蛹虫草培养基中虫草素分离提取的工艺综述

1、蛹虫草培养基中虫草素分离提取的工艺综述摘要：查阅了相关文献，对蛹虫草的化学成分及其药理作用、蛹虫草培养基的配制及蛹虫草的栽培作了简介。对虫草素的物化性质及生理活性作了详细综述，并对虫草素分离提纯在国内外研究动态进行了介绍，从而为从蛹虫草培养基中分离虫草素的新工艺提供了分析资料。关键词：蛹虫草培养基；虫草素；分离提取一、蛹虫草（一）蛹虫草的化学成分蛹虫草又名北冬虫夏草，与我国名贵中药材冬虫夏草为同属异种，属于真菌界子囊菌门麦角菌科虫草属。在我国主要分布于吉林、河北、四川、湖南、湖北及山西等省。北方民间曾把它当作冬虫夏草应用，新华本草纲要记载其性平，味甘，有益肺肾，补精髓，止血化痰”用于肺结核、老

2、人虚弱和贫血等症状，为珍贵的中药材。国内外学者对其化学成分、生理活性进行了较系统的研究，也从中分得了大量单体化合物。姜泓等从其子实体中分离出7个化合物，分别鉴定为3匕脱氧腺苷，腺苷、N6-甲基腺苷、05-乙酰基虫草素、N6-B（乙酰胺甲酰）氧乙基腺苷、虫草环肽A和麦角甾醇过氧化物。实体中还包括虫草酸（D-甘露醇）、虫草多糖等多种有效成分，其中Zn/Cu=4.3，为人参的1.4倍，为黄芪等补益药的2.8倍。核苷类衍生物是蛹虫草重要的活性成分，虫草素是虫草最重要的活性成分之一，是虫草中的一种腺苷类结构类似物，具有显著的药理作用。（二）蛹虫草的药理作用蛹虫草由虫草属真菌寄生在鳞翅目、鞘翅目及双翅目的

3、一些昆虫的蛹或幼虫体上，使虫体僵死，抽生出子座而形成的。对它的药理作用方面，2006年文庭池进行了比较详细的概述，认为蛹虫草具有抗肿瘤、抗氧化、抗衰老等作用。中医认为，虫草入肺肾二经，既能补肺阴，又能补肾阳，主治肾虚，阳痿遗精，腰膝酸痛，病后虚弱，久咳虚弱,劳咳痰血，自汗盗汗等，是唯一的一种能同时平衡、调节阴阳的中药。蛹虫草含有8种维生素，具有调节神经系统的作用，对植物神经系统具有外周抗胆碱作用，能降低副交感神经兴奋性。蛹虫草还具有镇静作用，并且对心悸、失眠有较好的治疗作用。陈桂宝等对蛹虫草的药理作用进行了研究，观察到蛹虫草对人黑色素瘤B16细胞、人白血病HL-60细胞、人体红血病K562细胞

4、具有较好的抗瘤效果，有些作用优于冬虫夏草。沈均等也认为蛹虫草具有明显耐缺氧、增强记忆、抗炎、提高免疫力、促进能量代谢等独特功效。二、蛹虫草培养基（一）培养基配制以大米、玉米等作主料，另添加10%25%的蚕蛹粉或奶粉提高蛹虫草子实体的品质。将培养料与营养液以1:1比例拌匀，pH掌握在5.57.0。按常规装瓶、灭菌、接种。（二）蛹虫草栽培1、栽培条件。碳源，是蛹虫草合成碳水化合物和氨基酸的基础，也是重要的能量来源。人工栽培时，蛹虫草可利用的碳源有葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、果胶等，其中尤以葡萄糖、蔗糖等小分子糖类的利用效果最好。氮元素，是蛹虫草自身合成的蛋白质、核酸等有机氮以及铵盐等无机氮。能利用

5、的有机氮很多，如，氨基酸、蛋白胨、豆饼粉、蚕蛹粉等；无机氮主要有氯化铵、硝酸钠、磷酸氢二铵等。有机氮的利用效果最好。矿质元素，以磷、钾、钙、镁等为主要元素。一般通过添加无机盐类来满足蛹虫草对矿质元素的需求。维生素，虫草菌丝不能合成必要的维生素，适当加入VB1有利于菌丝的生长发育。温度，在虫草的不同生长发育阶段都有最适温度、最低温度和最高温度的界限。菌丝生长温度630C，低于6C极少生长，高于30C停止生长，甚至死亡。最适生长温度为1822C;子实体生长温度为1025C,最适生产温度为2023C。原基分化时需较大温差刺激，一般应保持510C温差。水分，是蛹虫草菌体细胞的重要组成部分。菌丝生长阶段

6、，培养基含水量保持在60%65%,空气相对湿度保持在60%70%;子实体生长阶段，培养基含水量要达到65%70%,空气相对湿度保持在80%90%。要注意培养基适时补水和补充营养液。空气，蛹虫草需要少量空气。但在子实体发生期要适当通风，增加新鲜空气。否则，二氧化碳积累过多，子座不能正常分化，影响生长发育。光照，孢子萌发和菌丝生长阶段不需要光照，应保持黑暗环境。但转化到生殖生长阶段需要明亮的散射光，光照度为100240IX。光照强，菌丝色泽深，质量好，产量高。酸碱度，蛹虫草为偏酸性真菌，其菌丝生长发育最适pH为5.26.8。但在灭菌和培养过程中pH要下降。所以，在配制培养基时，应调高pH11.5,

7、在配制培养基时可加0.1%0.2%的磷酸二氢钾或磷酸氢二钾等缓冲物质。2、栽培要点。育种，长期采用无性繁殖及多次转管的蛹虫草菌种，其母本基因容易变异，表现为出草畸形，产质量下降。因此，在生产中应定期对蛹虫草菌种进行一次有性繁殖。菌丝体培养，接种后的料瓶，应置于清洁、避光的环境中培养，保护空气湿度60%。初始阶段，为减少杂菌污染，室内温室宜保持在1518C之间，待料面布满虫草菌丝后，将温度提到2023C,持续15d左右，菌丝即可吃透培养料，完成营养生长。子实体培养，菌丝体成熟后，由白色逐渐转为桔黄色，此时，室内应增加光照，白天利用自然散射光，保持200IX,晚间可利用日光灯作光源，每天应不少于1

8、0h光照，以促使菌丝体转色和刺激原基形成。待料面突起，并形成小米粒状原基时，要适当通风，补充新鲜空气，保护室内温度1822C,并提高空气相对温度至80%85%。如湿度太大，易使培养基提早失水而影响产量。蛹虫草有较强的趋光性，因此，在子实体形成后，应根据情况适当调整培养瓶与光源的相对方向，或调整室内光源方向，以保证子实体的正常生长形态，从而提高产量。三、虫草素的研究概况（一）虫草素的研究价值1、虫草素的物化性质。1951年Cuningham等观察到被蛹虫草寄生的昆虫组织不易腐烂，随后从中分离到一种腺苷类活性物质，命名为虫草素，又称虫草菌素，确定其结构式为3-脱氧腺苷。虫草素是第一个从真菌中分离出

9、来的核苷类抗菌素，其分子式为C10H13N5O3,分子量为251D，碱性，熔点230231C，溶于水、热乙醇和甲醇，不溶于苯、乙醚和氯仿，紫外光最大吸收波长为259nm。虫草素的结构式见图1。2、虫草素的生物活性。虫草素是一种抗菌素，具有抗菌、抗病毒、干扰人体RNA及DNA合成、明显抑制多种肿瘤细胞生长等作用。Yo-shikawa等将小鼠接种B16黑色素瘤细胞2周后，给小鼠每天口服5mg/kg和15mg/kg剂量的虫草素，2周后发现15mg/kg虫草素可以明显抑制小鼠体内B16黑色素瘤细胞的增殖和生长，表明虫草素对肿瘤细胞的生长与增殖具有抑制作用。研究表明，虫草素的抗肿瘤作用可能与其选择性的抑

10、制mRNA而影响蛋白质合成有关。Koc等研究表明虫草素对TdT-po-sitive白血病细胞有特异的细胞毒作用。而Yamkaguchi等曾用虫草素同时处理癌细胞和正常细胞，结果发现癌细胞分裂抑制率达到55%,正常细胞分裂抑制率为1.5%。在免疫调节方面，Zhou等报道虫草素通过诱导产生白介素-10,同时抑制白介素-2的生成，表明其具有较强的调节免疫功能。虫草素还可以促进细胞分化、抑制细胞分裂，改变细胞膜上物质结构分布等作用。（二）虫草素分离提纯工艺国内外研究状况对蛹虫草中虫草素含量的测定，国内外主要采用薄层色谱扫描法、HPLC-DAD、RP-HPLC法、双波长薄层扫描法、色谱技术和薄层色谱扫描

11、法联用法及其两者的联用法和毛细管电泳法（CE）。而提取方法主要有浸提法、超声法、索氏提取法以及回流法等四种方法。虫草素分离纯化的研究有离子交换树脂法、反相高效液相色谱法，超临界萃取法、活性炭吸附法、硅胶柱层析法。陈星采用反吸附不交换的方法得到了虫草素晶体。他以蛹虫草真菌固体干燥培养物为原料，通过粉碎、热浸、低度醇液提取、过滤四步得到提取液。当提取液在pH8.09.0时，有效成分虫草素既不被717阴离子（Cl-）交换树脂吸附，也不被732阳离子（“）树脂吸附，这样无关的有机或无机阴、阳离子均被离子交换柱吸附。而经上述处理过的虫草素处于近中性状态，这时重调pH至11.0,使虫草素带负电荷被吸附在7

12、17阴离子（CI-）树脂上，然后用纯净水或蒸馏水洗脱、浓缩、结晶而得到虫草素晶体。陈顺志等采用超临界萃、Cuningh-am等将蛹虫草培养液经过过滤后用活性炭吸附再经过洗脱液洗脱和浓缩都得到了虫草素晶体；此外，也有人采用了氧化铝柱层析和硅胶柱层析的方法对虫草素进行分离纯化。目前，国内外对虫草素分离纯化工艺进行了积极的研究，并取得了一定的进展。但是，现有的方法都不同程度存在着提取率低、分离纯化选择性差，以及工业化生产成本高的缺点。所以，如何提高分离提纯得率和降低生产成本是以后虫草素分离纯化研究的方向。大孔树脂具有良好的网状结构和很高的比表面积，选择性好、易解离、机械强度大、可反复使用、流体阻力小

13、和使用溶剂安全等优点。到目前为止还未见用大孔树脂来分离纯化虫草素的报道，如果能将其应用在虫草素提取纯化中，将为分离纯化虫草素提供一条新的途径。笔者应用大孔树脂对蛹虫草培养基中虫草素进行了分离纯化研究，使用高效液相色谱对虫草素进行了定量测定，以寻找到最适的大孔树脂吸附条件。（三）虫草素分离纯化工艺研究的目的及意义早在20世纪七十年代虫草素就被发现有抑制肿瘤、抗疟原虫和抑制mRNA翻译的作用。九十年代研究发现，添加腺苷脱氨酶抑制剂对其抗肿瘤活性的表达起着重要作用，虫草素的研究从而获得突破性进展，美国1997年开始将虫草素用于一期临床实验，治疗急性前B和前T淋巴细胞白血病患者。同时，虫草素还表现出极

14、强的抗真菌、抗HIV-I型病毒和选择性抑制梭菌属细菌活性特点。虫草素能干扰细胞RNA和DNA的合成，抑制不正常细胞（癌细胞）的分裂并能作为区别细胞中不同的RNA聚合酶的工具，并具有修复基因、保护生命体遗传密码的特殊功效。现在虫草素在美国作为抗癌、抗病毒新药，已经进入三期临床。目前，已有不少以虫草素为主的保健品、保健食品、化妆品、药品投放市场。1998年，陈顺志等利用生物技术和超临界萃取技术成功获得了蛹虫草中的虫草素，经加工处理制成了虫草活性素软胶囊。据报道，在我国也已将由虫草素合成的治疗白血病的新药进入临床试用期。从人工蛹虫草子实体中提取虫草素的工艺研究文献报道很多，且生产企业一般也只收割人工

15、蛹虫草的子实体，培养基残基只用于喂养家畜。此外，国内外报道虫草素能够人工合成，也可以从冬虫夏草中提取，但产量低，且价格昂贵。然而，笔者在试验过程中发现蛹虫草培养基残基也有一定含量的虫草素。据郭宇森等研究，虫草素在人工蛹虫草培养基残基中也能检测到含量值，其含量在0.072%1.250%,平均0.447%。为充分、合理地利用蛹虫草培养基残基，笔者通过对大孔树脂分离提取蛹虫草培养基残基中虫草素的工艺研究，寻找分离和提取的最适条件，从而为蛹虫草培养基残基中虫草素的工业化生产提供试验依据，开辟新的低成本、高生产效率的工业生产路线。其意义在于虫草素是抗肿瘤的天然成分，还有抗病毒、抗真菌、抗结核菌的作用，有广阔开发前景和巨大的商业价值；其次，从工业生产上考虑，利用大孔树脂进行分离从而降低生产成本，使虫草素得以更为广泛的应用；再次，从资源上考虑，可充分实现资源的再利用，避免造成资源的浪费；最后，本课题利用大孔树脂进行分离全过程溶剂只采用乙醇和水，这对工业化生产提供安全性操作，同时对提取出的虫草素产品提供高安全食用性；目前未见用大孔树脂来分离纯化虫草素的报道及专利。参