干旱胁迫对小麦的生理生化化指标的影响1

1、干旱胁迫对小麦的生理生化化指标的影响摘 要：研究干旱胁迫对小麦生理生化指标脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)、过氧化 氢(H2O2)、多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、谷胱甘肽(GSH)、可溶性糖(WSS) 的含量的影响。结果表明干旱对这些生理生化指标的含量都有影响，经干旱胁迫 后Pro、MDA、H2O2、PPO、GSH、WSS的含量显著升高，且Pro和PPO的含 量升高的幅度极显著。只有POD的含量经干旱胁迫后呈下降趋势。从总体上看， 经胁迫后的小麦抗逆性强于正常生长的小麦。关键词： 小麦、干旱、Pro、MDA、H2O2、PPO、GSH、WSS、POD植物体生存在自然环境中，由于自

2、然环境是个变数，其水热条件随时都变化， 对植物多少会产生一些影响。凡是对植物产生伤害的环境都被称为逆境，也称胁 迫。干旱也属于逆境，水分在植物的生命活动中占主导地位，大多数植物遭受干 旱逆境后各个生理过程都会受到不同程度的影响。植物的生长主要是叶的生长， 但Hsico等(1987年)指出，叶的扩展生长对缺水最为敏感，轻微的胁迫就会使其受 到明显限制。扩展生长不论是细胞分裂分化或体积扩大，都同时依赖于水的吸收、 溶质的积累和胞壁的松驰。任何能直接或间接影响三者之一的因素均能影响生 长。一当植物受到逆境胁迫时，会采取一定的措施来抵抗不良环境，比如生理生化 指标 Pro、MDA、H2O2、PPO、G

3、SH、WSS、POD 等发生变化。小麦是世界上仅次于玉米的第二大粮食作物，也是我国北方主要的粮食作物 之一。世界上约有70%的小麦播种面积分布在干旱、半干旱农业区。其在生长 过程中，经常会受到干旱的影响，在世界范围内，由于水分所造成的减产，可能 要超过其他因素所导致的产量损失总和。，干旱胁迫下小麦的生理生化特性差异 被认为是小麦抗旱性差异的内在原因。本次实验是研究吸胀12小时萌发一周后， 干旱处理5天的小麦其生理生化指标含量的变化，这可以为抗旱研究作出一点贡 献。1材料和方法1.1供应材料。小麦种子；主要试剂：0.1% HgCl2，TTC，3%磺基水杨酸(SSA)，冰乙酸， 茚三酮，PBS(p

4、H=7.8)，0.6%TBA(用 0. 6% TCA 配制)，PBS (pH=6.8，内含 ImMHA)， 0.1%Ti(SO )用 20%(v/v) H SO 配制，PBS, (pH=5.8,内含 0. 1 mmol/ LEDTA, 42 一、 .、24一、,1%PVP)， POD反应混合液(10 mmol/L愈创木酚，5 mmol/L HO,用PBS溶解)， PPO反应混合液(20 mmol/L邻苯二酚，用PBS溶解)5%三氯乙酸，PBS (pH=7.7)， 4 mM DTNB用0.1M pH=6.8PBS现配)。主要仪器：分光光度仪，离心机，试管， 微量加样器，研钵等。1.2材料处理。经

5、发芽率测定，小麦的发芽率是100%。小麦f用0.1% HgCl2消毒10 min后-用蒸馏水漂洗干净-用蒸馏水于 26C下吸涨12 h f 播于垫有6层湿润滤纸的带盖白磁盘(24cmX16cm)中f 于26C下暗萌发60 h f计算发芽率f选取长势一致的玉米幼苗做干旱、高温、 盐渍或低温下处理(去除较矮或较高的玉米幼苗)。1.3实验方法。1.31 Pro的提取步骤和结果。分别取0.1 g实验组（为干旱处理5天）和对 照组（不做干旱处理）的胚芽鞘置于研钵中，加入3 mL 3%磺基水杨酸（SSA） 和少许石英砂充分研磨，再用2 mL 3% SSA洗研钵，置于离心机中，在5000 rpm 下离心10

6、 min，取上清液，定容至5 mL。测定：取上清液各2 mL，分别加入 2 mL冰乙酸和2 mL茚三酮试剂再煮沸15 min，冷却后，5000 rpm离心10 min， 分别测定A520。AV.520 x V曰x总Pro content =(mmol.g-1FW)，X L X W显竹表一 Pro正常组和实验组A520的Pro content正常（对照组）干旱胁迫（实验组）Pro content9.95( mol.g-1FW)97.69 ( mol.g-1FW)由图表可知，正常组的Pro汉两为9.95 （ mol.g-1FW），而干旱胁迫组的Pro含量为97.69 （ mol.g-1FW），后

7、者是前者的9.8倍。由此可见正常情况下脯氨酸的含量较小，一旦受到干旱胁迫，其含量就会大幅度增加。1.32丙二醛（皿入）提取。分别取0.1 g实验组和对照组（与1.32做相同处理） 置于研钵中，加入3 mL 50mM PBS （pH=7.8）和少许石英砂充分研磨，再用2 mL PBS 洗研钵，置与离心机中，在5000 rpm下离心10 min，取上清液，定容至5 mL。 测定：分别取上清液各2 mL，加入0.6%TBA （用0.6% TCA配制）2 mL，煮沸 12 min，冷却后，5000 rpm离心10 min，分别测定OD450和叫弗。OD450 = Ci X 85. 4OD532 = C

8、i X 7. 4 + 155 000 X C2求解方程得Ci/ （mmol/L） =11.71 OD45QC2/ （ptmol/L） =6.45 005320.56 0045。式中，G为可溶性糖的浓度；G为MDA的浓度。正常（对照组）干旱胁迫（实验组）可溶性糖（WSS）3.36 mmol/L16.80 mmol/L丙二醛（MDA）0.23823umol/L1.04755umol/L表二 正常组和实验组A、A下的WSS、MDA浓度450&32由图表可知，可溶性糖和丙二醛的浓度都是实验组大于对照组，实验组，即受干旱胁迫组的可溶性糖的浓度是正常组的5倍，丙二醛浓度是正常组的4.4倍。可 知，干旱胁迫

9、会使小麦麦芽鞘的可溶性糖和丙二醛的含量增加。1.33 H2O2提取。分别取0.1g实验组和对照组，加入3 mL 50 mM PBS （pH=6.8, 内含1mM HA）和少许石英砂充分研磨，用2 mL PBS洗研钵，5000 rpm离心10 min， 上清液定容至5 mL。测定:分别取上清液各3mL 一加入0.1%Ti（SO ）用20%（v/v） H SO配制1 mL，4 224摇匀一。5000 rpm 离心 10 min，OD。H O content =芒布 乂 V显 乂 v总（日moLg-1FW）22gX L X WV ra表三 正常组和实验组OD下的HO浓度正常（对照组）干旱胁迫（实验组

10、）H O content38.81(mol.g-iFW)139.29(mol.g-1FW)由以上图表数据可得，干旱胁迫可使小麦胚芽鞘的H2O2含量升高，干旱组是正常 组的3.5倍。2 21.34抗氧化酶的提取。分别取0.1 g实验组和对照组（同1.32做相同处理） 置于研钵中，加入3 mL 50 mM PBS （pH=6.8内含1mM HA）和少许石英砂，充分 研磨，再用2 mL PBS洗研钵，置于离心机中，在5000 rpm下离心10 min，取 上清液，定容至5 mL。测定：POD测定；取POD反应混合液（10 mmol/L愈创 木酚，5 mmol/L HO,用PBS溶解）3.00 ml，

11、加入酶液（提取液）100 ml （空白 调零用PBS取代）：立即记时，摇匀，读出反应3 min时的A470。PPO测定：取 PPO反应混合液（20 mmol/L邻苯二酚，用PBS溶解）2.8 ml；0加入酶液（提取 液）0.2 ml （空白调零用PBS取代），立即记时，摇匀，读出反应2 min时的七。(pmol.gTFWmin-1)POD activities =、xV闩 x V、TxWXt显PPO activities =人410X V、0.01xWxt V用(U.g-1FW)正常（对照组）干旱胁迫（实验组）POD(gmol.g-1 FWmin-1)24.2714.21PPO (U.g-1F

12、W)1501950上表中，过氧化物酶(POD)的含量正常组的是24.27(口mol.g-iFWmin-i)，而实验组的 是14.21(口mol.gTFWminT)，后者是前者的0.59倍，是所有测的数据中唯一正常组大于实验 组的。多酚氧化酶(PPO)的含量正常组的是150 (U.g-iFW)，而实验组的是 1950(U.g-iFW)，后者是前者的13倍，可知干旱胁迫会使小麦胚芽鞘的多酚氧化酶含量剧 增。A412。GSH content =1.35 GSH的提取。分别取0.1 g实验组和对照组的胚芽鞘(同1.32做相同处 理)置于研钵中，加入3mL 5%三氯乙酸(TCA)和少许石英砂，充分研磨，

13、用2 mL 5% TCA洗研钵置于离心机中，在5000 rpm下离心10 min，取上清液定容至 5 mL。测定：上清液各1 mL，分别加入1 mL0.1M PBS (pH=7.7)和0.5 mL 4 mM DTNB用0.1M pH6.8PBS现配，空白用此PBS代替)，25 C5 min，分别测定”mol.g-1FW)412 x V x 总TxTxW显 V用正常(对照组)干旱胁迫(实验组)GSH content1.22(pmol.g-1FW)3.86“mol.g-1FW)由图表可知，实验组GSH3.86(mol.g-1 FW)是正常组1.22(mol.g-1 FW)的3.16倍，干旱胁迫会使

14、胚芽鞘积累谷胱甘肽(GSH)。2讨论本次试验我们的结果是，干旱胁迫小麦胚芽鞘中的脯氨酸(Pro)含量比正常小 麦的多几倍，即干旱下小麦积累了脯氨酸(Pro)。已有很多试验证明了，干旱胁迫 会使脯氨酸含量增加。脯氨酸(Pro)是水溶性最大的氨基酸，具有很强的水合 能力，其水溶液具有很高的水势。脯氨酸的疏水端可和蛋白质结合，亲水端可与 水分子结合，蛋白质可借助脯氨酸束缚更多的水，从而防止渗透胁迫条件下蛋白 质的脱水变性。因此脯氨酸在植物的渗透调节中起重要作用，而且即使在含水量 很低的细胞内，脯氨酸溶液仍能提供足够的自由水，以维持正常的生命活动。正 常情况下，植物体内脯氨酸含量并不高，但遭受干旱等胁

15、迫时体内的脯氨酸含量 明显增加。已有人证明了 Pr o的分解代谢开始于它的氧化分解，执行此功能的酶 称为Pro脱氢酶(PDH)，它以FAD为辅因子将Pr。降解为P5C，后者在P5C还原酶(P5CR) 的作用下又重新合成谷氨酸，完成Pro代谢的循环过程。所以，在Pr。的降解过程 中，PDH是Pr。降解的关键酶。在逆境胁迫过程中，PDH的活性往往受到不同程度 的限制，从而削弱了 Pr。的降解过程，因此越来越多的脯氨酸被积累。两种抗氧化酶，多酚氧化酶和过氧化物酶在干旱胁迫中表现出不同的变化情 况，多酚氧化酶的含量较正常组呈上升趋势，而过氧化物酶则呈下降趋势。过氧 化物酶体的标志酶是过氧化氢酶，它的作

16、用主要是将过氧化氢水解。过氧化氢（H2O2）是氧化 酶催化的氧化还原反应中产生的细胞毒性物质，氧化酶和过氧化氢酶都存在于过氧化物酶 体中，从而对细胞起保护作用。干旱锻炼提高小麦幼苗抗旱性的抗氧化机理研究中已 经指出，连续干旱锻炼的小麦幼苗体内的POD活性下降，羟自由基清除能力及总抗氧化力 降低,总体上表现为抗氧化系统受到抑制。高等植物组织发生褐变主要是PPO作用的结果， PPO催化多酚氧化为醍，醍聚合并与细胞内蛋白质的氨基酸反应，结果产生黑色素沉淀。 PPO在植物中以潜伏PPO形式存在，与叶绿体膜紧密结合潜伏形式的通常在成熟、衰老 或胁迫条件下，由于膜受伤害而活化，并导致PPO活性增加。所以综

17、上所述逆境胁迫下多 酚氧化酶的含量增加，而过氧化物酶则减少。干旱，小麦胚芽鞘中的可溶性糖（WSS）和脯氨酸（MDA）的含量都增加。同样， 在几种环境胁迫对小麦生理生化影响一文中已经研究发现，干旱胁迫会使小 麦中WSS和MDA含量增加。植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂 过氧化作用，丙二醛（MDA）是膜脂过氧化的最终分解产物，从膜上产生的位 置释放出后，与蛋白质、核酸起反应修饰其特征；使纤维素分子间的桥键松驰， 或抑制蛋白质的合成。MDA的积累可能对膜和细胞造成一定的伤害，其含量的 多少代表膜损害程度。本次试验研究数据说明，干旱使小麦细胞膜系统受到一定 的损害。H2O2在本次试验中的结

18、果是，干旱组的含量更高些。过氧化氢酶大量分布 于动植物细胞内，属于活性氧清除剂，对H2O2和羟自由基有清除能力，是一种 细胞保护酶。大部分研究干旱胁迫对植物幼苗保护酶活性影响已经证明，在干旱 胁迫中植物体中的过氧化氢酶活性前期升高，但到后期呈下降趋势。这间接证明 干旱会是植物体积累过氧化氢。HO过氧化氢是植物代谢中产生的一种产物，其 2 2积累对细胞具有氧化破坏作用，在实验中，可根据其值的变化，来了解组织的破 坏程度。因此，过氧化氢的含量也是植物逆境的一项指标。GSH的N端肽链由谷氨酸的Y羧基和半胱氨酸的氨基构成，这种特殊结构使得它在细 胞内稳定。（徐大勇等，2001），只能被某些特定的存在于

19、质膜外侧的Y -GTP清除。（Xiang 等2001），GSH在细胞中分布并不均匀，如植物细胞30%分布于细胞质（May等，1998）， Bloch等研究了 GSH得生物合成，并证实了细胞内的GSH是由Y谷氨酸合成酶与GSH合 成酶在ATP存在下催化L-谷氨酸、L-精氨酸和甘氨酸的反应合成的。GSH作为生物体内最 主要的非蛋白巯基和含量最丰富的低分子量多肽，在植物抗逆中直接参与许多多功能活动， 例如（1）参与细胞内许多化合物、药物及激素代谢；（2）通过“Y谷氨酸循环”储存和运 输半胱氨酸，是半胱氨酸的储存库；（3）参与DNA、RNA和蛋白质等大分子的生物合成； （4）氧化还原的缓冲池；（5）是硫还原和运输形式之一，维持细胞内硫醇和二氧化硫的平 衡；（6）对内外源性毒物的解毒作用；（7）与其相关酶共同保护细胞质内的蛋白质、脂质等 结构成分不被氧化，清除自由基，在抗氧化胁迫中起重要作用；（8）可能是逆境条件下的信 号物质之一。例如当细胞内生成少量H2O2时，GSH在谷胱甘肽过氧化物酶的作用