细胞免疫荧光步骤

1、细胞免疫荧光步骤【原理】用特异性抗体（第一抗体）与细胞中的相应抗原反应，洗去未与抗原结合的抗体再用荧光标记的第二抗体与结合在抗原上第一抗体结合，形成抗原-抗体- 荧光抗体复合物由于荧光素在荧光显微镜下经过特定波长的光照摄激发后能发射出荧光， 借此可对抗原定位和定量。【材料】培养细胞【试剂】4%的多聚甲醛。PBS （0.18M PH37.2） : NaCl 18 克，Na2HPO4. 12H2O 12 克，NaH2PO4,2H20 0.8 克溶于 2000m蒸馏水。封闭血清：与二抗同种来源属性的非免疫血清。第一抗体：XXX。第二抗体：与一抗种属性匹配TRITC标记的，（中杉金桥公司， ZF-03

2、13 Goat Anti-Mouse IgG （H+L）,）。DAPI：（碧云天 公司，Cat.C1006）染核。抗荧光淬灭封片剂：碧云天 公 司 Cat .PO126【器材】冰箱，载玻片，盖玻片（做正面标记），微量移液枪，移液枪枪头，吸管，湿盒，指甲油，DOCK笔，EP管，吸水纸， 六孔板，摇床，振 荡器。【配制液体等】 0.5%-Triton : （ PBS 99.5ml +0.5mlTriton 由于 Triton比较粘，配前先在室温放会儿，磁力搅拌器搅匀可分装储存）10%正常封闭血清：（用PBS-Triton稀释，振荡器上振荡充分混匀，临用前配制）。0.3%-Tween ；用 PBS

3、稀释 Tween。【步骤】1取出生长48小时的细胞爬片，移入一个干净的六孔板冷PBS浸泡不超过3分钟（事先在六孔板的第一排三个孔分别标记）。2每个玻片滴加4%的多聚甲醛冰上 固定14分钟。注意，要水平，覆盖均匀。（准备封闭血清用PBS-Triton稀释1:10振荡器 上振荡混匀）。3冷PBS,5分钟X2次摇床150rpm缓慢洗净，PBS-Triton透膜5min。（如 果是胞浆，核或膜内表面表达需要这一步，如果是膜外表面表达的则不需要透膜）4擦干爬片边缘，用DOCK笔在爬片四周边沿画圈（以防止爬片上所加试剂因失去张力 流失，导致干片）。将爬片分别放入六孔板下排与上排标记相对应的孔内（该加封闭血

4、清了， 此时要求板是干燥的，下一排板没用过是干燥的）。用微量移液枪，在每张爬片上加10%正常封闭血清，室温湿盒中阻断30min。（准备 一抗，用PBS-Triton稀释 抗体1:100振荡器上振荡混匀）。一抗孵育：加已经稀释好的一抗，用微量移液枪小心加一抗，（逐个片去封闭液，擦干 圈外水，加一抗注意：不要碰细胞）置湿盒中，4冰箱过夜，剩余的一抗保留。7.次日， 轻轻去盖，查看张力还在。轻轻移至室温，湿盒内再孵育1小时。注意不干片。8 PBS-Tween洗，3次x5min （据情况适当变化），。9将爬片四周擦干，再将其分别放回六孔板上一排原先的孔内。（加二抗，上一排板已干，所以再移回上一排板中）

5、。10.避光处，加二抗 覆盖均匀平放室温孵 育一小时（由于试剂会挥发，此间要查看，适当补加二抗避免干片）。11避光处,，PBS-Tween洗3次X5min （据情况适当 变化），轻轻的。12避光处，待爬片晾干，加DAPI （一小滴），室温孵育4min，PBS-Tween 洗3次，用手晃动洗涤。13避光处，待爬片晾干，往载玻片上滴加封片剂，爬片倒扣于封 片剂上，用指甲油封爬片四周（防封片剂溢出并固定爬片）。14观察：注意荧光强度随着灯光刺激衰减，尽快照相注意：为了避免互相污染 从第3步开始，三个爬片滴加试剂的吸管不能混用。 免疫荧光知识问答：第一：triton X-100破膜的原理到底是什么?理

6、论上来说：1 ）对于核蛋白，是必须打孔的。2）对于抗原和抗体结合位点在细胞膜的蛋白，不打孔也是可以的。打孔对结果也没有影响，只是多此 一至。3）对于跨膜蛋白，抗原和抗体结合位点在胞内的，需要打孔；在胞外的，不需打孔。在实际操作中，在细胞样本的制作中，可能出现细胞破损，这样，在不打孔的情况下，核蛋白及在 结合位点在胞内的蛋白也可能着色。如果不知道某个蛋白是属于什么情况，要查文献。实在不知道，就打孔吧，因为不影响实验结果。第二：二抗封闭原理的问题。关于封闭的问题，因为血清中含有多种的蛋白或者IgG，在加一抗、二抗之前与样本先孵育，可以借 用血清中的蛋白或者免疫球蛋白IgG等，将样本中能够与蛋白或者

7、IgG等结合的位点先占据，这样在 加一样、二抗的时候，一抗和二抗就更多是去识别特异的位点，而不会与样本的其他无关位置有非特 异性结合。选择与二抗来源一致的血清封闭，是为了避免二抗与封闭的血清中的成分再次发芸非特异 性结合。至于BSA也是类似的原理，不过因为其中的成分单一，所以相对来说封闭的效果是不如血清 的。除了技术支持所说的，还有一个因素。假设一抗是从动物一中得来的，二抗是从动物二中得来的。在二抗的制备过程中，不可避免含有动物 二的自身抗体。而这些自身抗体可能与样本的非特异抗原结合形成非特异着色。如果在二抗孵育前，先用来自二抗来源的血清封闭，二抗来源的血清含有动物二的自身抗体。那么，这些自身

8、抗体就会与样本的非特异抗原先结合。再加二抗后，则会大大减少二抗中自身抗体与 样本的非特异抗原结合的机会。BSA成分单一，也不含有动物二的自身抗体，封闭效果就不如二抗来源的血清。第三:最近做免疫荧光，一个不该在细胞核表达的抗体总是出现细胞核的非特异性染色。这种情况大多是因为细胞固定的方法引起的，请问您是采用的哪一种的固定方法，针对您的这种抗体， 您可以考虑改变固定方法，如用多聚甲醛，冰丙酮，甲醇或者甲醇与丙酮不同配比等，您可以上网百 度一下“不同固定方法对细胞免疫荧光染色结果的影响”，应该可以搜索到不同固定方法的建议，调 整一下会有改善的DAPI： DAPI 即 4,6-二脒基-2-苯基吲哚（4

9、,6-diamidino-2-phenylindole），是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，常用于荧光显微镜观测。因为DAPI可以透过完整的细胞膜 它可以用于活细胞和固定细胞的染色。在荧光显微镜观察下，DAPI染剂是利用紫外光波长 的光线激发。当DAPI与双股DNA结合时，最大吸收波长为358nm，最大发射波长为461nm， 其发散光的波长范围含盖了蓝色至青绿色。DAPI也可以和RNA结合，但产生的荧光强度 不及与DNA结合的结果，其发散光的波长范围约在500nm左右。DAPI的发散光为蓝色，且DAPI和绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein, GFP）或 Texas Red染剂（红色荧光染剂）的发散波长，仅有少部分重叠，研究员可以善用这项特性在 单一的样品上进行多重荧光染色。DAPI能快速进入活细胞中与DNA结合，因此DAPI对生物体而言，也被视为一种毒 性物质与致癌物。使用过程中应注意操作与抛弃的处理程序。在细胞移植前，将DAPI以一定的浓度加入培养基中，与细胞共同孵育过夜，用PBS 缓冲液漂洗至少6次以洗掉未结合的DAPI，再用酶消化后离心收集细胞，加入DMEM培 养基制成细胞悬液以备用。存储条件：-20 C避光保存