病理学研究中常用的分子生物学基本技术及其应用

1、病理学研究中常用(chn yn)的分子生物学基本技术及其应用病理(bngl)教研室 王娅兰共八十三页分子病理学基本概念 现代分子生物学 vs 传统病理学 疾病发生过程中 分子事件及其与疾病发生的关系(gun x) 揭示 根本机制共八十三页复习有关的分子生物学概念(1)核酸的结构与功能 核酸 -多核苷酸。 核酸由核苷酸组成 核苷酸由碱基、核糖/ 脱氧核糖和磷酸构成碱基有五种： A 腺嘌呤 T 胸腺嘧啶(m dn) U 尿嘧啶 G 鸟嘌呤 C 胞嘧啶核苷酸连接方式核酸-DNA （脱氧核糖核酸）和RNA（核 糖核酸）共八十三页DNA和RNA的差别从结构上看DNA ：含脱氧核糖及胸腺嘧啶 ACGTRN

2、A： 含核糖及尿嘧啶 ACGU从功能上看DNA ：构成染色体内的基因组、细胞器基因 组，是遗传信息的贮存和 携带者 RNA： 包括mRNA(信使RNA), rRNA(核糖体 RNA), tRNA(转移RNA) ，分别进行 转录(zhun l)、转译的功能共八十三页DNA 结构一级结构 即DNA 分子中脱氧核苷酸的排列顺 序碱基顺序就代表了核苷酸顺序。 又称为核苷酸序列或碱基序列二级结构 即DNA分子的双螺旋结构这种双螺旋结构的一个重要特征是：在一定条件(tiojin)下，双链可解开，亦可重新形成双链三级结构 DNA超螺旋结构 共八十三页共八十三页DNA 复制 双链解链 各自为模板合成新的互 补

3、链 DNA 转录 以DNA为模板合成RNA过程 DNA 翻译 蛋白质合成的同义词以遗传密码 破读(p d)的手段转变为蛋白质的氨基 酸排列顺序共八十三页如 GGC 甘氨酸 GTC 颉氨酸遗传信息贮存于DNA，在核内通过转录成mRNA，在胞浆内mRNA作直接模板来指导翻译(2) 基因 (gene)基因表达是指基因的转录翻译以及它们的调控转录在胞核内进行，翻译在胞浆中进行(3) 染色质 (chromatin)主要成分是DNA 和 蛋白质， 细胞间期,光镜下呈细颗 粒状 染色体 （chromatosome） 主要成分同上， 细胞分裂期，由染色质浓集而成，呈杆状,有恒定(hngdng)数目共八十三页

4、同一物质在不同时期的形态变化 (4) 蛋白质一级结构 多肽链氨基酸排列顺序(shnx) 序列改变 构型改变 功能改变二级结构 局部/某一段肽链空间位置 三级结构 (三维结构）整条肽链空间位置四级结构 多条肽链位置共八十三页真核生物基因组单复制顺序（single copy sequence）在整 个DNA分子中只出现一次或少数几次中等重复(chngf)顺序 (moderatelyrepetitivesequences) 在DNA分子中重复出现几十到几千次高重复顺序(highly tepetitive sequence) 在DNA分子中重复几百万次反转重复顺序(inverted repetitiv

5、e sequerce) 其特点是一段碱基呈回文结构 回文结构（palindromic structure） 又称发夹结构(hairpin structure)共八十三页如： 5 AAGCTAGCTT3 3 TTCGATCGAA5 其中一条(y tio)单链回折又可形成双链 3 T T C G A 5A A G C T共八十三页内含子与外显子内含子（intron）或插入顺序(shnx)外显子（exon）DNA变性 定义 变性后性质 变性条件DNA复性（renaturation） 退火共八十三页影响复性(f xn)因素 简单分子快于复杂分子 小分子快于大分子 DNA浓度高快于浓度低 离子强度高（盐

6、浓度高）快于离子强度低cDNA mRNA的互补拷贝cDNA缺乏该基因的内含子，但含有为产生功能蛋白质所需的全部编码信息 寡核苷酸共八十三页一.病理学研究中常用(chn yn)的分子生物学基本技术(一)核酸分子杂交（nucleic acid molecular hybridisation）技术 概念具有一定同源性的核酸单链 一定条件下碱基互补退火形成双链 用带有标记的具有特殊碱基序列（已知碱 基序列）的一段DNA或RNA单链片段 来检测靶核酸（待测核酸）中是否存在与之 同源的序列 已知的核酸序列即探针（probe） 探针标记共八十三页1.固相杂交 (solid-phase hybridizati

7、on)概念 固体支持物有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、乳 酸颗粒、磁珠和微孔板等基本方法： 在此以膜相为例 (1) DNA 变性(binxng)：使DNA由双链解链成为单链。 是成功的关键(2)变性DNA在硝酸纤维素膜上的固定(3)预杂交(4)杂交(5)洗膜(6)结果显示共八十三页A.放射性测定 放射自显影法 液闪记数法B.非放射性检测法 AP 显色系统， NBT（四 氮唑蓝）显色分类(fn li)(1)菌落原位杂交（colony in situ hybridization） 菌落转到膜上 将滤膜上的菌落裂解以释出DNA(2)斑点杂交（Dot blot） 最简单有效的膜杂交方法 核酸原液或纯化的标本

8、直接点到膜上共八十三页斑点杂交应用于 DNA斑点杂交 RNA斑点杂交对于培养细胞，不必提取和纯化RNA，只需简单处理(0.5%Nonidet P40 低渗缓冲液) 完整细胞斑点杂交 NaOH 处理，使DNA 暴露 可用于筛选大量(dling)标本，但它不适用于非放射性 标记探针 (DNA纯度不够) 共八十三页斑点杂交的特点(tdin)优点 A 操作简便、快速，事先不用限制性内 切酶消化或凝胶电泳分离核酸样品 B 可在同一张膜上进行多个样品的检测 C 可作半定量分析 缺点 A 不能鉴定所测基因的相对分子量 B 特异性较差，有一定比例的假阳性(3)印迹杂交（blotting hybridizati

9、on)southern 印迹杂交 （southern blotting hybridization）共八十三页1975 年由 Southern 创建多用限制性内切酶将DNA切成片段进行凝胶电泳分离（分开）,凝胶上使DNA 变性原位将单链DNA片段转移固相支持物上 再与相应的已标记(bioj)的探针进行杂交反应 用放射性自显影或酶反应显色，确定探针互补的每一条DNA 带的位置可用于 DNA 图谱分析 基因克隆鉴定（克隆基因的酶切图谱分析） 基因构成研究（基因组的定性及定量 分析、基因突变分析及限制性长度多 态性分析（RFLP）等。），共八十三页共八十三页northern 印迹杂交（Norther

10、n blotting hybridization ）其被测样品是RNA方法(fngf)与southern 印迹杂交类似 此法常用于基因表达的研究，可推算出癌基因的表达程度(4)原位杂交（in situ hybridization ）核酸原位杂交（nucleic acid hybridization in situ ）的简称已知碱基顺序并带有标记的核酸作为探针与细胞组织切片中待测的核酸 特异性结合 成杂交体应用与标记物相应的检测系统在被检测的核酸原位检测杂交信号共八十三页首创 放射性标记(1969) 荧光素标记 (1981) 生物素标记 (1983) 其与菌落原位杂交不同原位杂交可以确定探针的互

11、补(h b)序列在细胞内的空间位置共八十三页用途 检测特定DNA 序列在细胞核或染色体上 的特定位置分布 检测细胞内RNA 在细胞中和组织(zzh)中的 分布及特定基因表达水平； 检测 细胞、组织中有无特异性病原菌、病毒 优点：A 特异性高，可精确定位,对于组织中 含量极低的靶序列有极高的敏感性 B 能在成分复杂的组织中进行单一细 胞的研究而不受同一组织中其它成 分的影响 共八十三页C 不需要从组织中提取核酸 D 可完整的保持组织与细胞的形态，准确反 映其与组织细胞的相互关系原位杂交与免疫组化方法结合(jih) 免疫组化 检测抗原成分，在翻译水平上研究基因表达 原位杂交 检测DNA/RNA，进

12、行基因定位，在基因扩增或在转录水平上研究基因表达共八十三页原位杂交的探针(tn zhn) 单链DNA 双链DNA RNA 探针基本方法 (RNA 杂交为例) A.杂交前准备 固定 尽快予以冷冻/固定 培养细胞、新鲜组织、石蜡包埋组织均可进行原位杂交通常石蜡包埋信号低于冰冻切片共八十三页玻片处理增强组织通透性和探针(tn zhn)穿透性 稀释的酸去垢剂（detergent）或清洗剂Triton X 100 某些消化酶 应掌握其用量及孵育时间 减低背景染色 充分洗涤 预杂交 杂交后低浓度RNA酶处理防止RNA酶污染 B.杂交共八十三页C.杂交后处理D.显示 如 AP 显色系统 NBT（四氮唑蓝）显

13、色等有两种方法: 直接法 直接标记探针 间接(jin ji)法 抗原标记探针, 杂交后,再用特异性 标记的抗体反应, 在呈色共八十三页共八十三页共八十三页共八十三页双重原位杂交方法 通常有两种方法 A . 用相邻的连续切片(qi pin)（3 ），用两种不同的探针进行原位杂交 适用于较大细胞的研究共八十三页优点 二者杂交过程和结果互不干扰 显示方法和呈色可用同一检测系统，敏 感性相同，可比性强 缺点 杂交信号可能因切片较薄而减弱 寻找同一细胞的切面进行分析有一定(ydng)困难B. 用两种探针在同一标本上作原位杂交，两种不同标 记探针的杂交阳性信号呈色不同共八十三页(5) 荧光原位杂交（flu

14、orescence in situ hybridization , FISH）技术基本原理 生物素、地高辛或荧光素标记 特异的DNA探针 对外周血、肿瘤细胞或癌前组织的离散培养(piyng) 细胞的染色体铺片或切片（包括石蜡切片） DNA-DNA原位杂交 荧光素标记抗探针标记物的抗体 其杂交定位信号用荧光法显示。共八十三页可用多种荧光素的不同颜色显示多个染色体的结构或DNA。 如 FITC (fluorescien isothiocy-anate , 异硫氰 酸荧光素) 呈黄绿色 Texas 红 呈红色特点 操作简易，快捷,探针标记后稳定 方法(fngf)敏感 在同一标本上可以同时检测几个不同

15、的基因 不仅可以在染色体分裂相上观察结果，而且可以应用 于培养的间期细胞，组织的石蜡切片、冰冻切片共八十三页共八十三页应用 临床应用 应用非常广泛 研究应用 肿瘤中染色体异常 基因图谱绘制 确定基因在染色体上的顺序(6)其它(qt)杂交方法 A. 差异杂交（differential hybridization ） B. cDNA微点阵杂交（cDNA microarray hybridization ） C. 寡核苷酸微点阵杂交 （oligonucleotide microarray hybridization ） 共八十三页2. 液相杂交 （solution hybridization ）所参

16、加反应的两条核酸链都游离在溶液(rngy)中(1)吸附杂交方法HAP（羟基磷灰石）吸附杂交方法(DNA:DNA)亲和吸附杂交方法 (DNA:RNA) 生物素标记DNA探针 酰化亲和素包被固相支持物 用特异性抗DNA-RNA杂交物的酶标单克隆抗 体与固相支持物上的杂交物反应 酶显色共八十三页磁珠吸附杂交方法 吖啶翁酯（acridinium ester ）标记探针 吸附在磁化的有孔小珠 (2)发光(f un)液相方法能量传递法 两个紧接的探针，一个探针的一端用化学发光基团（供体）标记，另一个探针的一端用荧光物质标记，并且这两个探针靠得很近。由于只有在两个探针分子靠得很近时，才能产生发光具有较好的特

17、异性共八十三页 吖啶翁酯标记法 检测杂交探针的化学发光 此法敏感度低 仅适用于检测扩增的靶序列(3) 液相夹心杂交方法亲和杂交方法 两个(lin )探针与靶核酸杂交，形成夹心结构。 杂交物上的吸附探针可结合到固相支持物上 杂交物上的检测探针可产生检测信号 一般用生物素标记吸附探针，用125I标记检 测探针该试验保持了固相杂交的高度特异性共八十三页共八十三页(二)聚合酶链反应及其相关技术1.聚合酶链反应（polymerase chain reaction , PCR）技术 又称体外基因扩增 利用DNA变性和复性原理在体外进行特定(tdng)的 DNA 片段高效扩增的技术 获得或放大特异基因信号的

18、重要手段基本原理 在模板DNA（待测DNA） 引物（模板两端的已知序列） 四种脱氧核苷酸 (dNTP) DNA聚合酶依赖的酶促合成反应共八十三页扩增的特异性取决于引物与模板DNA 整个步骤分三步 变性 加热 模板DNA 成两条单链 退火 降温 模板DNA 与引物 互补(h b)结合 延伸 DNA聚合酶及镁离子 形成与模板链 互补的新DNA链三步为一个循环 DNA量增加1倍25-30个循环 DNA 可增加10 6-109 倍 共八十三页共八十三页PCR 反应体系组分包括 引物 DNA聚合酶 PCR反应缓冲液 dNTPs （四种核苷酸）实际操作中, 分别有不同的要求和注意事项反应条件应不断优化 如

19、 变性 复性 延伸温度及时间(shjin) 循环参数 镁离子浓度 平台效应 防止污染等共八十三页 PCR模板（待测DNA） 细菌 全血标本或白细胞 新鲜组织 石蜡包埋组织 但各自的制备方法各异 PCR 扩增产物的检测分析(fnx) 凝胶电泳分析 琼脂糖凝胶电泳 (最常用) 聚丙烯酰胺凝胶电泳 单一条带 点杂交方法 将产物直接点到膜上共八十三页共八十三页共八十三页2. PCR 相关技术(jsh) (1)定量PCR 最常用的为竞争性PCR (2)逆转录PCR (RT-PCR) 用来扩增RNA 的方法 由mRNA 逆转录（reverse transcription, RT ）反应产生的cDNA第一条

20、链作PCR的模板 共八十三页(3)竞争逆转录PCR(competitive reverst transcription-polymerase chain reaction, c-RT-PCR)(4)多重PCR ( multiplex PCR) (5)反向PCR (inverse PCR) 对已知DNA 片段(pin dun)两侧未知 序列进行扩增(6)不对称PCR (7)锚定PCR (8)着色互补试验或荧光PCR(9)双温PCR (two-temperature PCR)共八十三页(10)原位PCR（in situ PCR, ISPCR）技术(jsh) 90年Hasse 首次创建 概念 在细胞

21、 (爬片, 甩片, 涂片) 组织切片(冰 冻/ 石蜡) 直接对核酸进行扩增，通过掺入标记基 团直接显色或结合原位杂交进行检测的 方法 共八十三页 既能在组织原位检测单复制的特定DNA/RNA 又能使扩增的特定的DNA/RNA片段在组织切片中 定位 特点(tdin) 1. PCR特异性高敏感性,又有原位杂交样的定位准确性 2. 能检测低于2个拷贝量的细胞内特定的DNA序 列 共八十三页 3. 有助于细胞内特定核酸序列定位与其形态学变化的 结 合分析基本方法 A. 细胞或组织切片上滴加PCR反应(fnyng)液 B. 把载玻片放入热循环仪（原位PCR仪）中进行扩增 C. 进行原位 扩增产物检测 共

22、八十三页共八十三页分类(fn li) A. 直接法原位PCR ( direct in situ PCR) 基本原理 对三磷酸核苷酸或引物进行标记 使扩增产物直接携带标记分子 据标记物性质进行产物的检测 标记物 最常用的有三种 放射性同位素 生物素 地高辛共八十三页特点 操作简便 特异性较差 易出现假阳性 扩增效率低应用注意事项 a. 不能用于切片标本(biobn) b. 不适用于研究内源性基因重排和染色体 易位 B间接原位PCR (indirect in situ ,PCR) 基本原理 同常规PCR,不带任何标记物 再利用原位杂交方法加以检测共八十三页 主要步骤 标本(biobn)固定 保持原

23、有组织细胞的形态结构 渗入 使引物 核苷酸和酶等反应液进入细胞 内 (如用酶进行消化) 原位扩增 通过原位PCR技术（原位 PCR仪） 增加靶核酸序列的数量，以达到可 检测的水平 原位杂交检测 用特异性探针检测产物 特点 步骤虽然较多，但扩增效率高，特异 性较直接法强 共八十三页 在原位PCR中常用的原位杂交标记(bioj)物 非同位素标记物 如 生物素 地高辛等 C原位反转录PCR (in situ reverse transcription ,PCR) 又称为 in situ RT-PCR 结合反转录反应（以mRNA为模板合成cDNA ）和 PCR扩增检测细胞内低复制mRNA的方法 共八十

24、三页基本原理 它由mRNA经逆转录反应产生cDNA链（即在 逆转录酶的催化下，以mRNA 为模板合成 cDNA） 再以cDNA为模板，用PCR对靶序列进行扩增 扩增结束后，再用特异性的探针进行原位杂交 整个反应过程均在固定的组织或细胞(xbo)标本上进行 标本要用DNA酶处理共八十三页 原位PCR的应用 1) 检测内源性基因(jyn) 固有基因的检测 异常或变异基因 2) 外源性基因的检测 感染基因 病毒基因 细菌基因 导入基因原位PCR应用中存在的问题及对策 敏感性 特异性共八十三页 产生假阳性原因(直接法) 错配 核苷酸错误(cuw) 掺入 受损DNA 修复 ; 扩增产物弥散 对策 热启动

25、 减少弥散复杂性定量分析 目前还停留在相对定量或半定量水平(11)免疫聚合酶链反应（immuno polymerase chain reaction, immuno-PCR,简称免疫PCR）技术由Sano等于1992年首建共八十三页基本原理 单克隆抗体进行(jnxng)生物素化 核苷酸（DNA）也生物素化 用亲和素或链霉亲和素将两者连接 构成具有双功能的嵌合分子共八十三页单抗-生物素-中介分子-生物素-DNA (亲和素) 与抗原结合 PCR扩增抗体端可以与抗原结合，特异性地捕获待测抗原，以保证检测结果的特异性，核酸（DNA）端则可用引物对其进行扩增，通过对扩增产物的检测，间接证明抗原的存在。产

26、物可用琼脂糖电泳检测采用不同(b tn)大小标准的DNA进行标记，进行电泳检测，则可同时检出不同的抗原分子。共八十三页(12) 原位免疫PCR（in situ immuno-PCR , IS-PCR）技术 基本原理 中介分子同时 与DNA和抗体分子特异结合 其 一端连接DNA（DNA作为(zuwi)标记物） 另一端连接抗原-抗体复合物 形成一个抗原-抗体-DNA连接物 作为标记物的DNA分子用原位PCR扩增，检 测特异的PCR产物，即可间接地证明抗原的 存在 中介分子 链酶亲和素（SA）- 蛋白A 嵌合体共八十三页(三) 用引物介导的原位标记(bioj)（primed in situ labe

27、lling , PRINS）技术用于细胞或染色体原位检测特异性DNA/RNA基本原理 PCR和FISH技术的结合 dUTP（用荧光素如FITC标记）和dATP dCTP,dGTP 掺入延伸的DNA中，使新合成 的DNA带有荧光素, 用荧光显微镜检测 地高辛标记再用免疫细胞化学显色普通光学显微镜检测共八十三页特点及应用前景 1.快速，简便也适用于组织切片 2.敏感性和特异性较高. 3.具有很高的快速性 4. 地高辛标记， 适用于普通显微镜观察， 避免了标本荧光素标记褪色快的缺点 5. 不需使用DNA或cDNA探针，只需要特异 性引物序列(xli)，合成简便共八十三页(四) 基因重组技术基因重组是

28、基因克隆的关键技术。其基本内容包括 分离纯化或人工合成DNA 制备DNA重组体 转化宿主细胞 筛选表达重组DNA的宿主细胞使其扩增 鉴定目的基因的正确连接及表达主要目的是获得某一基因或DNA片段(pin dun)的大量拷贝共八十三页目的基因的获得 通常所需要的目的基因都是一些(yxi)已有相关基础研究的基因 常用方法 1.PCR扩增目的基因 2.从基因组文库或cDNA文库中获得目的基因 3.人工合成目的基因共八十三页 DNA 体外重组载体 常用的有 质粒载体 最常用的是pBR322 噬菌体（phage）载体 最常用的为DNA及其衍生物 重组DNA 转化宿主细胞 重组体克隆的筛选(shixun)

29、与鉴定 酶切、电泳、杂 交等方法共八十三页(五) 基因转染（gene transfection）技术 将纯化的含有靶基因的质粒DNA 送入细胞(xbo)内，并在 细胞内表达的技术 方法有 磷酸钙介导的转染法 DEAE 葡聚糖介导转染法 脂质体介导转染法 电击基因转染法共八十三页二.肿瘤研究(ynji)中常用的分子生物学技术 (一)基因扩增的检测1.原位杂交 （ISH）2.荧光原位杂交 （FISH）3.Southern blot (DNA 杂交)4.Northern blot (RNA 杂交)5.原位PCR6.RT_PCR共八十三页(二)基因突变的检测突变的几种形式(xngsh)点突变 基因特定

30、位置发生一个核苷酸的改变基因缺失基因易位或重排其他：插入 甲基化 染色体非组蛋白改变等 共八十三页突变的检测方法1.聚合酶链反应-单链构象多态性分析（Single strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products , PCR-SSCP） 长度相同，但碱基序列不同的单链DNA 构象 不同,在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时， 迁移率（泳动率）不同基本方法 作PCR 将产物变性而成为(chngwi)单链 进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 显示结果共八十三页共八十三页 可用同位素/荧光素标记 电泳后用相应方法 检测(标记在PCR时进行) 非同位素标记 电泳后银染显色。特点(tdin) PCR-SSCP能有效的检出单个碱基置换点 突变 对短片段灵敏度高 方法简便，快速，适用于大量样本突变的 筛选，但其不能测定突变的准确位点共八十三页 2.PCR-限制性片段长度多态性（restrection fragment length polymorphisms , RFLP）分析技术 PCR技术扩增出来(ch li)的DNA片段用限制性内切酶消化， 检