细胞培养常见问题

1、细胞培养常见问题（一）如何判断细胞株有支原体污染?细胞培养过程中，最常见的污染是支原体污染，一旦发现有下列情况，应怀疑细胞已被 支原体污染：培养基过早变色（变黄）。细胞生长率明显下降，生长缓慢，破碎细胞多。悬浮细胞特别容易成团。细胞形态发生改变，细胞间隙大。只有频繁改善培养环境，才能继续传代。为了确保实验的严谨性，建议选择支原体检测试剂盒进行支原体污染的检测。支原体污染会对细胞培养有何影响？支原体污染几乎可影响所有细胞的生长参数、代谢及研究的任一数据。故进行实验前， 必须确认细胞为mycoplasma-free，实验结果的数据方有意义。检测出细胞株有支原体污染时，该如何处理？支原体污染细胞后，

2、特别是重要的细胞株，有必要去除支原体。由于支原体没有细胞壁， 故作用于细胞壁生成的抗生素是不敏感的，而且，抗生素对细胞有毒性，容易产生耐药性。 目前，市场上已有支原体去除试剂盒，利用生物物理方法快速杀死支原体，且无毒无耐药， 从而达到永久去除支原体的目的。血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，该如何处理？血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造 成，而血纤维蛋白（形成凝血的蛋白之一）在血清解冻后，也会存在于血清中，亦是造成沉淀 物的原因之一。但这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量。若欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400转/分离心1-2分钟，

3、 上清液即可接着加入培养基内一起过滤。最好不使用过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为 它可能会阻塞过滤膜。在解冻血清时，建议随时将血清摇晃均匀，使温度及成分均一，减少 沉淀的发生。为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀？胎牛血清储存在2 8C时，血清中的各种蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纤维蛋白原、 玻粘连蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这不会影响血清的质量。推荐在一20C 储存胎牛血清，避免反复冻融。如何避免沉淀物的产生？1解冻血清时，按照建议逐步解冻，若解冻时改变的温度太大（如-20C至37C），非常容 易产生沉淀物2解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。3请

4、勿将血清置于37C太久。若在37C放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较 不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。4血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，无须做此步骤。5若必须做血清的热灭活，请遵守40C，20分钟的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高， 时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。血清、培养基及其它添加物和试剂可反复冻融吗？血清、培养基及其它添加物和试剂不可反复冻融，如果冻融次数增多，都会使包含蛋白 的溶液引起一定水平的降解和沉淀，从而影响它的性能。细胞培养中出现黑点是污染吗？如何处理？一旦您在细胞培养的过程中发现有黑点生成，首先，要肉眼观察培养基是否混浊，

5、然后， 在镜下观察培养细胞生长的状态，黑点是否游动。如果，细胞被污染，细菌则会大量繁殖， 培养基就会迅速变黄、变混浊。如果，在镜下观察细胞，生长状态良好，与黑点出现前相比，没有任何变化，那么，黑 点的出现可能与以下几种情况有关：细胞生长过老，破碎的细胞残骸；血清质量不好，反复冻融的结果；配制培养基的PH值偏高，不宜细胞生长；配制培养基的水质、容器不合格。可应用离心、过滤的方法去除这些黑点。细胞培养中如何防止黑点生成？尽可能地减少血清冻融次数。培养基无需37C水浴。培养基保持最佳PH值7.0- 7.2。严格控制配制培养基的水质，容器定期刷洗。掌握细胞传代的最佳时机，细胞切勿生长过老。何谓内毒素？

6、它的作用是什么？内毒素(Endotoxin)是革兰氏阴性菌的细胞壁外壁层上的特有结构。细菌在生活状态 时不释放出来，只有当细菌死亡自溶或粘附在其它细胞时，才表现其毒性，内毒素的主要化 学成分是脂多糖中的类脂A成分。内毒素直接参与细胞凋亡，血清中内毒素含量越低，对细 胞毒性越小，越利于细胞的生长和传代；内毒素含量过高,会直接导致细胞提前老化。因此， 血清应进行内毒素水平的检测，国际上规定，胎牛血清的级别应以内毒素水平的高低来确定， 其中，特级胎牛血清的内毒素应10 UI/ml。L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来 源、参与蛋白质的合成和核酸代谢L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是，确 切的降解率一直没有最终确定。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒 性。12.血清融化推荐方法操作温度100ml500 ml1000 ml第_步室温35min90 min100 min或15-20C水浴5 min18 min20 min第二步20C水浴15 min25 min30 min第三步37