATAATTTTT Skn-1_motif -689 TATAAAACCTTGATATCAAAAATAAAAGGAAAAGTTTCATCCTTAGGGACAGAGGATGCA TATA-box -629 TTTAGCAAAGAAACTGCCCTAATAGCATCCACTTCAACGAAATCCACCTTCAACTGTAAG circadian MBS -569 GAATAGGCAAGCAACAAACCTTCTCTTAGAGCGACCGATTCACCAATTTTTGGGCTATAG CAAT-box TATA-box -509 TTACCTTTCCAAGGATTC

16、GTTGTAGCAACTATGGCCACGCACTGATGATTATGGAAGCAA ABRE -449 CACCAATCCCTATCATGAGAGAGCTAGAGCAAATGGCTACATCTGAGTTTGAGTTTTAGG CAAT-box GATA-motif -389 CAATCATAAAGGGGAGGGCACCAACTAGGAACAGACGAAGCAGCAACTGATTTAGGCAAA CAAT-box Sp1 MNF1 MBS -329 ATAAACATGGCTACTTTAGCGTTTTGGAATTCTCGTTAGGAGAATGTAAGGTAAGTCACC -269 AAGGCGA

17、GACTCAGTTTGAGTGGTTAGGTTCCAACTGTCAAGTTCCAAACTAACAGAATA MRE MBS -209 TATGAACCACATTTTCCTTGGCAATAAAAACCATAAAAATCAGTTATTTGAGGGCAGTAT TATA-box CAAT-box ARE MBS -149 CGTGAACACAGAAACAGCAGCCTTTATAGCAAACCTACATCTCTCTGCTGCCCAATTCCA TATA-box GAG-motif CAAT-box -89 GAACATAAAAGATATTCACTGCTCACGAGTGCTAAGAGGGCAAAAACA

18、AAACAAAAAATA -29 AAAAATAAAGACGAAAAAGGAAGACAGACATG GA-motif 图2龙眼LLFY基因启动子局部序列启动子根本元件用方框表示；其它调控元件用阴影表示；起始密码子用粗体表示；引物用下划线表示Fig.2PartialsequencesofLLFYpromoter3讨论启动子序列分析说明LLFY启动子区域含有丰富的可能是顺式作用元件的序列，LLFY表达调控受内在因素和多种外界条件的影响。如LLFY表达受生理周期的影响，可能是导致花芽分化具有周期性原因；启动子序列中含有多个光响应作用元件，说明LLFY的表达受光调控；生产中KCIO能够诱导龙眼成花，可

19、能与LLFY启动子含有干旱诱导顺式作用元件有关，是由于施用KCIO产生了干旱胁迫。LLFY表达调控的复杂性也说明了LLFY可能具有多种功能。如LLFY启动子中还发现有厌氧诱导等顺式作用元、胚乳表达需要的顺式作用元件以及玉米醇蛋白代谢途径顺式作用元件等，这些元件是否与LLFY的其它功能有关有待进一步研究。龙眼LLFY启动子序列的克隆也为进一步采用酵母单杂交等方法获得与LLFY互作的调控蛋白创造条件。对一些物种的研究说明在进化过程中，LFY同源基因的功能出现分化，不仅控制着花的发育，在被子植物的发育过程中还起着其它的调控功能。例如，单子叶植物水稻中LFY的同源基因RFL表达明显区别于双子叶植物，R

20、FL基因在幼穗中表达,而在成熟的小花和叶子中没有表达。葡萄VFL在即将发育成花序的分生组织中、花序芽中都有表达，在花芽中的表达到达最高，在叶芽、叶片和卷须原基中也有微量表达，作者认为VFL除了在开花过程的重要功能外，还参与未分化的分生组织的维持。而龙眼LLFY参与花序的分化和维持，在冲梢;过程LLFY表达量下降。葡萄等LFY同源基因启动子序列中都有MYB、ABRE和光响应等元件，龙眼中也发现了这些元件，但LLFY启动子中没有发现拟南芥中的CArG盒和GA的顺式作用元件，也没有找到葡萄中的茉莉酮酸酯诱导顺式作用元件、细胞分裂素调节基因ARR1结合位点等序列。将水稻、拟南芥与包括龙眼在内的4种果树

21、LFY同源基因启动子进行保守序列分析，结果说明它们共同的保守序列只有4个，这为解释不同物种LFY同源基因存在表达和功能差异提供了证据。如果仅将4种果树的LFY同源基因启动子序列进行比拟，保守序列到达24个数据未列出，说明木本植物LFY同源基因启动子序列相似性更高。以上试验的分析结果也说明了龙眼LLFY基因作为花分生组织特性基因的保守性，但功能及表达调控上与其它物种存在差异。 葡萄 芒果 山核桃 拟南芥 龙眼 水稻 图3FootPrinter软件对6个LFY同源基因启动子的分析结果Fig.3AnalysisofsixLFYhomologgenespromotersbyFootPrinter设定元

22、件长度为8，最多两个突变位点，子区域设定为100bp，不同颜色显示不同的转录元件。参考文献1 WEIGEL D, ALVAREZ J, SMITH D R, YANOFSKY M F, MEYEROWITZ E M. LEAFY controls Floral meristem identity in Arabidopsis.Cell,1992,69:843-859.2 BLZQUEZ M A, WEIGEL D.Integration of floral inductive signals in Arabidopsis.Nature,2000,404:889-892.3 SABLOWSKI

23、R.Flowering and determinacy in Arabidopsis. Journal of Experimental Botany Advance,2007,10:1-9.4 YAMAGUCHI A,WU M F,YANG L,WU G,PORTHIG R S,WAGNER D. The microRNA regulated SBP-box transcription factor SPL3 is a direct upstream activator of LEAFY, FRUITFULL, and APETALA1. Dev Cell. 2021 ,17(2): 2682

24、78.5 MAIZEL A, BUSCH M A, TANAHASHI T, PERKOVIC J, KATO M, HASEBE M, WEIGEL D. The floral regulator LEAFY evolves by substitutions in the DNA binding domain.Science,2005,308:260-263.6 LEE J, OH M, PARK H, LEE I. SOC1 translocated to the nucleus by interaction with AGL24 directly regulates LEAFY.The

25、Plant Journal,2021,55:832843.7 LEE J, LEE I. Regulation and function of SOC1, a flowering pathway integrator. J Exp Bot,2021,61(9):2247-54.8 BLZQUEZ M A, GREEN R, NILSSON O,SUSSMAN M R, WEIGEL D. Gibberellins p romote flowering of arabidopsis by activating the LEAFY promoter.Plant Cell,1998,10(5):791-800.9 ZONG Cheng-wen, ZHANG Zhen, FANG Jing-gui,TAO Jian-min, ZHAO Mi-zhen. Cloning and sequence analysis of LEAFY gene pr omoter f