药物分析学课件：第二十章 生物制品分析

1、1第二十章 生物制品分析2本章主要内容生物制品的质量要求 鉴别试验生物制品检查内容4123生物制品的分类 生物制品质量控制实例 53生物药物-45生化药物生物制品生物合成药物 生物药物Biopharmaceu-ticals一、概述分类没有严格的界限 中国药典10版 三部 收载的是_?肝素钠、重组人胰岛素、辅酶Q、胃蛋白酶、脯氨酸、山梨醇、青霉素、黄体酮、鱼肝油属于？6动植物及微生物提取、分离的天然生物活性物质及半合成得到生命基本物质及其衍生物等生化药物biochemical drugs 人纤维蛋白原凝血酶、胰蛋白酶肝素、玻璃酸 氨基酸、Pr类酶、辅酶类多糖类脂类核酸类生化药品批准文号一般为“国

2、药准字H”开头，如胰岛素、18种氨基酸注射液等。 7肝素钠、重组人胰岛素、辅酶Q、胃蛋白酶、脯氨酸属于？8生物合成药物 由微生物代谢所产生的药物和必须利用微生物及其酶转化反应共同完成的半合成药物。如: 山梨醇、木糖醇、甘露醇、维生素、甾体激素、 酶与辅酶类药物等。山梨醇、青霉素、黄体酮、鱼肝油属于？9 应用普通的或以基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术获得的微生物、细胞及各种动物和人源的组织和液体等生物材料制备的药品 自动免疫制品 生物制品biological products 其他（血液制品、组织制品等） 免疫血清菌苗、疫苗、类毒素诊断制品生物制品批准文号为“国药准字S”开头，

3、如乙肝疫苗、人血白蛋白等； 1011生物制品的分类 根据生物制品的用途可分为1.预防用生物制品2.治疗用生物制品3.诊断用生物制品生物制品的分类预防类：细菌类疫苗、病毒类疫苗治疗类：抗毒素及免疫血清、血液制品、 细胞因子、DNA重组制品、 单克隆抗体诊断类：体内诊断、体外诊断疫苗类药物细菌类疫苗病毒类疫苗联合疫苗多价疫苗疫苗类药物细菌类疫苗病毒类疫苗联合疫苗多价疫苗疫苗类药物细菌类疫苗病毒类疫苗联合疫苗多价疫苗疫苗类药物细菌类疫苗病毒类疫苗联合疫苗多价疫苗17减毒活疫苗与灭活疫苗的比较减毒活疫苗灭活疫苗优点注射一次即可有效接种后似自然感染，形成完整免疫在一定范围内疫苗病毒可排斥野毒可多种抗原混

4、合制成多价疫苗抗原性稳定经过灭活处理不会污染其它病原可提纯抗原，加入佐剂增加免疫效果缺点抗原不稳定，灭活即失效易污染其它病原一般需注射23次才明显有效一般仅产生体液免疫抗原要求量大，制造工艺较繁琐预防类生物制品抗毒素及抗血清类药物凡用细菌类毒素或毒素免疫马或其他大动物所取得的免疫血清叫抗毒素（或抗毒血清）。凡用细菌或病毒本身免疫马或其他大动物所取得的免疫血清叫抗菌或抗病毒血清。 血液制品 由健康人的血液或经特异免疫的人血浆，经分离、提纯或由重组DNA技术制成的血浆蛋白组分，以及血液细胞有形成分。重组DNA制品重组DNA制品系采用遗传修饰，将所需制品的编码DNA通过一种质粒或病毒载体，引入适宜的

5、微生物或细胞系，DNA经过表达和翻译后成为蛋白质，再经提取和纯化而回收所需制品而得。 重组DNA制品细胞因子类：IFN-1b、EPO 生长因子类：重组人表皮生长因子 激素类：重组人生长激素酶类：重组链激酶疫苗类：重组乙型肝炎疫苗诊断制品：体外诊断、体内诊断22（二）生物制品的特点分子量不是定值。大部分生物制品的活性组分均为大分子的生命物质（如蛋白质、多肽、核酸、多糖类等）。组分相同，但相对分子量不同而产生不同的生理活性，因此常需进行相对分子量的测定。生化法结构确证。由于有效结构或分子量不确定，其结构的确证很难沿用化学药物或结构已知的生化药物所常用的方法，还需要生物化学分析如：氨基酸组成、N末端

6、氨基酸序列、肽图等。23 需检查生物活性 生物制品对热、酸、碱、重金属及pH等变化敏感，各种理化因素的变化易对生物活性产生影响。特别是多肽和蛋白质。除理化分析，还需生物检定，防止蛋白质失活要求安全性检查 物制品组分复杂，有效成分浓度很低，生物大分子杂质含量比较高，生产工艺复杂，易引入特殊杂质和污染物。如重组乙型肝炎疫苗涉及的安全性检查包括：细胞外源因子检查、原液、半成品、成品中有关血清白蛋白残留量、CHO细胞DNA残留量检查、热原检查、过敏试验、异常毒性检查等。24 需做效价测定 对于生物制品有效成分的检测，除应有一般化学方法或理化分析进行有效成分含量测定外，更应根据产品的特异生理效应或专一化

7、反应拟定其专属性的生物效价测定方法，以表征其所含生物活性成分的含量。例：人凝血酶原复合物的效价测定。25三、生物制品的全程质量控制生物制品化学性质与生物学性质都很不稳定，又易受微生物污染，故对生物制品的均一性、有效性、安全性和稳定性等应有严格要求，以生产出具有药理活性高、针对性强、毒性低、副作用小，疗效可靠及营养价值高等特点的安全、高效的生物制品。为此，必须进行原材料、生产过程和最终产品的全程质量控制，以确保产品符合质量标准要求。26生物制品及检定规程草案（1952年）生物制品制造检定规程（1959年）中国生物制品规程（2000年）中华人民共和国药典三部（2005年）中华人民共和国药典三部（2

8、010年）27药典三部各论内容品名定义、组成及用途基本要求制造检定（原液、半成品、成品）保存运输及有效期使用说明（仅预防类含此项）28 生物制品品名定义、组成及用途基本要求制造检定（原液、半成品、成品）保存运输及有效期使用说明（仅预防类含此项）化学药品品名化学结构、分子式性状鉴别检查含量测定29品名定义组成用途基本要求制造30制造检定原液检定半成品检定半成品检定成品检定31成品检定32保存运输及有效期使用说明33 生物制品质量控制重点有效成分的同一性、结构确证有效成分的均一性、纯度检查有害物质及残余杂质等的控制高效、灵敏的生物活性及比活性等实验方法生物制品质量控制重点生物制品质量控制基本方法

9、鉴别试验 杂质检查 安全性检查 含量测定（生物活性或效价）34收录于中国药典和中国生物制品规程二、检验的程序和方法鉴别杂质检查安全性检查含量（效价）测定35第三节 鉴别试验依据生物制品的化学结构、理化性质和生物学特点，利用化学法、物理法及生物学方法进行某些特殊反应，或测定某些专属的理化常数如紫外吸收系数、等电点、电泳迁移率、色谱保留时间和肽图等，判断与确证产品的真伪。（一组实验）36免疫双扩散法 免疫双扩散法 系在琼脂糖凝胶板上按一定距离打数个小孔，在相邻的两孔内分别加入抗原与抗体，若抗原、抗体互相对应，浓度、比例适当，则一定时间后，在抗原与抗体孔之间形成免疫复合物的沉淀线，以此对供试品的特异

10、性进行检查。伤寒Vi多糖疫苗、狂犬病人免疫球蛋白和人血白蛋白3839实验原理1 琼脂糖的疏散网状结构有利于大分子的自由迁移2 合适比例的抗原抗体结合后聚集形成沉淀；3 沉淀的产生阻止抗原抗体复合物的自由运动；4 沉淀带形成一种特异性的半渗透性屏障，阻滞相同抗原抗体复合物，而允许不同的分子通过。沉淀线的特征与位置：1 抗原、抗体的特异性和浓度，2 抗原、抗体分子的大小3 扩散率 当抗原体存在多种成分时，将呈现多条沉淀线以至交叉反应线，因此可用来检查抗原和免疫 血清 的特异性、纯度或浓度比较抗原之间的异同点，因而应用范围较广。免疫双扩散法 40免疫双扩散法 应用：41免疫双扩散法 应用：免疫电泳法

11、 系将供试品通过电泳分离成区带的各抗原，然后与相应的抗体进行双相免疫扩散，当两者比例合适时形成可见的沉淀弧。将沉淀弧与已知标准抗原、抗体生成的沉淀弧的位置和性状进行比较，即可分析供试品中的成分及其性质。人血白蛋白、冻干人免疫球蛋白43免疫电泳法 44免疫电泳法 4546免疫印迹法 系以供试品与特异性抗体结合后，抗体再与酶标抗体特异性结合，通过酶学反应的显色，对供试品的抗原特异性进行检查。重组人促红素注射液（CHO细胞）、注射用重组人干扰素1b 48免疫斑点法：注射用重组人干扰素2a等酶联免疫法：抗毒素和抗血清制品 如冻干乙型脑炎灭活疫苗（Vero细胞）、人用狂犬疫苗（Vero细胞）和重组乙型肝

12、炎疫苗（酿酒酵母）等。50第四节 生物制品检查内容安全性 毒性试验，防腐剂试验，热原质试验和有关安全性的特殊实验等效力检定 浓度测定， 活菌率或病毒滴度测定，动物保护率试验，免疫抗体滴度试验，稳定性试验等 理化检定 安全性检定 效力检定51（一）物理性状 真空度 溶解速率 装量（二）蛋白质含量测定 凯氏定氮法，Lowry法，双缩脲法（三）防腐剂和灭活剂含量测定 苯酚，甲醛，氯仿，汞制剂等（四）纯度检查 电泳， HPLC（五）相对分子量测定（六）其他第四节 生物制品检查内容52（七） 安全检查 对象：菌种，主要原材料，半成品，成品（1）过敏试验 检查异性蛋白 变态反应试验：豚鼠（2）杀菌、灭活和

13、脱毒检查 无菌试验，活毒检查，解毒检查（3）残余毒力和毒性物质检查（4）外源性污染检查 热原检查 家兔法 第四节 生物制品检查内容53第四节 生物制品检查内容（八） 生物制品的效力测定 采用生物学方法测定 利用生物体来测定待检品的生物活性 比较待检品和相应对照品所产生的特定生物反应剂量的差异，来检定待检品的效价。 例： 小鼠惊厥试验鉴别胰岛素 肝素延长血凝鉴别肝素 54效力试验内容：（1）免疫力试验定量免疫定量攻击，变量免疫定量攻击，定量免疫变量攻击，被动保护力测定（2） 活菌疫苗的效力测定（3）抗毒素和类毒素的单位测定，（4）血清学试验 测定抗原水平或抗体活性，采用血清学法，如沉淀试验，凝集

14、试验等第四节 生物制品检查内容（八） 生物制品的效力测定55（九） 杂质检查 可用来判断药品的优劣。由于生物制品来自生物体，生物活性特特异性强，制造与纯化工艺复杂，分子结构常常不确定，有时产品并非单一，极微量杂质可能产生显著的效应，因此，其杂质检查显得尤为重要。主要包括： 一般杂质检查 特殊杂质检查 安全性检查第四节 生物制品检查内容56 一般杂质检查 氯化物、硫酸盐、磷酸盐、铵盐、铁盐、重金属、酸度、溶液的澄清度、溶液的颜色、水份及干燥失重、炽烧残渣第四节 生物制品检查内容（九） 杂质检查57 从原料中带入或生产工艺中或贮藏过程中引入的杂质 根据生物制品的生产工艺特点与产品的稳定性，其特殊杂

15、质分为：生物污染物：微生物污染、宿主细胞蛋白、外源性DNA、培养基成分等产品相关杂质：二聚体和多聚体、脱氨或氧化产物、突变物、裂解产物等工艺添加剂：残余抗生素、蛋白分离剂聚乙二醇、乙醇、佐剂氢氧化铝，产品稳定剂如辛酸钠、肝素，防腐剂苯酚、硫柳汞，细菌与病毒灭活剂甲醛、戊二醛等。第四节 生物制品检查内容（九） 杂质检查58（1）宿主细胞蛋白残留量测定生物制品生产用细胞、工程菌相关的特殊杂质。方法：ELISA第四节 生物制品检查内容（九） 杂质检查59（2）外源性DNA残留量的检查测定方法：第一法 DNA探针杂交法第二法 荧光染色法第四节 生物制品检查内容（九） 杂质检查60（3）残余抗生素的检查

16、如果生物制品在生产过程中使用了抗生素，则不仅要在纯化工艺中除去，而且要在原液检定中增加残余抗生素活性的检测方法。常用方法：抑菌圈测量。结果判定：对照溶液有抑菌圈，阴性对照无抑菌圈，供试品溶液抑菌圈的直径小于对照溶液抑菌圈的第四节 生物制品检查内容（九） 杂质检查61（4）产品相关杂质检查生物制品在生产制造、分离纯化和贮藏保存过程中产生的与产品结构类似的同系物、异构体、突变物、氧化物、聚合体或降解物。常用HPLC法和电泳法。如重组人生长激素中相关蛋白质的测定 总相关蛋白质含量不超过10%。第四节 生物制品检查内容（九） 杂质检查生物制品质量控制实例ChP人血白蛋白质量控制规程ChP乙型脑炎减毒活

17、疫苗质量控制规程 人血白蛋白人血白蛋白由健康人血浆，经低温乙醇蛋白分离法或经批准的其他分离法分离纯化，并经60 10小时加温灭活病毒后制成。人血白蛋白1、原料血浆2、原液（1）双缩脲法测定蛋白质含量（2）电泳法测定蛋白质纯度 （3）pH值（4）残余乙醇含量 人血白蛋白3、半成品检定（1）无菌检查：ChP2010附录 A （2）热原检查：家兔人血白蛋白4、成品检定（1）鉴别试验：免疫双扩散、免疫电泳（2）热稳定试验：570.5（3）化学检定：pH、蛋白质含量（4）无菌检查：ChP2010三部附录A （5）异常毒性检查：ChP2010三部附录F （6）热源检查：ChP2010三部附录D 乙型脑炎减

18、毒活疫苗本品系用乙型脑炎病毒减毒株接种于原代地鼠肾细胞，经培养、收获病毒液，加入适宜稳定剂冻干制成。 乙型脑炎减毒活疫苗一、基本要求： 生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求二、制造1、生产用细胞：原代地鼠肾细胞或连续传代不超过5代的地鼠肾细胞 乙型脑炎减毒活疫苗2、病毒：（1）名称及来源（2）种子批的建立 （3）种子批毒种的检定乙型脑炎减毒活疫苗1）鉴别试验 将病毒做10倍稀释，取适宜稀释度分别与非同源性乙脑异性免疫血清和乙脑阴性血清混合，置37水浴90分钟，接种地鼠肾单层细胞或BHK21细胞进行中和试验，观察57天判定结果。中和指数应大于1000。 乙型脑

19、炎减毒活疫苗2）病毒滴定 将毒种做10倍系列稀释，至少取3个稀释度的病毒液，分别接种BHK21细胞，用蚀斑法进行滴定。冻干种子批病毒滴度应不低于5.7 lg PFU/ml；液体种子批病毒滴度应不低于7.2 lg PFU/ml。乙型脑炎减毒活疫苗3）无菌检查 4）支原体检查 5）病毒外源因子检查 乙型脑炎减毒活疫苗6）E蛋白基因稳定性检查 以E蛋白基因区核苷酸序列测定验证其遗传稳定性。编码E蛋白基因区的8个关键位点氨基酸不能发生改变。与基因库中登录号为D90195的乙型脑炎减毒株SA14-14-2株的E蛋白基因区核苷酸的同源性应不低于99.6%。 乙型脑炎减毒活疫苗7）免疫原性检查 用种子批病毒

20、制备原疫苗，取10-3、10-4、10-5至少3个稀释度，分别免疫体重为1012g小鼠10只，每只皮下注射0.1ml，免疫1次。免疫后14天用P3株乙脑强毒腹腔攻击，每只注射0.3ml，其病毒量应不低于500腹腔滴定的LD50。同时每只小鼠脑内接种稀释液0.03ml，接种后3天内死亡者不计，攻击后14天判定结果。ED50应不高于3.0 lg PFU/ml，攻击对照组小鼠死亡率应不低于80%。 乙型脑炎减毒活疫苗8）猴体神经毒力试验 用冻干主种子批进行猴体神经毒力试验，分别注射10只恒河猴的两侧丘脑各0.5ml、腰部脊髓内0.2ml。对照组用强毒SA14株稀释成102lg PFU/ml和103lg PFU/ml病毒量，以同法接种恒河猴，每个稀释度注射4只恒河猴。试验用恒河猴乙脑抗体应为阴性。 乙型脑炎减毒活疫苗对SA14-14-2减毒组的10只恒河猴观察至少21天，应无任何特异性乙脑发病症状，组织学检查仅表现为注射部位、脑和脊髓有轻微的炎症反应。而对照组SA14株在注射后8天内