免疫学检验试剂的制备

1、1免疫学检验试剂的制备2免疫学检验免疫学测定（immunoassay）是基于抗原抗体反应的一种方法，一般指定量测定，但广义上讲，也应包括定性分析。免疫学测定用于疾病诊断时称为免疫学诊断或免疫学检验。免疫学检验内容不仅包括激素、维生素、药物、毒物、蛋白质和酶等检验项目，还渗透到环境卫生、食品卫生、畜牧兽医、作物保护、司法鉴定和宠物保健等领域。3免疫学检验试剂免疫学检验的方法和试剂的研究、开发和商业化已经有几十年的历史20世纪60年代起发展加快20世纪70年代形成产业体系现在已经成为生物高科技产业的一大支柱现代免疫学检验不再是单纯血清，试剂也不再是单纯的抗血清，采用各种标记和结合蛋白等手段，丰富和

2、发展了免疫学检验的内容。4免疫学检验试剂免疫沉淀反应测定免疫吸附剂固相酶免疫测定快速酶免疫测定均相酶免疫测定粒子免疫测定5第一章 免疫沉淀反应测定可溶性抗原和可溶性抗体反应形成不溶性抗原抗体复合物（IC）的过程称为沉淀反应。抗原抗体反应存在最适比问题免疫沉淀反应测定的常用方法主要有： 免疫浊度法 凝胶内的沉淀试验61 免疫浊度法定义 可溶性抗原和可溶性抗体反应后，抗原抗体结合形成的免疫复合物，并以悬浮颗粒的形式存在于反应体系中。当这种免疫复合物颗粒足够大时，因其对光的散射作用而产生肉眼可见的浊度，或足以使仪器分辨的浊度变化，这种通过观察浊度变化以确定反应体系中是否有抗原存在的方法即称为免疫浊度

3、法。7免疫浊度法20世纪30年代出现，60年代后随着葡聚糖（dextran）和聚乙二醇（PEG）等高分子聚合物应用发现，才逐渐成为实用的测定方法。免疫浊度法分为终点法和速率法两种。免疫浊度法广泛应用于血浆蛋白、免疫活性蛋白、自身免疫抗体、药物、激素和各种传染病因子的测定。81.1 基础知识悬浮液或胶体的光散射作用可以用Rayleigh公式表示： (m2-m02)N2U Iq=I0 ( 1+cos2q) m2l4g2Iq-散射光强度，I0-入射光强度，l-入射光波长，q-入射光与散射光夹角，m,N,U分别表示微粒的折射率、数目和体积，m0为介质的折射率，g为光源至检测器的半径； q-为0时即为透

4、射光比浊测定法91.2 试剂的制备主要试剂包括：抗血清聚合物溶液标准溶液参考抗原溶液10抗血清基本要求： 高特异性、高效价、高亲和力、澄清度好、稳定性佳。制备：将免疫原免疫山羊或兔等动物，获得抗血清。在抗血清中溶入无水氯化钙（0.6%,w/v）和葡聚糖硫酸酯（ 0.05%，w/v ）， 于 40C 放置过夜，离心或过滤除去脂蛋白沉淀，上清夜或滤液加0.02 mol/L, pH5.2 PBS 于40C透析，分离去沉淀物，上清液用 0.1 M NaOH 溶液调至 pH 7.4，加0.1%NaN3和0.01%柳硫汞防腐。11PEG0.05% pH7.4 PBS溶液：每升含NaCl90g, 2-硫代珀

5、瑞玲氧化钠盐0.1g，Tween20或Triton x-100 15ml，NaN3 1.0gPEG 6000用该缓冲液配制成： 80g/L溶液散射法 48g/L溶液透射法12标准液或参考抗原溶液自行制备参考抗原溶液购买标准液、参考标准溶液13样品处理试剂或样品的浊度会干扰免疫浊度法测定，故试剂应经离心或过滤等处理。高血脂是新鲜样品混浊的主要原因，血清搁置一定时间后某些蛋白成分也会自行聚合混浊。混浊样品澄清剂（cleaing agent for turbid samlpe,CATS） 主要成分：去垢剂或表面活性剂 湿润剂：糖类或聚乙二醇142 凝胶内免疫沉淀反应单向免疫扩散法双向免疫扩散法152

6、.1 单向免疫扩散法材料准备用载玻片或一定规格的玻片作为底板，洗净，干燥。pH 7.2 PBS配制预试确定合适的抗血清浓度抗血清琼脂板的浇制PBS配制2%琼脂，加热溶解，煮沸数分钟，冷却至500C。抗血清按预试确定的稀释度用PBS配制，加热至500C，与等体积的琼脂溶液混合。以0.2ml/cm2的量浇注玻片上，冷却至室温凝固后，密封，4 0C冰箱保存，备用。162.2 双向免疫扩散法琼脂板的浇制琼脂溶液配方为： 纯化琼脂9.0g，NaCl 0.9g，甘氨酸7.5g，柠檬酸三钠0.4g，酚0.25g，NaN30.1g，加水至100ml，板的浇制方法同单扩法。使用前打孔。17小结免疫浊度法：基本知

7、识、试剂制备 Rayleigh公式凝胶内的免疫沉淀反应： 1.单向扩散法：材料准备、抗血琼琼脂板制备 2.双向扩散法：琼脂板的浇注18第二章 免疫吸附剂定义：与固相载体结合的抗原或抗体称为 免疫吸附剂免疫吸附剂是固相免疫测定中的主要试剂19第一节 固相载体载体的基本要求载体的性质载体的选择载体的质量检定20载体的基本要求载体在固相标记免疫测定中作为分离游离的和结合的抗原或抗体的工具，其基本要求是：效 率：与免疫吸附剂的质量、反应性能密切相关实用性：与试剂成本及用户对方法的认可性直接有 关：96孔板效率最高，聚苯乙烯廉价、质优通用性：应用广泛安全性：材料无毒、环保，稳定21载体的性质1.材料：塑

8、料和膜常用的塑料有：聚苯乙烯PS、聚氯乙烯PVC、聚丙酰胺(尼龙)等,PS最常用。常用的膜：玻璃纤维、硝酸纤维、醋酸纤维和混合纤维等，2.性质分为：物理吸附性和化学交联性22载体的选择载体的选择应根据效率、安全性、实用性和通用性四条原则为准，结合具体方法和情况而定。 如：急诊或病人床边、家庭诊断用的快速简易检验应注重实用性。而大医院或大量过筛试验，则应讲求效率。23载体的质量检定以96孔板为例，检定主要包括：表面光洁度及加工的一致性吸附量孔间和板间吸附量变异性24表面光洁度及加工的一致性完好的微孔板载体应是外光洁、平整，无可见气泡、裂缝和杂质等，以空气、水或有色溶液作测定，孔间和板间的吸光度变

9、异质应在允许的范围内。 要求： CV 值2-5%以内25吸附量常以BSA-抗BSA和抗人IgG系统作为研究对象。研究某一载体对其的吸附性。也可用抗原、抗体本身为研究对象26孔间和板间吸附量变异性CV值符合要求不同厂商产品，同一厂商不同批号产品对BSA的吸附量差别很大，选用前应检定，合格的大量购入。27第二节 配 体配体( ligand ) 指以可逆的非共价结合的成对物质之一。如抗原与抗体、酶与底物或辅基、生物素与亲和素、血凝素与碳水化合物或糖蛋白等，它们互为配体。28配体的纯度免疫学测定以配体间的结合反应为基础，配体的质量十分重要。衡量配体质量的主要指标是纯度和活性。最理想的配体是高纯度、活性

10、强的。配体的纯度应以测定需要达到的灵敏度和特异性等为标准纯化方法：DEAE柱层析，亲和层析29配体的活性代表抗原和抗体活性的主要指标是免疫学效价或滴度、特异性以及抗体的亲和力。配体的特异性是保证免疫测定试剂特异性的必要条件，而效价或滴度的高低、亲和力与亲和性的强弱则是决定试剂灵敏度的主要因素。多数蛋白质抗原和抗体的免疫学活性剂纯度可用免疫扩散和免疫电泳法加以检测。30第三节 配体的固相化配体经物理吸附或化学交联的方式与固相载体结合的过程称为配体的固相化（immobilization） 。31一、物理吸附法物理吸附作用力：Van der Waals力、Coulombic forces、疏水作用力

11、等。电解质的性质和浓度、离子强度均影响吸附。包被液（coating solution） 1.pH值：高于其pI 0.2-0.5。pH9.6 碳酸盐缓冲液 2.缓冲液离子强度和性质 3.去垢剂包被与效率：与配体浓度、温度密切相关 低温包被，边缘效应问题配体的预处理：IgG聚合、细菌病毒裂解、超声 处理细胞膜等32二、化学交联法乳胶经共聚反应或化学修饰而具有表面活性基团，故常用化学交联法与配体结合。常用的化学基团：羧基、氨基、酰胺基、羟基、肼基等。优点：配体与载体结合牢固 缺点：配体的活性基团被交联反应消耗，活性降低，成本高。33二、化学交联法方法：戊二醛活化法处理载体表面活化剂改良法处理载体34

12、三、间接包被法抗原间接包被法抗体间接包被法血凝素间接包被法BSA间接包被法亲和素-生物素间接包被法纤维结合蛋白35抗原间接包被法 载体与抗体有较好的吸附性，因此包被有某种抗体的载体可经抗原抗体特异性反应而与抗原结合。36抗体间接包被法 用于对抗体间接包被的结合蛋白有A蛋白或G蛋白、第二抗体、抗IgG Fc段抗体等37血凝素间接包被法 碳水化合物、多糖、糖脂和糖蛋白等抗原与血凝素有亲和作用，因此可借血凝素再与载体结合38BSA间接包被法 对预先包被的BSA作化学改性（活化）处理后，经化学交联反应与配体结合39亲和素-生物素间接包被法 大多数蛋白质与生物素结合后仍能保持原有活性，一个亲和素分子可以

13、结合4分子生物素，效率较高40四、洗涤和封闭洗涤：是把非单层结合的吸附配体和结合于载体的非特异性物质洗掉。洗涤液的制备和洗涤操作是关键技术。封闭（blocking）:是掩盖载体表面未被配体占领的空位或未与配体结合的化学活性基团，以免在测定中与样品发生非特异性结合。常用1%BSA,10%小牛血清41第四节 免疫吸附剂的稳定化免疫吸附剂起有效作用的是暴露的结合配体的单层分子膜，它受微生物污染后可被分解而失活，也可因不断地干燥失水或吸水潮解而进一步变形失活。氧化亦是导致失活的因素之一。 因此，免疫吸附剂在制备后， 应作稳定化处理，以求在较长时期内保持其有效性 和可用性。42一、稳定剂抑菌剂：常用的有

14、NaN3、柳硫汞、抗菌素抗氧化剂：有些配体易被氧化，常加入抗氧化剂如Vit E亲水稳定剂：大多数配体都是亲水性的，如抗体和蛋白类抗原等，保护其亲水结构对维持和发挥固相配体的活性极为重要。与样品水溶液接触时能迅速水合的物质，常作为亲水稳定剂，有BSA、蔗糖等。43二、稳定化处理根据具体情况选择不同的稳定剂，以适浓度溶入有关缓冲液中。在免疫吸附剂制备和封闭、洗涤后，用稳定剂再作一次封闭处理。也可用稳定剂代替封闭液直接封闭。44三、包装处理法合适的包装也是维持稳定性的重要环节。用气密性良好的复合塑料封装，或用置换氮气平衡封装，或真空封装。均可达到维持恒定的内部湿度和卫生环境、防止进一步氧化等作用。4

15、5小结免疫吸附剂固相载体：基本要求、载体性质、载体的选择、载体的质量检定配体：配体的纯度要求、配体的活性配体的固相化：物理吸附法、化学交联法、间接包被法、洗涤和封闭免疫吸附剂的稳定化46 第三章 固相酶免疫测定在医学检验应用最广的标记免疫测定为酶免疫测定，特别是固相酶免疫测定。 近十年来，在适合于医院大量标本集中（centralization）测定，和适合于小型医院及私人诊甚至病人家庭的分散性（decentralization）测定两个方面，在免疫诊断试剂市场都有很大的发展。固相酶免疫测定的主要试剂为免疫吸附剂，酶结合物及酶的底物。47第一节 酶结合物的制备酶与免疫球蛋白、抗原及半抗原等结合体

16、（ binder ） 经化学交联形成的结合物称为酶标记结合物或简称结合物（conjugate）抗原或抗体分子中的 氨基、 羧基、 酰氨基、巯基和羟基等都可被适当的交联剂活化，而与酶分子相结合48半抗原一般需先引人某一化学活性基团后才可与酶分子进行化学交联反应。制备酶结合物的具体方法很多，大致分为一步法、二步法、三步法和保护法四类，前两类较为多用。辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）仍是现今最常用的标记酶。49一、HRP-IgG结合物的制备最常用的制备方法为： 过碘酸盐法 戊二醛法501.过碘酸盐法在新鲜配制的0.3mol/L NaHCO3缓冲液1.0 ml中溶入HRP (RZ3.0)

17、5mg， 加 4080 mmol/L NaIO4 水溶液1.0ml， 室气温轻轻搅拌 30 分钟，混合液由棕色变为黄绿色指示反应正常。经NaIO4活化的HRP加10mmol/L pH9.5磷酸缓冲液1L，4透析，更换透析液3次。在已透析处理的活化 HRP 溶液内加IgG 5mg，室温轻轻搅拌反应3小时后加NaBH4 5mg，置4 318小时。再加0.1 mol/L pH7.4 PBS透析。512.改良过碘酸盐法 抗血清的分离和纯化 DEAE 纤维素 100 g ( DE52，Whatman ) 加 0.0l mol/L，pH8.0 PBS 850ml，加1.0mol/L HCl调节该悬浮液pH

18、至8.0， 静宜30分钟后分掉上消部分细颗粒，如此重复处理 DEAE 3次， 最后沉淀经布氏漏斗过滤后抽干30秒钟。抗血清l0ml加水30ml稀释，加如上处理的DEAE50g，置4 1 小时，期间每隔10 分钟搅拌 1次,经布氏漏斗抽滤，DEAE 用上述PBS洗3次，每次20ml，合并全部滤液，测定蛋白浓度，IgG得率约70%，纯度约96%。IgG洛液用0.lmmo1/L，pH9.5碳酸钠缓冲液稀释至8mg/ml浓度。522.改良过碘酸盐法HRP的活化 HRP用水溶解成4mg/ml浓度溶液，每毫升HRP溶液内加0.1mol/L NaIO4溶液200l，室温搅拌20min。混合液转变成浅黄绿色指

19、示反应正常，加1mmol/L，pH4.4乙酸缓冲液(A液含乙酸钠8.20g/L，B液含乙酸6.0g/L，A液1份与B液2份混合后稀释10倍) ，于44透析过夜。532.改良过碘酸盐法HRP-IgG结合物的制备 在每毫升活化HRP溶液内加0.lmol/L pH9.5碳酸钠缓冲液20l调节pH至99.5，随即与等体积上述纯化的IgG溶液混合，置室温反应，时而摇动之。反应2小时后在反应混合液每2ml内加新鲜配制的4mg/ml硼氢化纳溶液100l，置4 2小时。加0.1mol/L pH7.4硼酸缓冲液（A液：Na2B4O7l0H2O 9.54g溶解于水250mml；B液：硼酸24.7g溶解于水4L。A

20、液115ml加于B液4L内） 4透析过夜。在透析的结合物溶液内加等体积的60%甘油（溶于硼酸缓冲液），必要时可添加BSA至1%浓度，置4保存。如作冷冻干燥处理，可不必加甘油溶液。542.改良过碘酸盐法酶结合物的纯化结合物制备后需要纯化以去除游离的酶或抗体。按改良过碘盐法制备的酶结合物虽不一定要再纯化，但游离酶的存在将使以后测定时信号与本底比 (P/N)减小；游离的IgG可成为反应系统中的竞争性性抑制剂，两者均会引起灵敏度的下降。因此对于测定灵敏度要求较高的试验，还应对酶结合物作进一步分离纯化。利用酶结合物与游离酶或IgG之间的溶解度、电荷和分子量的差别，可采用沉淀法、离子交换层析法和凝胶过滤或

21、透析等方法进行分离和纯化，以凝胶过滤法较为方便。552.改良过碘酸盐法沉淀法去除游离HRP HRP分子量小，即使在高达70%80%饱和度的硫酸铵溶液中仍呈溶解状态，但与IgG的结合物则随IgG沉淀析出。因此，用此法只能分离游离的HRP而不能去除掉游离IgG。沉淀法为：在酶结合物溶液内加等体积饱和硫酸接溶液，混匀后静置1小时，于4 6000rpm离心15分钟，收集沉淀。沉淀物再用半饱和的硫酸铵溶液洗2次，离心方式如前，最后沉淀物用少量 0.l mol/L PH7.2PBS (含NaCl 0.lmol/L)溶解，并用PBS充分透析。562.改良过碘酸盐法Sephadex G200凝胶过滤法 操作参

22、见本节，ALP-IgG结合物的制备所述。经过凝胶分子筛后，可分段收集到游离酶、游离IgG和酶结合物部分。573.戊二醛（GA）法以戊二醛作为同双功能交联剂制备酶结合物分为一步法和二步法两种。一步法除了酶结合物外，还可形成GA与酶、GA与抗体、酶结合物进一步在GA作用下产生聚合反应的不利副产品。所以建议采用二步法制备酶结合物.583.戊二醛（GA）法HRP的活化 HRP10mg溶解于0.lmol/L pH6.8 PB 0.2ml 内，加1%GA 0.15ml，于室温反应18小时，经由0.9% NaCl平衡的 Sephadex G25 柱流窜，或对0.9%NaCl 充分透析除去GA。流出液浓缩至1

23、.0ml。593.戊二醛（GA）法与抗体的结合 免疫球蛋白5mg（或Fab段多肽25mg）溶于0.5mol/L pH9.5碳酸钠缓冲液，加于上述已经凝胶过滤或透析处理的GA活化HRP溶液内(HRP与IgG摩尔比约7:1，与Fab的摩尔比约4:1)，于室温反应2h后，加1mol/L HCl，中和反应混合液至pH7.0，加1mol/L赖氨酸0.1ml，于4反应2h，以封闭其余活化的基团。603.戊二醛（GA）法反应混合液于4对0.15mol/LpH7.2 PBS透析过夜。有时为使HRP活性得以更有效的保护，可使其先与1-氟-2，4-二硝基苯（DNFB）反应，即在上述HRP溶液1.0ml内加1%DN

24、FB无水乙醇溶液0.1ml，在室温反应1h。以后操作同前。61二、ALP-IgG结合物的制备 过碘酸盐法 戊二醛法 621.过碘酸盐法ALP的硫酸铵沉淀悬浮液5ml经0.3mol/L pH8.0碳酸盐缓冲液充分透析去除硫酸铵和稳定剂。在已经透析处理的ALP溶液内加1%DNFB无水乙醇溶液0.lml，于室温反应1小时。加新鲜配制的0.08mol/L NaIO4溶液lm1，于室温搅拌30分钟，加0.16mol/L乙二醇溶液lml，继续反应1小时。此活化的ALP经0.0lmol/L pH9.5碳酸盐缓冲液于4透析24小时，期间至少更换透析液3次。631.过碘酸盐法将IgG 5mg溶解于0.0lmol

25、/L pH9.5碳酸盐缓冲溶液，于4对该溶液透析过夜，加于上述透析处理的活化ALP溶液3ml内，室温反应3小时后加硼氢化钠5mg，搅拌溶解，置43小时，然后对0.15mol/L pH7.2PBS于4透析24小时，离心除去沉淀，上清液经Sephadex G200柱分离纯化。641.过碘酸盐法 酶结合物的纯化：Sephadex G200约17g悬浮于0.15mol/L pH7.2PBS 750ml内，置沸水浴加热5小时以加速溶胀和排除凝胶内气泡，冷却至室温后装入100 * 25 cm柱，在凝胶过滤工作温度下减压抽掉气泡，用体积2倍量的PBS平衡。标记后的酶结合物溶液上样后以与5ml/小时流速和每管

26、2ml量收集流出液和该PBS洗脱液，于403nm波长进行监测，ALP结合物应存在于第一峰洗脱部分内。652.戊二醛法小试管内加运量ALP硫酸钱沉淀物，离心后倒净上清液，称取沉淀物5mg，加含IgG 2mg /ml的上述PBS溶液1.0m1，溶解后装人透析袋内，4对PBS透析过夜，如PBS至1.25ml。662.戊二醛法在透析处理的ALP溶液内加25%(v/v)戊二醛溶液10l，混匀，置室温2小时，反应混合液于4对PBS充分透析，更换透析液5次。再对0.lmol/L pH 7.4Tris-HCl；透析，更换透析液2次。在此透析处理的ALP溶液内最后加含1%BSA和0.02%叠氮纳的Tris-HC

27、i溶液至4.0ml。必要时可参照前述有关方法纯化。672.戊二醛法本法除可得到ALP-IgG结合物外，ALP和IgG也可在GA作用下自聚。用以下方法可避免这种缺点，且反应条件温和，可较好地保持酶和IgG的活性。683.N-琥珀酸胺基-3-(2吡啶基硫代)丙酸酯（SPDP活化法临用时称取SPDP 3mg，加甲醇0.3ml溶解；ALP或HRP用0.2mol/L pH7.5磷酸交联缓冲液（PSCB，每升含NaH2PO44H2O 27.6g和Na2HPO4 28.4g）配制成2.0mg/ml溶液，在lml溶液内加SPDP甲醇溶液100l，于室温下搅拌反应1小时，反应混合液经PSCB平衡的Sephade

28、x G25柱流窜分离掉剩余的SPDP，得到纯化的活化ALP或HRP(A)； 693.N-琥珀酸胺基-3-(2吡啶基硫代)丙酸酯（SPDP活化法IgG的活化：IgG用PSCB配成2.0mg/ml溶液，取1ml加SPDP溶液16l，用上述方法反应和分离得活化的IgG，在活化的IgG内加lmol/L苏糖醇(cithiothrcitol，DTT)溶液至终浓度为50mmol/L，室温反应15分钟后分离纯化如前（B）；A与B混合，室（温搅拌反应58小时，加碘乙酰胺（iodoacetamide）至终浓度为30mmol/L，室温反应15分钟，使未反应的疏基烷基化而被封闭，经Sephadex G25柱或Seph

29、adex G200柱层析分离纯化。703.N-琥珀酸胺基-3-(2吡啶基硫代)丙酸酯（SPDP活化法活化的酶或IgG经透析除去游离的SPDP也是可行的，但时间较长。用DTT还原活化的酶或IgG都是可以的，目的是使某一配体有活泼的巯基，利于两者的交联反应。71制备酶结合物的方法很多，即使同一方法，不同研究者或使用者的具体操作也不尽相同。但任何标记方法的基本要求是：快速、简便、产生的结合物分子结构重演性良好( 酶与被标记物质的克分子比的批间均一性 )、结合物比例高而游离物比例小( 高得率)、结合物仍保持良好的游离酶活性及被标记物的免疫反应性等。72第二节 酶结合物的稳定化高浓度的结合物较为稳定，而

30、工作浓度稀释的结合物的稳定化处理较为困难。酶结合物经冷冻干燥处理后较为稳定，但使用时需复溶，且可引起误差。以下介绍液体酶结合物稳定化处理法。73一、基本要求液态酶结合物的稳定化基本要求是：尽可能在结合物的工作浓度保持其稳定；生物试剂一般在冰箱温度保存，但应能在室温条件下运输；在试剂盒效期内其pH和浊度等也至是过规定指标；活性下降不低于原值的90%。741.底物稳定化法HRP在氢供体为氢受体同时存在时发生有效显色反应，其主要作用在于催化氢供体的分解。在氢供体单独存在时不发生显色反应，但适度的氢供体有一定的保护酶活性的作用。用于稳定HRP的底物有中氨基安替吡啉（AAT）、四甲基联苯胶(TMB)和邻

31、苯二胺（OPD）。分为ATT稳定法和TMB稳定法75AAT稳定法 (举例)山羊癌胚抗原（CEA）抗体(IgG)与HRP结合，溶解于含20%正常山羊血清的0.2mol/L pH6.5 PBS （内含0.5g/L柳硫汞），终浓度0.1mg/L ；再加AAT至0.2g/L，经0.22m孔径滤膜过滤除菌于37下保存7和14天后，其活性分别为100%和77%，未加AAT稳定剂的对照组只分别保留2%和0%76TMB稳定法抗雌三醇（E3）单克隆抗体与HRP的结合物溶解于新鲜配制的含0.2%BSA和0.02%Tween20乙酸纳-柠檬酸缓冲液成为含2mol/L HRP的溶液，加TMB达0.1mg/ml，除菌过

32、滤，作为实验组。置37 0天、1天和16天后，测定其A650nm值作为稳定性指标，以未加TMB稳定剂的作为对照组。两组在各天的A650nm值分别为0.463，0.427，0.413和0.486，0.08和0。77TMB稳定法深入研究发现当TMB和H2O2同时存在并加有环化糊精（cyclodextrin）时可以达到更佳的稳定效果。TMB溶解于二甲亚砜（DMSO）内成为10mg/ml溶液，用含有0.004% H2O2 的0.1%mol/L pH6.0乙酸钠-柠檬酸缓冲液稀释100倍，依此溶液稀释抗E3 IgG-HRP结合物成如上浓度，加环化糊精至0.25%（w/v）浓度，除菌过滤。酶结合物在50稳

33、定保存7天，在室温可稳定一月余。782.亲水物质稳定法亲水的PEG对酶结合物分子蛋白质结构有保护作用，以分子量60008000者较佳。此外早已发现多价阳离子，如Ca2+和Mg2+等与HRP的辅基血红素（hemin）的稳定性相关。792.亲水物质稳定法抗IgG抗体与HRP的结合物溶解于0.1mol/L pH6.0 PBS内成为0.1mg/ml浓度溶液，加丙酸钙至0.1%和PEG 8000至3%浓度，除菌过滤。在37至少可稳定保存1周。80 第三节 底物的稳定化 底物也是EIA试剂盒的重要组份之一。 测定 HRP活性的底物由氢供体和氢受体两种试剂组成。 常用的受氢体为H2O2，易挥发且不稳定。另有

34、两种氢受体虽然不如H2O2应用普遍，但也为某些试剂盒采用。葡萄糖氧化酶（ GO ）和底物耦合系统作为H2O2来源，应为 GO 催化葡萄糖降解，可产生葡萄糖和 H2O2 。 采用有机过氧化物，可与OPD等一起轧成多孔片剂。8182第四章 快速酶免疫测定因相酶免疫测定除通常以微板或小珠作为载体的ELISA外，也多有应用膜载体的。最普通的是斑点ELISA（Dot-ELISA），与ELISA检测方法完全相同。此外利用膜的多孔性、可滤过性及毛细管作用等特性，发展了多种形式的测定，尤其是快速测定，其中己被认可的方法可归纳为浸测式试剂条法、渗滤法和层析法。83第一节 浸测式试剂条法试剂条以滤纸、膜或塑料等制

35、成的棒Stick、浆状(paddle)物等为载体，按其测试操作和用具形状，可把试剂余（strip）反应区或块（pad）插入反应混合液，取出后根据反应块或溶液的显色情况来判断结果，因此称为浸测式试剂条法。 84一、原 理 以hCG试纸条为例抗bhCG 单抗经亲和素-生物素系统结合于滤纸，此试纸条与被测样品及抗a-HCG 酶结合混合反应后，HCG与抗b-hCG-IgG和酶结合物形成双夹心复合物而固定于试纸，洗涤后把试剂条插入酶底物溶液，据该底物是非水溶性的或可溶性的区别，分别观察试纸或溶液的显色强度，既可肉眼观象来判定结果，也可分别用反射式比色计或分光光度计作较精确的比色测定。85二、试剂的制备1

36、. 滤纸的处理2. 生物素化抗hCG IgG的制备 3. Bacp-IgG与固定了亲和素载体的结合4. HCG阴性对照纸片的制备 5. 试纸条的装配 6. 酶结台物的制备 7. 底物的配制 8. 试剂盒的组成和装配 86 1.滤纸的处理 滤纸的活化 亲和素和活化载体的化学交联结合 87滤纸的活化Whatman 541号滤纸浸于蒸馏水中5分钟，取出吸干后浸于约3%溴化氰水溶液内， 搅动下滴加1mol/L NaOH溶液，维持该溶液pH 1010.5 ，如此进行30min。活化的滤纸经0.001mmol/L NaHCO3溶液充分洗涤后，再用蒸馏水洗2次，依次浸人丙酮浓度各为 25，50和 75的溶液

37、内各 5分钟，再用丙酮洗，晾干后置 4oC备用。88亲和素和活化载体的化学交联结合（1）亲和素的活化：溶解亲和素50mg于0.1mol/L HCl 溶液1.5ml，加预冷的0.2mol/L pH9.0硼酸缓冲液 73.5sml。另溶解琥珀酸酐 30ml于无过氧化物的二恶烷（dioxane）0.9ml，加人上述亲和素溶液内。搅拌1时后，把反应混合液装入透析袋，在10%乙酸溶液中透析过液。离心去除沉淀，上清液浓缩、测定蛋白浓度，等量分装后，冷冻干燥备用。 （2）活化亲和素的固相化：用0.1molL pH7.0磷酸缓冲液（PB）溶解活化亲和素成0.10mg/ml，此溶液4ml加PB 40ml稀释。活

38、化的纸片1g浸于此溶液内，室温轻轻搅拌反应1小时后用 0.5mmolL NaHCO3溶液洗 3次，每次浸 10分钟。吸干后再浸于 40ml含 5mmolL 乙醇胺的100mmolL Na2CO3溶液内，室温封闭1小时，洗涤如前。892.生物素化抗hCG IgG的制备 生物素-N-羟基琥珀酰亚胺（BNHS）的制备 生物素-N-e-氨基己酸-N-羟基琥珀酰酯（BacpNHS）的制备 90生物素-N-羟基琥珀酰亚胺（BNHS）的制备生物素0.6g溶解于热的二甲酰胺 （DMF） 10ml， 冷至室温。N-羟基琥珀酰亚胺（NHS） 0.6g溶解于 DMF 2.0ml内，并加交联剂二环已烷碳化二亚胺（DH

39、CD）0.8 g，搅拌下把此溶液加于含生物素的DMF溶液内，室温搅拌反应过夜，过滤除去产生的二环己烷基脲，滤液经适当真空浓缩。在浓缩液内加适量乙酸使合成的BNHS沉淀析出、过滤，沉淀物用乙酸洗2次，再用异丙醇洗一次，约得产物（BNHS）1g。也可用商品 BNHS。91生物素-N-e-氨基己酸-N-羟基琥珀酰酯（Bacp-NHS）的制备（1）生物素-N-e-氨基己酸（BACA）的合成： BNHS 1.0 g溶解于热的 DMF 6.0 ml，冷至室温。e-氨基己酸(6-ACA)0.5g 溶于0.1mol/L NaHCO3溶液6.0ml。搅拌反应 4小时，加适量 1适量HCI溶液酸化，至不再析出沉淀

40、物。分离的沉淀物用该HCl溶液洗涤后悬溶于适量乙酸内，抽干后置于放有NaOH的干燥器内真空干燥，可得产物（BACA）约0.79g。 （2）Bacp-NHS的合成：BACA 0.36 g 溶解于 N-甲基吡咯烷酮7.0ml内，并相继溶入 NHS 0.14g和 DHCD 0.25g，室温搅拌反应过夜，如前过滤掉沉淀物。在滤液中慢慢加乙醚（约50ml）至无淀物析出，过滤收集沉淀，用乙醚充分洗涤后置于具有五氧化二磷（P2O5）的干燥器内真空干燥，约得产物Bcap NHS 0.32g。（3）Bcap NHS与亲和层析纯化抗-hCG lgG结合： lgG 用20rnmolL pH7 .4 PB配制成约1m

41、gml溶液，BNHS或Bcap NHS 250mg溶于DMF20ml内，搅拌下加入1ml IgG溶液内，室温继续搅拌反应6小时。使用BcapNHS和BNHS的区别是前者可使生物系与IgG之间有个6碳长度的手臂，即形成 B-cap-IgG结合物，便于抗体活性的充分发挥。923.Bacp-IgG与固定了亲和素载体的结合Bacp-IgG用0.lmolL pH 7 .4 PBS（内含1 BSA，0.05Tween20）配成0.5mg/ml溶液 l.0ml，再加该 PBS 40ml稀释。在此溶液内浸人固定了亲和素的纸片1g，室温轻轻搅拌反应 2h。在Bacp-IgG与亲和素结合而被固定于载体的同时BSA

42、和 Tween 20起到表面稀释剂和封闭的作用。用含 0.05Tween 20的 0 .1 molL。PH7. 4 PBS 洗涤后吸干水份，放入置有P2O5的干燥器内，干燥后即成免疫吸附剂。成为亲和素-生物素复合物（ABC）系统，具有放大作用的间接包被的一个代表性实例。934.hCG阴性对照纸片的制备用含1%BSA和 0. 05Tween 20的 0. l molL pH 7. 4 PBS封闭纸片 2h，或用 Bcap-BSA代替前抗Bcap IgG，按上法操作后一方法较严密。945.试纸条的装配将有一定硬度的尼龙或其它塑料片裁切成一定规格（例如 6 70mm）的基膜条，如上制成的免疫吸附剂试

43、纸和阴性对照试纸也切成相应规格（如 6 6mm）的小方块，用粘合剂，如Quickfix等把以上两种试纸紧邻贴于基膜条下端。956.酶结合物的制备用抗a-hCG及碱性磷酸酶或半乳糖苷酶，以前述ABC系统或常规过碘酸法等制成结合物均可。酶与hCG克分子比以 5:l为宜。967.底物的配制（参见本章第3节）。 978.试剂盒的组成和装配试剂盒由试纸条、酶结合物、底物、hCG阳性和阴性控制品以及简易定量从加液器如塑料管等组成。98三、测定操作在装有酶结合物的小试管内加人定量（一定滴数或至刻线）的尿液样品，混匀，插入试纸使反应块浸没，室温放置一定时间（5分钟左右）。取出后用自来水冲洗，并用吸水纸吸干。再

44、浸入底物溶液一定时间后取出，肉眼观察结果。试剂块与阴性对照块有任何色差，指示hCG阳性，试剂块显色快而深提示 hCG浓度高。若附有比色板（color reference pad），比较后可作出半定量判断。也可插人简易反射式比色计作较正确的定量测定。99 四、发展前景近年发展了免疫测定多层试剂条（multi-layer strip），即根据某项免疫测定的原理和步骤，将其各步所需的试剂如抗原或抗体、酶结合物、底物等依次分层浇铸于透明塑料基膜，形成极薄的分隔试剂膜层。各层之间为半透膜。只能使一定大小分子的物质通过，可对游离的配体与其结合物等分离。与显色反应层相邻的反光层起到反光和聚光作用，便于观察或

45、测定。表面保护层和样品处理层除可维持试剂稳定性外，还可使红细胞与血清分离，并使定量血清向下渗透和反应。 100四、发展前景此类试剂条的特点是： （1）使复杂的操作合并为只需加样一步操作； （2）可用血浆、血清和微量全血样品；（3）既可肉眼观察和判断结果又可用仪器作精确定量测定。本法也可适用于荧光和化学发光分析。因大分子蛋白抗原和抗体通透性较差，目前主要用于半抗原及小分子量蛋白质测定。但其发展潜力大。柯达和富士公司等以其特有技术优势已开发出多层免疫试剂条系列产品和配套仪器应市。101四、发展前景各种形式的免疫试剂条除早已用于妊娠和排卵测定外，现已用于药物、粮食和食品中黄曲酶素及残留农药、鸦片和吗

46、啡等毒品以及某些环境因素等的现场检测。102第二节 酶免疫渗滤法酶免疫渗滤法（immunofiltration）根据测定方法可分直接过滤法和免疫浓缩法两类，前者用胶乳作为试剂，后者基于亲和层析的原理。美国 Hybritech 公司早在 1985年已生产测定 hCG的试剂盒。103一、酶免疫浓缩法检测模式为双抗体夹心法。因多孔膜可固定较多量抗体，并可对样品分析物起浓缩作用，使反应趋于假一级反应，提高反应速率，缩短测定时间。反应装置结构：试剂盒的重要组分之一。其中具有免疫反应性的膜上已吸附有抗a-hCG -IgG。104二、试剂制备 1. 固定抗 a-hCG IgG膜的制备 2. 抗hCG-IgG

47、-ALP结合物的制备 3. 底物溶液的配制 4. 洗涤液的配制 5. 测定操作105 1. 固定抗 a-hCG IgG膜的制备（1）尼龙膜的活化 尼龙66具有表面酰胺基，活化方法如下：与浓缩杯圆筒相吻合的尼龙圆片（disc）浸于 3.5rnolL HCl溶液约 24h时，取出后浸于蒸馏水中约 5分钟，取出吸干后再浸于水，如此反复洗（约8次）至呈中性后，浸于0.1mol/L pH 9.5 Na2HCO3 溶液约5分钟，再用0.05mol/L pH7.2 PBS洗涤如前，吸于后浸于4碳化二亚胺水溶液或8戊二醛乙酸溶液约1小时，取出后用PBS洗涤如前，吸干后待用。所有操作在室就进行，适当搅拌或翻动以

48、防薄膜相互粘贴而反应不充分。106 1. 固定抗 a-hCG IgG膜的制备 （2）抗a-hCG与膜的化学交联结合 按滴配实验结果，用上述PBS把单抗IgG稀释成最佳包被浓度，在活化膜片中心点加约2m1，形成的0.2cm2的圆点，且室温30分钟，干燥后浸于0.1（w/v）赖氨酸或聚赖氨酸的上述 PBS溶液内，于室温封闭 1h，用 PBS洗涤，干燥后置4保存备用。也可将单抗直接点加在硝酸纤维（NC）膜上，NC对蛋白质的吸附性很强，也可达到同样效果。反应装置的装配 ：在外壳圆筒内填装吸水材料后再装上圆盘；把膜贴于圆盘上；为克服非特异性反应，必要时再复以透明的样品滤膜；旋紧上盖。检定合格后作气密性包

49、装。1072.抗hCG-IgG-ALP结合物的制备参见本章第1节和第4节有关部分。1083.底物溶液的配制磷酸吲哚（indoxylphosphate）18.0mg溶解于乙醇2ml后加pH9.2二乙醇胺缓冲液（DEA）至 100ml。1094.洗涤液的配制pH8. 0 Tris 缓冲盐水，含0.1% Triton X-100及0. lNaN3。1105.测定操作在反应装置内加尿液5滴（250ml ）或至刻线，待流完后加酶结合物试剂3滴，滤过后稍待片刻（3060秒钟 ），以便形成牢固的双夹心物。加洗涤液至刻线， 滤过后加底物溶液3滴，阳性反应在2 分钟内出现肉眼可见的蓝色斑点。111三、内在质控所

50、谓内在质控是指在反应膜上带有指示试剂和反应有效性的质控斑点。对于用小鼠单抗制备的试剂之最简便的质控办法是在膜上点有抗a-hCG抗体的邻近处点加抗鼠抗体。但必须指出这种质控措施对于定性试验是可以的，但用于定量测定尚不够完善。112三、内在质控对定量试验的内在质控总的要求是既要客观反映免疫化学，即抗原-抗体间的反应（包括特异性和非特异性反应），又要真实反映酶促反应的动力学。具体要求是： （1）被固相抗体捕获的抗原量应与被测样品内抗原总量成正比，而与样品浓度无关； （2）酶结合物和分析物-固相抗体间形成复合物的反应以及作为固相内在质控的抗体间的反应都须符合假一级反应动力学， 而且它们的速率常数基本相

51、同； （3）酶底物的转换必须正比于反应时间。符合这3个条件时，与被测物反应相关产生的信号和酶结合物与固相内控抗体间反应产生的信号强度才能建立正比关系。根据这些原则设计的定量试验的内在质控应包括定量阳性质控和阴性质控。113三、内在质控 1. hCG定量阳性质控试剂的制作和设定 2 . hCG阴性控制试剂的制作和设定 3 hCG定量阳性质控点（阳控点）和阴 性质控点（阴控点）的制作 1141.hCG定量阳性质控试剂的 制作和设定用标记抗 hCG lgG同样的 ALP作为免疫原，免疫同种的小鼠，制取抗 ALP单抗。分离和纯化抗 ALP- lgG，用0.1mol/L。pH9.0甘氨酸缓冲液（GBS）

52、稀释至合理致敏浓度，即该浓度IgG致敏胶乳微粒后，与酶结合物和底物反应产生的显色强度与样品中含有25lU hCG/L时反应的显色程度相当，而阴性控制品不产生任何显色反应。在已经调节好浓度的该抗体GBS溶液8.5体积内，加10(w/v) 聚苯乙烯胶乳1.5体积，混匀后搅拌下吸附 2h， 以该 GBS洗 3次后用含 0.05% NaN3的 0.1molL pH 8.6 GBS悬浮最后沉淀物至原反应混合物体积，即成1.5（w/v）抗ALP致敏胶乳试剂。1152 .hCG阴性控制试剂的 制作和设定与 hCG测定系统无关的任何单抗都可使用。1163.hCG定量阳性质控点（阳控点） 和阴性质控点（阴控点）

53、的制作将以上hCG阳性和阴性控制试剂分别点加在固定了抗hCG的膜上的适当位置，共形成三个斑点，加标本反应后，结果有三种解释。117（1）三个斑点均无显色反应，试验无效。其原因可能为：a.操作不当，尤其是漏加样品或某一试剂，或加液量过少；b.排除了前一情况后则为试剂盒质量问题，多为酶结合物或底物失效。（2）三个斑点都显色：阴性控制点较深，指示样品内有非特异性物质或洗涤不充分。118（3）三个斑点虽都显色，但阴控点颜色很浅，且阳控点显色明显深于阴控点，标本反应点亦显色，指示操作正确。此时标本反应可能有以下情况：A.样品反应显色程度等于或深于阳控点，指示其hCG呈阳性反应，含量等于或大于25 lUL

54、 ；B.样品反应显色程度浅于阳控点但深于阴控点，指示 hCG阳性，但其浓度小于 25lUL。C.阴控点无任何显色反应，阳控点有显色反应，被测样品点呈不同程度显色反应，这是理想的反应结果。D.阳控点是显色，其余两个斑点均无显色，指示标本hCG阴性。119近年来文发展了两个测定方和两个质控点的四点法免疫浓缩杯测定法及其配套简易仪器（ICON reader），即由两个测定点的均值经两点校正后可得到更精确的结果。除用于测定hCG外，已形成了测定血清肌酸磷酸激酶同功醇（CK-MB）、药物和淄体激素等快速检验商品试剂。内在质控除可用最简单的圆点表示外，可以作成“十域“一”号，或“I”线状等。反应装置也由最

55、早的小杯形发展成扁平方块和矩形等。因此有各种商品名称，但基本原理相似。120第三节 直接过滤法直接过滤法中用乳胶作为载体，而利用膜来分离结合物和游离物，悬浮状态的乳胶在近于液相状态下与待检物及酶结合物反应。反应混合物经过滤器过滤，反应形成固定的免疫复合物的乳胶因不能通过滤膜而留在滤膜表面。和底物反应后，在膜表面形成可见得显色反应，显色快慢和强度与被测物浓度成正相关性。加拿大 Murex公司等已有单价测定系统 （single use detection system，SUDS）的系列试剂，用于检测抗HIV抗体等。试剂盒主要由滤器和试剂两部份组成，前者结构大致与免疫浓缩法中反应装置相似，但股上无固

56、相配体121 一、试剂的制备1. 抗hCG lgG致敏胶乳的制备 抗hCG多抗或单抗IgG及聚苯乙胶乳 （0 20.8 mm），用0.1mol/LpH8.0 GBS稀释成合约1.0mgml IgG和25% 胶乳固体终浓度的反应混合物，室温搅拌反应 3h时后，以该 GBS洗 4次，最后沉淀物用含 0.1%NaN3的 GBS 悬浮成含约0.5%（w/v）的致敏胶乳试剂。2.酶标记抗 hCG结合物的制备 制备方法见前。3.酶底物溶液制备 同前。4.滤膜处理 为使膜能顺利地游过反应混合物中的游离蛋白质，特别是酶结合物，以免产生非特异性反应，可采用0.45mm的玻璃纤维膜，浸于含0.5%明胶或0.5%明

57、胶或0.51.0 BSA的0.1mol/L pH6. 0PBS内预处理（室温 2小时），洗涤干燥后装配成滤器。122二、测定操作在滤器膜上先加蒸馏水或生理盐水5 滴（250ml），使膜孔润湿和畅通。在小试管或微板孔内加尿液和免疫胶乳试剂各一滴，混合后在室温反应约 2min。再加酶结合物1滴，混匀反应 2min，将混合液全部倒于滤膜上。用水或盐水洗涤后加底物溶液。稍等片刻，肉眼观察或比色测定结果。全部过程约 5 分钟。美国 Abbott 公司对本方法作了改进，把胶乳镶嵌在膜孔中， 利用胶乳的高吸附性能和膜分离的简易性， 提高了检测的敏感度和速度， 其产品称为Testpack 的定性试剂盒和定量测

58、定的 IMX，IDX和AXSTM等系统。 123第二十章 均相酶免疫测定均相免疫测定是指在溶液内进行的抗原抗体反应。是一种不必将游离的与结合的标记物加以分离的免疫测定方法。早在70年代初美国Syva公司便已研究成检测激素的酶扩大免疫测定技术(enzyme multiplied immunoassay techniques ，EMIT )，并制成相应的试剂盒，从而奠定了均相免疫测定的基础，并使酶免疫测定最早得以推广使用。均相酶免疫测定灵敏度低于非均相酶免疫测定，可用发光底物等方法提高其灵敏度，但需用特殊仪器设备。在均相测定中国无分离和洗涤步骤，直接就反应混合液对反应信号及其强度进行测定，操作简便

59、、省时，依然是免疫测定方法租试剂研究开发的热点之一。124除EMIT外，现已发展了底物标记：荧光免疫测定(substrate-labeled f!uorence irnrnunoassay，SLFIA)辅基标记免疫测定( prosthetic group labeled irnmunoassay，PGLIA)抑制剂标记免疫测定(inhibitor labeled immunoassay，ILIA)克隆化酶供体免疫测定(cloned enzyme donor immnunoassay，CEDIA)。125第一节 酶扩大免疫测定技术 (EMIT)一、原理酶标记抗原和被测样品中的抗原与有限量的抗体竞

60、争性结合，酶标记抗原与抗体形成复合物后，酶因空间位阻作用而失活，而游离的酶标记抗原仍具有酶活性，可催化底物反应，产生可测的信号。126EMIT试剂盒有被测物（半抗原或抗原）与酶标记结合物、特异性抗体和酶底物组成。现行EMIT主要适用于测定半抗原。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）、Gal、苹果酸脱氢酶(MDH)和溶菌酶(LYZ)等都可用作EMIT的标记酶，但LYZ作为标记酶时，对尿液样品产生较强的本底反应。127酶结合物与抗体反应后，酶活性被抑制的程度是判断该结合物质量的重要指标。这又与酶的选择及酶与半抗原或抗原合适的克分子比等有关。EMIT已用于数十种分析物的测定，现以甲状腺素测定试剂盒制