医学专题狂犬病及疫苗

1、狂犬病及疫苗2021/7/19 星期一1狂犬病狂犬病又称恐水症（hydrophobia）：是狂犬病病毒引起的一种人畜共患的中枢神经系统急性传染病。多见于狗、狼、猫等食肉动物，人多因被病兽咬伤而感染。死亡率几乎100%。2021/7/19 星期一2狂犬病毒狂犬病病毒(Rabies virus)是一种嗜神经性病毒。属于弹状病毒科 (Rhabdoviridae)、狂犬病毒属 (Lyssavirus)。病原学2021/7/19 星期一3病原学A .病毒的子弹状外形；B. 蜂窝状核衣壳（RNP）；C. 病毒外表面双层脂质突起2021/7/19 星期一4狂犬病毒形态子弹状，一端圆形，另一端平凹，宽75-8

2、0nm，长140-180nm。 2021/7/19 星期一52021/7/19 星期一6核酸：-ssRNA。衣壳：螺旋对称排列。包膜： M2蛋白（内层）；脂蛋白（主要成分）；刺突：与病毒的感染性、血凝性和毒力等相关。结构2021/7/19 星期一7结构病毒主要编码5种蛋白：糖蛋白（G）、核蛋白（N）、聚合酶（L）、磷蛋白（NS）和膜蛋白（M）。糖蛋白能与乙酰胆碱受体结合，决定了病毒具有嗜神经性，产生中和抗体有保护作用；核蛋白抗原，是荧光免疫法检测的靶抗原，有助于临床诊断。2021/7/19 星期一8 狂犬病病毒的动物感染范围较广，主要在野生动物及家畜中自然感染与传播。 在易感动物或人的中枢神经

3、细胞、主要是大脑海马回的锥体细胞中增殖时，可以在胞质内形成一个或多个、圆形或椭圆形、直径为20nm30nm的嗜酸性包涵体，称内基小体（Negri body）。通过检查动物或人脑组织标本中的内基小体，可以辅助诊断狂犬病。 培养特性2021/7/19 星期一9Negri body of rabies virus in infected neuron(intra-cytoplasmic)2021/7/19 星期一10内基小体为圆形或卵圆形嗜酸性小体，大小为120um，一般在510um之间，见于胞浆内任何部位或树突中，可有一个或多个，其形状与所在部位有关。包涵体所在细胞可无明显病变，或可仅有尼氏体减少

4、。2021/7/19 星期一11病原学 来源于世界各地的狂犬病病毒分离株的抗原性不同。根据病毒表面糖蛋白G的抗原性差异，狂犬病病毒可分为4个血清型。狂犬病病毒的主要抗原包括: 糖蛋白G:病毒表面，刺激机体产生中和抗体、血凝抑制抗体和细胞免疫应答； 核蛋白N：病毒核心，属特异性抗原，能够以核蛋白(RNP)的形式诱生保护性的细胞免疫应答，但刺激机体不能产生保护性抗体。 抗原性2021/7/19 星期一12狂犬病毒的血清型1、血清1型：典型的狂犬病毒株，犬类传播。2、血清2型：Lagos蝙蝠株，分离自尼日利亚和中非共和国。3、血清3型：Mokola病毒株，分离自尼日利亚田鼠4、血清4型：Duvenh

5、age病毒株，分离自南非狂犬病人5、血清2型：EBL1蝙蝠株，分离自乌克兰蝙蝠6、血清2型：未定型株，分离自乌克兰蝙蝠2021/7/19 星期一13病原学野毒株（wild strain）或街毒株（street strain）:从自然 感染的动物体内分离到的病毒。固定毒株（fixed strain）:将野毒株在家兔脑内连续传 代后，病毒对家兔致病的潜伏期可以随传代次数 的增加而逐渐缩短；传代至50代左右时，潜伏期 可由原来的4周左右缩短为4天6天；但继续进行 传代，潜伏期不再缩短。这种变异的狂犬病病毒 被称为固定毒株（fixed strain） . 其重要特点:是对家兔的致病性增强，对人或犬的

6、致病性明显减弱；并且从脑外途径对犬进行接种 时，不能侵入脑神经组织引起狂犬病。 变异2021/7/19 星期一14病毒抵抗力不强。对热敏感，60经30min或1002min即可灭活。易被紫外线、甲醛、强酸、强碱、乙醇、乙醚等灭活。肥皂水、离子型或非离子型去垢剂亦有灭活作用。在冰冻干燥下可保存数年。 病原学抵抗力2021/7/19 星期一15传染源发展中国家主要传染源是病犬，由病犬传播者约占8090%，其次为猫和狼。一般认为，动物发病前5天唾液中可含有病毒；发达国家野生动物如狐狸、食血蝙蝠、臭鼬和浣熊等逐渐成为重要传染源；无症状带毒的犬、猫等兽类亦有传染性； 流行病学 2021/7/19 星期一

7、16BATarmadillo2021/7/19 星期一17Catfoxraccoon dog2021/7/19 星期一18传播途径被患病动物咬伤、抓伤，病毒自皮肤损伤处进入人体；粘膜也是病毒的重要侵入门户，如眼结合膜被病兽唾液沾污等；也可由染毒唾液污染外环境（石头、树枝等）后，再污染普通创面而传染。流行病学 2021/7/19 星期一19流行病学 易感人群 人群普遍易感，兽医、动物饲养者与猎手尤易遭感染； 接触家犬或野兽机会多的农村青壮年和儿童居多，男性多于女性。流行特征 温血动物传染病，分布广泛，以家犬密度大的地方多见；全年发生，冬季发病率略低。 2021/7/19 星期一202006，1至

8、2007，5狂犬病发病情况图2021/7/19 星期一2120022006狂犬病发病情况2021/7/19 星期一22发病机理人被病犬咬伤病毒随犬唾液经伤口进入人体（病毒在入侵部位的肌肉细胞中增殖）通过神经肌肉接头侵入周围神经细胞-细胞间传递形式神经节直至中枢神经系统（脑组织中病毒迅速增殖扩散）沿传出神经传至唾液腺及其他组织。2021/7/19 星期一23临床表现 潜伏期 人被狂犬咬伤，发病率为30%60%。咬伤后能否发病，与受伤部位、伤势程度及病畜唾液中的病毒量有关. 短的5日，长的达10余年，多数13个月；儿童、头面部咬伤、伤口深、扩创不彻底者潜伏期短； 2021/7/19 星期一24典型

9、临床表现：前驱期 发热、头痛、乏力、周身不适等症状，对痛、声、光等刺激较敏感，并有咽喉紧缩感。约5080%病人伤口部位及其附近有麻木或蚊走感；兴奋期或痉挛期 处于兴奋状态，如极度恐惧、烦燥，对水声、风等刺激非常敏感，易于引起发作性咽肌痉挛、呼吸困难等。部分患者出现特殊的恐水症状，在饮水、见水、流水声或谈及饮水时，可引起严重咽喉肌痉挛，称为“恐水症”（hydrophobia）。随后，部分病人出现精神失常、定向力障碍、幻觉、谵妄等。病程进展很快；麻痹期 痉挛减少或停止，出现弛缓性瘫痪，神志不清，最终因呼吸麻痹和循环衰竭而死亡。 2021/7/19 星期一25体液免疫：感染后机体产生中和抗体。有中和

10、游离 状态的病毒、阻断病毒进入神经细胞内的作用。 接种疫苗所获得的防止发病效果可能与此 有关。但抗体对已进入神经细胞内的病毒难以 发挥作用。同时也可能产生免疫病理反应而加 重病情。细胞免疫：杀伤性T淋巴细胞特异性地作用于病毒的蛋白抗原，引起病毒溶解；单核细胞产生的IFN和IL-2具有抑制病毒复制和抵抗病毒攻击的作用。免疫性2021/7/19 星期一26预防 加强动物管理，控制传染源大力宣传养狗及其他野生动物的危害；野犬应尽量捕杀；家犬应严格进行登记和疫苗接种；狂犬或患狂犬病的野兽应立即击毙焚毁或深埋，严禁剥皮吃肉。2021/7/19 星期一27预防 狂犬病暴露后预防（2006年10月卫生部发布

11、狂犬病暴露后处置工作规范（试行）2021/7/19 星期一282021/7/19 星期一29伤口处理立即用肥皂水、消毒剂或单用清水反复清洗伤口，时间不低于15分钟，伤口深时要用注射器灌注反复冲洗；然后用酒精反复消毒，最后涂上碘酒；伤口不止血、不包扎、不缝合；使用人抗狂犬病免疫球蛋白（HRIG）10 IU/kg或马抗狂犬病免疫血清20 IU/kg在伤口底部和周围行局部浸润注射；同时以相同剂量做臂部肌肉注射。必要时使用抗菌药物；伤口深时还要使用破伤风抗毒素。2021/7/19 星期一30预防接种 接种狂犬疫苗是预防发病的重要措施。即所谓的预防性治疗。由于狂犬病的潜伏期长，从被咬伤到发病一般经过几十

12、天或几个月，在此期间尽早接种疫苗可免于发病。 严重咬伤者，除应给予高效价免疫血清进行被动免疫外，仍需要接种狂犬疫苗，可收到更佳效果。2021/7/19 星期一31疫苗注射暴露前预防：适用于高危人群如兽医、山洞探险者、相关实验人员、动物管理员，0、7、21天各2ml肌肉注射；23年加强注射一次；暴露后预防：咬伤后注射越早越好一般患者接种5次，0、3、7、14、30各接种一次；严重咬伤患者接种10次，前6天每日一针，10、14、30、90天各1针。1年内再次咬伤者，0、3天各接种一次；13年内再次咬伤，0、3、7各接种一次；超过3年，重新接种。注意疫苗储存在2。2021/7/19 星期一32疫苗的

13、历史公元七世纪： 印度的佛教徒以喝蛇毒的方式获得对毒蛇的免 疫应为最早的预防免疫的记载； 公元十世纪： 据1932年在天津出版的中国医学史记 载，中国已有种痘的记载，但无法考证； 公元十六世纪： 据1742出版的 医宗金鉴记载，至少在 1695年中国已确有用干的天花痂粉吹鼻种痘、用棉花蘸天花痂粉塞鼻和健康小孩穿几天出天 花小孩内衣等方式种痘免疫的记载.公元十八世纪：英国Edward Jenner 接种牛痘预防天花2021/7/19 星期一33疫苗的历史公元十九世纪： 七十年代法国 Louis Pasteur研究减毒鸡霍 乱菌1885年Louis Pasteur 狂犬病疫苗的试验成功；公元十九世

14、纪末: 美国 Salmon, Smith,法国 Chamberlain和 Roux分别研究的细菌疫苗: 伤寒、霍乱和鼠疫菌苗；公元二十世纪： 1927年上市的卡介苗，法国Calmette和 Guerin从牛分离的结核菌通过牛胆汁传代获得的减毒株制成的疫苗，1936年Wilson Smith 和 Thomas Francis分别在禽胚中研 制成功灭活的甲型流感疫苗。2021/7/19 星期一34疫苗的历史 人用疫苗发展一览表 减毒活疫苗 全病原体灭活疫苗 纯化蛋白/多糖疫苗 基因工程疫苗 十八世纪 天花疫苗，1798 十九世纪 狂犬病疫苗，1885 伤寒疫苗1896 霍乱疫苗1896 鼠疫疫苗1

15、897 二十世纪 BCG（结核）1927 百日咳，1926 （全细胞） 白喉，1923 早 期 黄热疫苗， 1935 流感疫苗，1936 破伤风，1927 立克次体，1938 二次大战 脊灰（口服） 脊灰（ 注射） 肺炎球菌 乙型肝炎（酵母 以 后 麻疹、腮腺炎 狂犬病疫苗（新） 脑膜炎球菌 或哺乳细胞表达） 乙型脑炎 乙型脑炎 流感嗜血杆菌 百日咳类毒素 风疹、水痘 甲肝疫苗 乙型肝炎（血浆 腺病毒 出血热 森林脑炎 轮状病毒 伤寒（Vi多糖） 伤寒 流感嗜血（结合） 百日咳（无细胞） 2021/7/19 星期一35 狂犬疫苗的应用一、狂犬疫苗的种类二、狂犬疫苗的接种程序 a. 暴露前程序

16、b. 暴露后程序 c. 其它免疫程序2021/7/19 星期一36 狂犬疫苗的接种程序1 . 暴露前免疫程序 标准免疫程序 0 7 28天 0 28 56天 2021/7/19 星期一37 暴露后免疫程序 标准免疫程序 0 3 7 14 28标准加强免疫程序 0 3 7 14 28 90首剂加倍程序 2 1 1皮内多点免疫程序 8 4 1 1 2 2 2 0 1 12021/7/19 星期一38非标准免疫程序（暴露后） 2 1 1免疫程 0 7 21 （天） 上臂三角肌注射： 几种疫苗接种后的抗体反应 疫苗 第七天 抗体 iu/ml 血清阳转率 HDV 0.5 (0-6.7) 17/26 (6

17、5%) PCEC 1.2 (0.1-21.9) 19/23 (83%) PVRV 1.0 (0.1-2.3) 18/23 (78% ) 2021/7/19 星期一39 非标准免疫程序（暴露后） 8-4-1-1免疫程序 0 7 21 91（天） 注射时间 上 臂 肩胛 大腿 腹壁 （天） 三角肌 上 方 内侧 0 7 28 91 每点0.1ml 2021/7/19 星期一40非标准免疫程序（暴露后） 皮内多点免疫程序 2-2-2-0-1-1 注射时间 0 3 7 14 28 96（天） 2 2 2 0 1 1 2021/7/19 星期一41 狂犬疫苗接种后的效果评价 血清中和抗体： WHO：血清

18、中和抗体 0.5IU/ml 方法： 小鼠脑内测定法 ( MNT ) 荧光灶抑制试验 ( RFFIT ) ELISA、乳胶凝集试验等只作参考2021/7/19 星期一42 狂犬疫苗的种类WHO推荐的狂犬疫苗 HDCV人二倍体细胞培养疫苗 PCEC 鸡胚细胞培养疫苗 PDEV 纯化鸭胚疫苗 PVRV 纯化Vero 细胞疫苗我国生产的狂犬疫苗 PHKC地鼠肾细胞培养疫苗 PVRV 纯化Vero 细胞疫苗2021/7/19 星期一43 各类人用狂犬病疫苗 疫苗种类 毒种 纯化方法 生产国家-原代地鼠肾细胞 aG株 柱纯析 中国原代狗肾细胞 AM 末精制 荷兰原代鸡胚细胞 Fluly-LEP-C25 超

19、速离心 德国原代鸡胚细胞 Fluly-HEP 超速离心 日本胚鸭细胞 PM株 梯度密度离心 瑞士人胚肺二倍体细胞 PM株 超速离心 英国瑞士（ WI-38 ） 德国法国美国 人胚肺二倍体细胞 SAD 超速离心 加拿大 (MRC-5)Vero细胞 PM 梯度密度离心 法国 aG株 CTN-1株 中国 -2021/7/19 星期一44佐剂疫苗和无佐剂疫苗 免疫效果的比较 采血时间 抗体GMT 抗体阳转率 IU/ml(血清) (%) 天 佐剂 无佐剂 佐剂 无佐剂 7 0.1 0.4 8.1 45.2 14 1.2 2.3 59.5 100 45 16.5 17.5 100 1002021/7/19

20、 星期一45我国生产狂犬疫苗的企业北京生物制品研究所 V 沈阳安迪生物高科技公司 H V上海生物制品研究所 V 长春长生实业股份公司 H V 长春生物制品研究所 H V 辽宁生物工程公司 H V兰州生物制品研究所 H V 大连高新生物技术公司 H武汉生物制品研究所 V 吉林亚太 H宁波荣安生药业公司 V 河北省医药技术公司 H常州延申生物药业 V 河南普新生物工程有限公司 H海南生物制品研究所 V2021/7/19 星期一46生产用细胞用于疫苗生产的优缺点 原代细胞： 地鼠、沙鼠肾细胞、鸡胚细胞 优点： 来源容易，这些动物的繁殖快，尤其是地鼠是哺乳动 物中繁殖 最快的动物之一；4-5周出现性周

21、期，怀孕期15-18天，哺乳期20 天，产后24-36小时即可发情排卵，一年可产8-10胎。 制备的细胞没有遗转物质的突变，比较安全，不必考虑疫苗中的 残余DNA； 病毒容易在这些细胞中适应。 缺点： 需要建设相应的动物房，污染环境； 制备疫苗需要宰杀大量的动物 动物容易污染细菌、病毒、寄生虫等外源物质。 大量处死动物不符合“动物论理学”要求，2021/7/19 星期一47生产用细胞用于疫苗生产的优缺点 传代细胞系： Vero细胞、BHK-21 优点： 传代细胞系，几乎可以取之不竭 已经全面检定，其特性符合人用疫苗的生产，细胞库一经 建立，细胞质量可高度控制 该细胞生长条件要求不高，容易培养繁

22、殖； 可用生物反应器大规模生产 大多数病毒能在该细胞系中复制繁殖 疫苗生产是不要动物 缺点： 由于是传代细胞系，有一定的致肿瘤性； 疫苗必须纯化，且细胞DNA含量须达到标准（10ng/剂） 目前不适合活疫苗的生产2021/7/19 星期一48 狂犬疫苗的质量标准物理检查 乳白色疏松体PH值 7.2 8.0溶解时间 1 分钟硫柳汞含量 (mg/ml) 0.10蛋白含量（ug/剂） 120残余水份含量 % (g/g ) 3.0残余牛血清蛋白(ng / 剂) 50 灭活试验 小鼠应健在残余DNA含量 (ng/剂) 10 无菌试验 应无细菌生长异常毒性试验 小鼠试验 小鼠应键在, 体重增加 豚鼠试验

23、豚鼠应键在, 体重增加效力试验 (IU/剂) 2.5热稳定试验 (IU/剂) 2.5 2021/7/19 星期一49狂犬疫苗中添加剂安全性问题 人白蛋白问题 人血白蛋白在疫苗中作为添加剂起到 保护和稳定疫苗的作用 我国有1亿人为乙型肝炎病毒携带者 有为数众多的丙型肝炎患者 80-100万的HIV感染者 全球几乎无AIDS患者的国家 2021/7/19 星期一50 狂犬疫苗中添加剂安全性问题 人白蛋白: 目前人白蛋白的生产工艺为“低温乙醇法”（Cohn 6法）经不同浓度的乙醇反复沉淀的 第五组分中所得，所用血源须严格反复筛查，最终产品还须经60 10小时的巴氏法专项病毒灭活，经验证该产品有可靠的

24、安全性，国内外至今尚无使用该产品而感染HIV、HBV、HCV等报道。2021/7/19 星期一51 狂犬疫苗中添加剂安全性问题牛血清： 是细胞培养疫苗在细胞培养过程中必须的添加剂 纯化过程中已基本去除，质量标准50 n g/剂 最担心疯牛病（传染性海绵状脑病、 BSE ）源于 英国的BSE愈演愈烈，已经蔓延到法国、德国、比利时等31个国家。最近日本、加拿大、韩国也相继报告了BSE WHO ：人及动物传染性海绵状脑病相关的医用或 其他制品的研讨会报告（1997. 3） Report of a WHO Consultation on Medicinal and Other Products in

25、Relation to Human and Animal Transmissible Spongiform Encephalitis 2021/7/19 星期一52牛组织及体液的传染性分类I 类 高度感染 脑脊髓（ 眼）II类 中度感染 脾脏、扁逃体、淋巴结、回肠、近端大 肠、脑脊液、脑垂体、肾上腺、（硬脑 膜、松果体、胎盘）III类 低感染性 周围神经、鼻黏膜、胸腺、骨髓、肝、 肺、胰腺IV类 无感染性 骨骼肌、心脏、乳腺、牛奶、血清、粪 便、肾脏、甲状腺、唾液腺、唾液、卵 巢、子宫、睾丸、附睾、胎儿组织、（初 乳、胆汁、骨骼、软骨组织、结缔组织、 毛发、皮肤、尿液）2021/7/19 星期

26、一53CJD和vCJD问题源于英国的BSE愈演愈烈，已经蔓延到法国、德国、比利时等31个国家。BSE又与人类vCJD有关。到2002年6月，在英国已确认为vCJD病人有122人，其中113人已死亡。对113个死亡病历因果分析，89例确定是BSE感染，其他24人可能与BSE有关。目前虽无证据表明经血、血液成分和血液制品转播vCJD，但是由于vCJD是新出现的疾病，现在就认为vCJD无传染性还为时过早。动物试验表明血液中传染因子含量低，但有传染性。而且实验证明牛BSE可以传染给羊。因此有理论上的风险。应特别关注经人血传染vCJD的可能性。2021/7/19 星期一54狂犬疫苗安全性问题（ Vero

27、 细胞残余DNA） 质量标准10n g/剂 100pg /剂 检测灵敏度 ： 1-10pg/ml 2ug (2x106 pg) SV40DNA可使50%动物致瘤 为一个致瘤剂量 如100pg则为100/2 x106=0.5x10-4致瘤剂量 如每个细胞基因组DNA为10pg, 而一个癌基因为10Kb(约10-5pg ),则致瘤基因为细胞基因组的1/106，100pg细胞DNA中含100 X10-6pg致瘤基因,则致瘤剂量为 10-4/2x106=0.5x10-10个致瘤剂量。 一个致瘤剂量的细胞DNA10000ng .2021/7/19 星期一55Vero细胞的致肿瘤性 Montagnon实验： 用裸鼠进行肿瘤实验，106 或107细胞注射裸鼠， 同时用Hela细胞作对照 137-169代： 注射部位结节呈退行性变，全部 动物无肿瘤发生 190-210代： 注射部位结节呈进行性变，全部 动物出现肿瘤，且半数动物发生 肺和淋巴节的肿瘤转移。 结论：170代以前的细胞是安全的2021/7/19 星期一56Ver