生物固氮作用的分子机理研究

1、.：.；工程称号：生物固氮作用的分子机理研讨首席科学家：王忆平 北京大学起止年限：2021年1月-2021年8月依托部门：教育部一、研讨内容生物固氮研讨的关键科学问题是获得最正确生物固氮体系包括共生固氮、结合内生固氮等和建立非豆科植物的自主固氮体系，详细包括：1阐明根瘤菌共生固氮基因表达调控的网络，根瘤菌识别、传送环境和植物信号，调理本身基因表达的分子机理；2提示固氮及氮代谢基因调控机理，与碳代谢系统及其基因的调控偶联机制；3阐明共生固氮体系中植物与微生物相互作用的机理，如植物与微生物相互识别及分子信号的传导机制，抑制宿主特异性，从而扩展根瘤菌的宿主范围；4利用单细胞真核生物-酵母菌的线粒体遗

2、传操作系统，探求固氮基因簇向真核生物转化和表达的机制，为固氮基因向高等植物转移，建立非豆科植物自主固氮体系的奠定根底。5阐明固氮酶构造、功能和催化机理。围绕上述提高生物固氮效率、扩展共生固氮植物范围、建立自主固氮体系的关键问题，主要研讨内容有：1以方式豆科植物共生固氮体系为资料，分别和鉴定参与根瘤菌结瘤因子信号传送的调控元件及基因，研讨和建立根瘤菌与宿主植物共生关系蛋白相互作用网络；经过对豆科植物与根瘤菌、AM真菌共生的异同以及与非豆科植物比较基因组学研讨，提示非豆科植物中存在哪些与共生相关基因的功能及调控机制，为探求扩展根瘤菌寄主范围和建立非豆科共生固氮途径能够性提供科学资料；分别和鉴定Ly

3、sR、GntR等家簇转录因子及其靶基因，阐明根瘤菌主代谢与共生固氮功能的相关性和调控机理；开展根瘤菌群体感应系统、型分泌系统及胞外多糖合成基因表达调理的双组分调控系统的研讨，阐明这些代谢系统在不同环境条件下的功能和作用机制，提示根瘤菌环境顺应性与竞争结瘤之间的相关性。2碳代谢与氮代谢是自然界生命活动的两大主要代谢作用。固氮基因调控机理，以及碳代谢和氮代谢之间的调控偶联途径曾经得到了解析，但碳代谢对固氮基因的表达的抑制机理与途径有较大不同。因此，进一步解析碳代谢调控系统对固氮基因的调控偶联机理将为提高生物固氮效率打下实际根底；建立酵母菌单细胞真核生物及其线粒体遗传操作系统，探求固氮基因簇向真核生

4、物转化的能够和表达机制。包括：酵母菌线粒体遗传操作系统的构建；线粒体钼的运输、RNA聚合酶对固氮基因表达的影响RNA聚合酶、因子、DNA折叠蛋白等；线粒体呼吸耗氧与固氮酶厌氧的关系和影响；线粒体与细胞质之间的氨基酸穿越往返机制对生物固氮效果的影响等。以上研讨是固氮基因向真核生物转移的新的尝试，为非豆科植物包括粮食作物建立自主的生物固氮体系探求新路。3 结合固氮作用有三个重要的限制因子，即氧、铵和能量。其中，能量和铵又是导致目前田间结合固氮效率低下的最主要限制因子。我们拟利用功能基因组操作平台，对斯氏假单胞菌和巴西固氮螺菌等结合固氮菌和上述主要限制因子，在结合固氮微生物功能基因组、结合固氮基因表

5、达调理以及固氮酶催化机制等开展任务。分析鉴定能够参与细菌氮信号传导、调控或坚持最正确固氮程度的新基因和新机制，系统研讨结合固氮体系构成的分子机理和结合固氮微生物对土壤环境变化的顺应才干, 讨论提高作物与固氮微生物之间的结合固氮效率的战略。4在固氮酶复原氮气和质子的分子机制方面，利用生物信息学和构造化学实际，分析研讨野生型及各突变株固氮酶复原N2和H+的动力学、EPR、CD波谱等特征。明确N2的络合和复原位置及其电子质子传送通道。二、预期目的总体目的：本工程的总体目的是借助分子生物学和现代生物技术，开展生物固氮作用的分子机理研讨，在分子程度上解析低等固氮微生物与高等植物宿主之间遗传信息的交流；共

6、生固氮体系的建立；固氮过程中能量及营养物质的交换；固氮功能的发扬等关键科学问题。为扩展根瘤菌宿主植物范围、提高生物固氮效率，探求非豆科植物共生体系及自主固氮的能够性提供科学根据，为生物固氮在农业消费中的运用提供实际根底和技术支撑，缓解和减轻农业消费中长期和大量依赖工业氮肥施用所呵斥的能源和环境问题，为保证我国粮食消费平安，农业可继续开展提供新的途径。五年目的：1建立根瘤菌与宿主植物共生关系中蛋白相互作用网络，分别和鉴定参与根瘤构成和发育功能基因及其调控蛋白，阐明根瘤菌共生信号在豆科植物中接受、传送及其调控的机制；建立豆科植物突变体库，分别和鉴定与共生固氮相关的突变株；比较豆科植物与根瘤菌或AM

7、真菌共生基因的异同，并比较非豆科植物基因组，阐明非豆科植物中存在哪些与共生固氮相关的基因及其功能、表达与调控机制。2经过基因芯片等转录组学方法，分别和鉴定LysR和GntR家族转录因子调理的下游靶基因，阐明其调理共生固氮作用的分子机理；经过定向缺失突变，分别和鉴定参与根瘤菌细胞周期调控以及共生固氮作用的激酶和反响蛋白基因，并确定其相互作用网络；分别和鉴定参与共生固氮作用的功能基因和调理蛋白，阐明根瘤菌共生固氮基因表达调控的网络，根瘤菌识别、传送环境和植物信号，调理本身基因表达的分子机理。3在构造层面和基因组程度提示固氮及氮代谢基因调控机理，与碳代谢系统及其基因的调控偶联机制，为提高固氮效率奠定

8、实际根底；在构造层面上解析根瘤菌共生固氮的独一碳源能量供应系统Dct的信号转导原理及其调控机制，为提高共生固氮效率奠定实际根底；构建单细胞真核生物-酵母菌的线粒体遗传操作系统，探求固氮基因簇向真核生物转化和表达的机制，为固氮基因向高等植物转移，建立非豆科植物包括粮食作物自主固氮体系的奠定根底。开展结合固氮微生物比较基因组、生物固氮体系的进化、不同条件下结合固氮微生物基因表达谱的研讨，提示生物固氮进化途径的构成和机制，分析鉴定能够参与细菌氮信号转导或坚持最正确固氮程度的新基因；系统研讨结合固氮体系构成的分子机理，建立稳定的结合固氮体系，为提高作物与固氮微生物之间的固氮效率提出新战略；分析P-cl

9、uster和FeMoco之间螺旋上单个氨基酸交换后固氮酶构造的变化和能够对电子质子传送的影响，对固氮酶MoFe蛋白亚单位中FeMo辅因子周围多肽环境中保守氨基酸定位诱变并构建不同的突变株，明确FeMoco的Fe2和Fe6能否是氮的络合和复原位置，及用于氮和质子复原的电子质子传送通道。分别和鉴定100个左右在共生固氮系统中参与根瘤构成和发育、共生固氮作用的功能基因和调理蛋白、根瘤菌细胞周期调控、LysR和GntR家族调控子regulon的新基因；分别和鉴定30-50个与共生固氮相关的突变体；20个结合固氮系统中参与细菌氮信号转导或坚持最正确固氮程度的新基因；在影响因子2以上的国际刊物上发表论文8

10、0篇或到达相应的影响因子总数的文章数目。恳求国内外发明专利10个以上。在生物固氮研讨领域培育一支高程度的研讨队伍，培育博士研讨生60名以上。三、研讨方案1学术思绪： 我们的学术思绪和技术途经是围绕着生物固氮菌氮碳代谢基因表达调控偶联机理、豆科植物与根瘤菌相互作用机理、根瘤菌固氮系统调控机理和固氮菌固氮基因网络调控与固氮酶催化机制等中心课题，根据多学科生物学、化学、物理学交叉的研讨优势，获得创新成果，促进生命科学领域的开展。同时提高生物固氮的效率，促进农业可继续开展。总体研讨方案以以下图简示：2技术途径： 总体研讨方案以以下图简示： 生物固氮作用的分子机理研讨豆科植物共生信号 根瘤菌固氮系统 固

11、氮菌氮碳代谢 结合固氮菌固氮基因传送及作用机制 调控机理 基因调控偶联 网络调控与酶催化机理扩展根瘤菌 固氮基因向真核 高效稳定的固氮体系的宿主范围 生物的转移非豆科植物的生物固氮生物固氮创新研讨和农业继续开展3) 创新点与特征： 本建议工程是继2002-2006年“高效生物固氮作用机理及其在农业中的运用973工程之后，又一次跨学科、跨系统的全国性大型协作。我们争取在以下问题上获得创新成果：1本工程四个课题的研讨内容都集中在两条主线上，一个研讨如何提高生物固氮效率；一个是研讨建立共生或自主固氮体系的根本条件。这两条主线都为最终提高农作物产量效力。2从豆科植物固氮根瘤构成调控系统和根瘤菌固氮调控

12、系统两个方面出发，结合根瘤菌及其宿主植物基因组学、功能基因组学和蛋白组学技术平台，现代分子生物学、遗传学实际和技术，对共生固氮体系植物和根瘤菌各自基因的表达和两者之间分子相互作用机制研讨，具有创新性和特征。3碳代谢与氮代谢是自然界生命活动的两大主要代谢作用。本建议工程从提示存在于微生物体内的固氮及氮代谢与碳代谢之间的基因调控偶联及其调控机理出发，进而研讨固氮过程中能量的供应，对提供碳源，提高固氮作用有重要意义。这也是本建议工程的特征和创新点之一； 4建立酵母菌单细胞真核生物及其线粒体遗传操作系统，探求固氮基因簇向真核生物转化的能够和表达机制，是固氮基因向真核生物转移的新的尝试，为非豆科植物包括

13、粮食作物建立自主的生物固氮体系探求新路。5经过对野生和突变固氮酶的构造与功能进展比较，确定N2和H+在活性中心原子簇上的络合与复原位点及其催化机理，为实现温暖条件合成氨的想象发明条件。在学科开展方向上具有创新性和特征。4可行性分析： 我们以为上述预期成果是可以到达的，理由是：本建议是在“八五、“九五、“十五的“863方案工程“根瘤菌和寄主相互关系的分子遗传学研讨、“重组大豆根瘤菌的研制、“水稻结合固氮菌研讨、“玉米结合固氮研讨、 “高效固氮大豆、花生根瘤菌的研制、“高效固氮大豆、花生根瘤菌的中试研讨、“重组大豆根瘤菌的研制、“重组固氮菌田间把关鉴定、“高效固氮工程菌的构建及其运用、“新型高效固

14、氮菌剂的研制；国家自然科学基金重点工程“我国豆科植物根瘤菌资源调查和分类的研讨、国家973工程“高效生物固氮作用机理及其在农业中的运用根底上提出的。本研讨方案将我国的生物固氮资源与生物固氮根底研讨和运用根底研讨有机地结合起来，使近期和中长期目的更加明确、技术道路更加明晰，具有可行性和创新性。本建议工程将由在固氮微生物及其宿主植物的基因调控及其分子生物学、固氮微生物分子生态学及其分类、微生物与植物相互作用及其分子生物学、固氮酶生物化学及其化学模拟等研讨方面的国内优势单位组成，具有很好的研讨根底和成熟的组织管理阅历。建议参与单位的实验设备和配备良好，其中有国家重点实验室5个和部门重点实验室3个。建

15、议参与本工程研讨义务的主要单位有北京大学、中国农业大学、华中农业大学、南京农业大学、中山大学、中科院上海植物生理生态研讨所、中科院植物研讨所、中国农业科学院生物技术研讨所等国内优势单位共37人，其中包括新近引进的出色人才10余人。 多年来，我国生物固氮研讨与英国、法国、德国、荷兰、比利时、美国、澳大利亚等国家有良好的协作根底，其中包括政府间科技协作议定书的重点工程，如“中法先进研讨方案、“中德科技协作工程、“欧盟协作方案工程、美国洛氏基金“水稻结瘤固氮国际协作工程、国际人类前沿科学基金HFSPO：“细菌中氮同化作用的调控网络研讨等。初次在亚洲召开的国际固氮大会第十四届于2004年在北京由本工程

16、首席科学家王忆平教授主持大会并获得圆满胜利，会议进一步展现了我国生物固氮研讨的成果，并促进了我国科学家与国际同行的协作与交流。各课题间相互关系1 豆科植物固氮根瘤构成的分子机理本课题以方式豆科植物共生固氮体系为资料，研讨蛋白质与蛋白质、蛋白质与核酸、蛋白质与多糖的相互作用，建立根瘤菌与宿主植物共生关系建立早期蛋白相互作用网络。分别和鉴定参与根瘤菌结瘤因子信号传送的调控元件及基因，研讨植物呼应根瘤菌结瘤因子的作用方式、传送途径及其信号蛋白的调控机制。研讨豆科植物的长/短间隔 信号转导途径之间的关系，阐明根瘤形状发生以及根瘤属性的分子机制，为提高共生固氮效率和作物产量、以及在非豆科植物建立共生或自

17、主固氮体系奠定细胞生物学和形状发育的分子根底。经过对豆科植物与根瘤菌、AM真菌共生的异同以及与非豆科植物比较基因组学研讨，提示非豆科植物中存在哪些与共生相关的基因及其调控机制，为探求扩展根瘤菌宿主范围和建立非豆科共生固氮途径能够性提供科学根据。主要研讨内容：1研讨呼应根瘤菌信号分子的宿主植物苜蓿基因，及其在根瘤发育中的信号传导。研讨百脉根突变体rel1和rel3中，小RNA在生长素信号传导途径中对于根瘤发育的调控作用。经过对根瘤菌与多种豆科宿主植物苜蓿和百脉根等互作过程的研讨，提示结瘤因子在宿主植物中的信号传导途径和植物水解酶诱导的结瘤因子失活机理。2利用酵母双杂交技术鉴定出与根瘤菌型效应因子

18、互作，并决议宿主特异性结瘤的豆科植物基因即靶蛋白。经过构建不同转录程度的转基因植物来研讨所克隆基因在共生中的作用。另外，将构建可表达型效应子的转基因豆科植物，以此来研讨根瘤菌型效应子在植物细胞中的功能如：引起超敏反响；抑制植物防御反响等。此外，运用Cre重组酶Lox-P技术，验证型效应子-Cre交融蛋白能否从根瘤菌转移到豆科植物。构建表达启动子-loxP-报告基因编码葡糖苷酸酶或绿色荧光蛋白的转基因日本百脉根，接种携带型效应子-Cre交融蛋白的根瘤菌后，可在显微镜下检测报告基因的表达活性。3经过抑制性减法杂交技术，DNA微阵列技术和蛋白质组技术确定被根瘤菌胞外寡聚糖所诱导的豆科植物基因。经过R

19、NA干扰技术将找到的基因进展沉默，从而研讨其在共生过程中的功能。经过基因突变方案获得基因功能的方法鉴定百脉根中不需求胞外寡聚糖也可以建立根瘤菌NGR234与豆科植物的固氮结瘤的突变体。4在宿主植物与根瘤菌相互作用机理方面：根瘤菌与宿主植物共生关系早期蛋白相互作用网络，根瘤菌结瘤因子的作用方式、传送途径中的基因如：COCH、BIO1/ELE1和ELE2基因及其同源基因等及其调控机制。豆科植物与根瘤菌、AM真菌共生的异同比较，以及与非豆科植物比较基因组学，讨论在豆科根系和其他高等植物根系发育中的功能差别；在水稻中异源表达豆科植物结瘤因子信号转导途径中的基因如LysM受体激酶等；用结瘤因子处置转基因

20、水稻以观测相关的菌根信号转导途径中的基因能否表达；研讨植物与微生物共生所产生的其他特殊根形状发育如菌根与豆科根瘤形状发育分子调控机理的异同，提示非豆科植物中与共生相关的基因及调控机制。5在豆科植物固氮根瘤形状发育与其他不同器官的关系方面：整合百脉根、蒺藜苜蓿的基因组信息和豌豆EST信息，设计芯片，分析野生型和突变体的表达谱，以及运用酵母双杂交等技术，寻觅与COCH、BIO1/ELE1和ELE2基因相互作用的基因/蛋白，确定COCH、BIO1/ELE1和ELE2基因所参与的信号转导途径的遗传调控网络。讨论根瘤及侧根发育的分子途径异同；COCH对根瘤属性有限和无限型决议的分子机理。BIO1/ELE

21、1和ELE2基因所涉及的影响豆科作物整株形状发育的信号转导途径，及其在根瘤形状发生的分子决议机制。预期研讨目的：1) 建立根瘤菌与宿主植物共生关系早期蛋白相互作用网络，分别和鉴定参与根瘤构成和发育功能基因及其调控蛋白20-30个；确定结瘤因子信号通路调控的结瘤因子失活的分子机理反响调理通路，找到抑制结瘤因子活性的结瘤因子水解酶基因，研讨这些与结瘤因子相关的基因在共生结瘤过程中的作用；确定豆科植物中与根瘤菌型效应因子互作的基因，并阐明型效应因子被释放进入了豆科宿主的细胞，及在特异性宿主结瘤过程中蛋白与蛋白互作的功能，了解型效应因子在宿主和非宿主豆科植物细胞中的分子机制。确定在豆科植物中对根瘤菌的

22、胞外寡糖的识别和共生作用相关的基因；了解胞外寡糖在宿主和非宿主豆科植物上的作用和分子机制。进一步阐明根瘤菌共生信号在豆科植物中接受、传送及其调控机制。为扩展根瘤菌宿主植物范围，探求创建非豆科植物共生固氮体系的能够性提供科学根据。2建立豆科植物与根瘤菌共生固氮突变体库，分别和鉴定30-50个与共生固氮相关的突变体，阐明根瘤形状发生以及根瘤属性的分子机制，根瘤构成与JA等植物激素信号转导途径的相关性。3经过对豆科植物与根瘤菌、AM真菌共生的异同以及与非豆科植物比较基因组学研讨；经过构建对结瘤因子呼应的转基因水稻，即拥有功能性的结瘤因子信号转导途径的水稻，阐明非豆科植物中存在哪些与共生固氮相关基因的

23、功能及调控机制。课题承当单位：中山大学、中科院上海植物生理生态研讨所课题担任人：Staehelin C.46博士教授中山大学主要学术骨干：程 奇43博士教授中山大学谢致平44 博士副教授中山大学罗 达 52博士教授中科院上海植物生理生态所王彦章30博士副研讨员中科院上海植物生理生态所罗 利30博士副研讨员中科院上海植物生理生态所陈爱民40硕士副研讨员中科院上海植物生理生态所经费比例： 21.67%2 根瘤菌固氮系统调控的分子机理借助分子生物学和现代生物技术，开展生物固氮作用的分子机理研讨，在分子程度上处理低等微生物与高等植物遗传信息的交流、共生固氮体系的建立、固氮过程中能量物质的交换、及固氮功

24、能的发扬等科学问题。为扩展根瘤菌宿主植物范围、提高生物固氮效率，探求建立非豆科植物共生体系及自主固氮提供科学根据，为其运用提供实际根底和技术支撑，以缓解农业消费中长期和大量施用工业氮肥而导致的能源、环境问题，为农业可继续开展提供新的途径。主要研讨内容：1苜蓿中华根瘤菌Sinorhizobium melilotiLysR和GntR转录因子家族中共生固氮必需基因的作用及其调理机理。双组份系统组氨酸激酶和反响蛋白调理根瘤菌细胞周期相关基因表达的分子机理。2根瘤菌群体感应系统、型分泌系统的底物蛋白及胞外多糖合成基因表达调控系统，这些系统在根瘤菌共生固氮过程中作用及其分子机理。3类菌体及其与宿主方控制类

25、菌体分化、固氮、衰老的功能基因组，dmtH，opa22, lpsH对华癸中生根瘤菌类菌体分化和根瘤发育的调控作用。4根瘤菌生物多样性及其环境与固氮作用的关系、新功能基因的开掘。预期研讨目的：1) 建立类菌体分化与固氮根瘤发育过程中根瘤菌与宿主植物间蛋白相互作用网络，分别和鉴定根瘤菌-宿主共生体系双方控制类菌体分化、共生固氮和根瘤衰老的功能基因、调控蛋白及信号分子20-30个，阐明各功能基因的构造与功能及其调控机制。为提示根瘤菌与宿主植物在共生中、晚期相互作用的分子机制提供科学资料。2) 建立根瘤菌“组学研讨平台，在自生和共生条件下开展根瘤菌共生固氮基因组、转录组、蛋白组和代谢组学的研讨，分别和

26、鉴定LysR、GntR等家簇转录因子及靶基因30-50个，阐明根瘤菌代谢与共生固氮功能的相关性和调控机理，为改造和提高共生固氮效率奠定实际根底。3) 分别根瘤菌群体感应系统、型分泌效应子及胞外多糖等与共生相关基因20-30个，阐明这些基因在不同环境条件下的功能和作用机制，提示根瘤菌环境顺应性与竞争结瘤之间的相关性，为生物固氮在农业消费中的运用提供实际根底和技术支撑。课题承当单位：华中农业大学、南京农业大学课题担任人：张忠明54硕士教授华中农业大学主要学术骨干： 李友国42博士教授华中农业大学朱 辉32博士讲师华中农业大学李一星30博士讲师华中农业大学朱 军40博士教授 南京农业大学钟增涛35博

27、士副教授南京农业大学郑会明27硕士讲师南京农业大学王 卉29博士讲师南京农业大学经费比例：21.67%3 固氮菌氮、碳代谢基因表达的调控偶联及固氮基因向真核生物的转移长期以来，微生物体内碳代谢与固氮及氮代谢之间的调控偶联不断不清。然而，生物固氮是一个高耗能的过程，可供固氮微生物运用的植物光协作用产物碳水化合物的质和量是限制其固氮效率的主要瓶颈。如何提供更多能源是提高共生固氮效率的关键。实为提高共生固氮效率的必由之路。目前曾经有能够进展这方面的研讨，但当前国际上尚未见有开展这方面的研讨报道。主要研讨内容：1在构造层面和基因组程度，研讨固氮及氮代谢基因调控机理，研讨与碳代谢系统及其基因的调控偶联机

28、制。在固氮及氮代谢基因调控机理方面，拟从54-RNA聚合酶、AAA+家族激活蛋白、DNA弯曲蛋白及其靶位点这些主要元件出发，研讨54-RNA聚合酶激活复合体的组装机制，及其在构造特征与功能实现之间的相互关系；在与碳代谢系统及其基因的调控偶联机制方面，前期任务解析了碳代谢与氮代谢之间的调控偶联关系，因此本课题的研讨内容是碳代谢与固氮之间的调控偶联关系及其调控机制。2结合生物物理、生物化学和生理学手段，从蛋白构造入手，对DCT系统上游的信号接纳、转导，直至下游的转录调控机制做深化的研讨。研讨DCT系统能够存在的一个“双通路感应机制，即DctB对四碳二羧酸的感应能够是直接与间接两种机制并存的。而且，

29、DctA与DctB的相互作用很能够更深层次地参与了DCT系统的调控。3固氮基因向单细胞真核生物酵母菌、衣藻转移和表达研讨：酵母线粒体遗传操作系统的构建；钼运输molybdenum transport系统的构建；研讨RNA聚合酶对固氮基因表达的影响RNA聚合酶类型、因子种类、DNA折叠蛋白种类等；线粒体呼吸耗氧与固氮酶厌氧的关系；探求线粒体及叶绿体与细胞质之间的氨基酸穿越往返机制对生物固氮效果的影响。4蓝藻固氮细胞分化及其调控机制及光合与固氮的偶联机制研讨。5根瘤菌促进水稻生长及两者相互作用机理研讨：根瘤菌接种水稻后成为内生菌分布在植物全身，并能提高光协作用，促进生长。蛋白质组学研讨阐明有光协作

30、用和能量等相关的一些蛋白如Rubisco活化酶和PSII光合放氧蛋白表达显著上调。基于这个根底，需深化研讨根瘤菌因子与水稻相关基因的相互作用及其机理，为根瘤菌在非豆科植物上的广泛运用奠定实际根据。主要研讨目的：1在构造层面上，在基因组程度提示固氮及氮代谢基因调控机理，提示与碳代谢系统及其基因的调控偶联机制，不仅对生物固氮调控有重要意义，也将对基因表达调控的根底研讨有重要奉献为提高固氮效率奠定实际根底。2在构造层面上解析根瘤菌共生固氮的独一碳源能量供应系统Dct系统的信号转导原理及其调控机制，为提高共生固氮效率奠定实际根底。3经过建立和操作单细胞真核生物酵母菌线粒体、衣藻叶绿体遗传操作系统，探求

31、固氮基因簇向真核生物转化和表达的机制，进展固氮基因向真核生物横向转移的有益尝试，为建立非豆科植物包括粮食作物自主固氮体系进展探求。4在分子程度解析蓝藻固氮细胞分化及其调控机制；根瘤菌作为内生菌对水稻具有促生作用的原理。课题承当单位：北京大学、中国科学院植物研讨所课题担任人：王忆平49博士教授北京大学主要学术骨干：赵进东53博士院士北京大学苏晓东45博士教授北京大学张晓东42博士教授北京大学梁宇和38博士副教授北京大学田哲贤 38博士讲师北京大学文 津42硕士讲师北京大学沈世华46博士研讨员中国科学院植物研讨所陈 晖48博士研讨员中国科学院植物研讨所唐明娟37博士助研讨员中国科学院植物研讨所杨明

32、峰 38博士助研讨员中国科学院植物研讨所经费比例：28.33%4 结合固氮菌固氮基因网络调控与酶催化分子机理结合固氮作用有三个重要的限制因子，即氧(失活)、铵(抑制)和能量(限制)。其中，能量限制和铵抑制又是导致目前田间结合固氮效率低下的最主要限制因子。我们拟利用功能基因组、基因芯片、蛋白质相互作用组等技术平台，针对斯氏假单胞菌A1501和巴西固氮螺菌等方式结合固氮菌和上述主要限制因子，在结合固氮微生物功能基因组、结合固氮基因表达调理以及固氮酶催化机制等开展研讨任务。主要研讨内容：1开展结合固氮微生物比较基因组合生物固氮体系进化研讨，对生物固氮体系的不同进化类型进展构造和功能的系统分析，提示生

33、物固氮进化途径、动力和机制。在建立全基因组和芯片平台的根底上，比较在不同条件下结合固氮微生物基因表达谱及其差别，研讨结合固氮基因网络调控机制。分析鉴定能够参与细菌氮信号传导、调控或坚持最正确固氮程度的新基因和新机制。2充分利用我国结合固氮微生物资源优势，研讨环境胁迫因子如氧敏感、氨阻遏、温度效应等对结合固氮微生物根际竞争和固氮效率的影响，系统研讨了结合固氮体系构成的分子机理，研讨结合固氮微生物对土壤环境变化的顺应才干,讨论提高作物与固氮微生物之间的结合固氮效率的战略，利用基因工程技术改造固氮微生物，为讨论稳定结合固氮体系建立的分子机制提供了重要的实际根据。3在固氮酶复原氮气和质子的分子机制方面

34、，利用生物信息学和构造化学实际，分析预测P-cluster和FeMoco之间的螺旋上单个氨基酸交换后固氮酶构造的变化和能够对电子质子传送的影响。采用分子生物学技术对固氮酶MoFe蛋白亚单位中FeMo辅因子FeMoco周围多肽环境中保守氨基酸及与FeMoco Mo端相连的高柠檬酸的定位诱变，构建不同的突变株，研讨这些突变株催化N2、H+ 和C2H2复原的性质。分别研讨野生型及各突变株固氮酶复原N2和H+的动力学、EPR、CD波谱、核磁、振动光谱、穆斯堡尔光谱、时间分析光谱等特征，研讨固氮酶催化活性中心结合、催化底物分子的作用机理，探明底物在活性中心上存在迁移的能够性，明确N2的络合和复原能否在F

35、eMo-co 中心硫原子S2B的Fe2和Fe6上，以及N2和H+复原的两条电子质子传送通道。主要研讨目的：开展结合固氮微生物比较基因组和生物固氮体系进化研讨以及在不同条件下结合固氮微生物基因表达谱研讨，提示生物固氮进化途径、动力和机制，分析鉴定能够参与细菌氮信号转导、调控或坚持最正确固氮程度的新基因15-20个。系统研讨结合固氮体系构成的分子机理，讨论提高作物与固氮微生物之间的结合固氮效率的新战略3-5种，为讨论稳定结合固氮体系建立的分子机制提供了重要的实际根据。分析预测P-cluster和FeMoco之间螺旋上单个氨基酸交换后固氮酶构造的变化和能够对电子质子传送的影响，对固氮酶MoFe蛋白亚单位中FeMo辅因子周围多肽环境中保守氨基酸定位诱变并构建不同的突变株5-10株，明确N2的络合和复原在接近FeMoco 中心硫原子的Fe2和Fe6上发生，以及用于 N2和H+复原的两条电子质子传送通道。课题承当单位：中国农科院生物技术研讨所、中国农业大学课题担任人：燕永亮32博士副研讨员中国农科院生物技术研讨所主要学术骨干：平淑珍49硕士副研讨员中国农科院生物技术研讨所陈 明46硕士副研讨员中国农科院生物技术研讨所林 敏46博士研讨员中国农科院生物技术研讨所徐荣旗44博士博士后中国农科院生物技术研讨所陈三