碳源、氮源及其他条件对vb c发酵影响的研究

1、摘要摘要本论文研究了碳源 氮源 温度 等因素对维生素 产生菌发酵的影响并进行了补糖 补氨 以及丙酸对发酵影响的研究 其主要研究内容有以下几个方面碳源的筛选实验结果表明碳源 是 发酵的最佳碳源 培养基中起始 浓度对发酵产素的影响实验结果表明 培养基中 的含量对菌体的生长有较大的影响 在不同水平的 加量实验中 随着培养基中起始 浓度的增加 对数生长期的菌体生长速率逐渐下降随着 浓度的增加生物量经过了一个由低到高再到低的变化过程发酵单位也经过了一个类似的过程 但与生物量的变化规律有所不同 同时 当培养基中 起始浓度达到 以上时会对菌体的生物量和发酵单位产生抑制作用发酵过程中补加 对发酵的影响实验结果

2、表明 补加 对发酵单位上升有促进作用 这种促进作用可能有两方面的原因 可能是由于生物量的增加而产生的可能是过程中较低的 浓度解除了其对 合成的代谢反馈抑制从而使发酵单位上升当 浓度维持在 左右时并维持 小时对发酵单位提高最为有利 氮源的筛选通过对氮源进行筛选得出氮源 是 发酵的最佳氮源 发酵过程中补加氨水对发酵的影响实验结果表明 在一定的时期内补加氨水对发酵单位的上升有促进作用 补加时间过长会导致发酵单位的下降对氮源 的成分进行初步分析氮源对的发酵单位有很大影响 不同来源的 对发酵的影响也不一致我们对其造成这种影响的原因进行了初步分析氨基氮变化规律对发酵过程种氨基氮的变化规律进行了研究 表明初

3、始 浓度和接种量的不同对氨基氮的变化有较大的影响I温度及 对 发酵的影响摘要研究了温度及 对菌体生长和 代谢的影响前体添加时间和添加量对 发酵的影响及其它添加物对 发酵的影响丙酸对 发酵的影响丙酸作为 合成中的代谢产物 其产生对菌体的生长和 代谢有不利的影响关键词维生素 碳源氮源补料丙酸IIAbstractAbstractIn this work, we studied the effect of carbon resource, nitrogen resource,temperature, pH and other factors on fermentation and researched

4、 the influence ofsupplemented A, ammonia and propionic acid on VB12 production.1. Screening of carbon resourceThe result showed that carbon resource A was the best for VB12 fermentation.2. The effect of initial concentration of A on fermentationThe results showed that initial concentration of A dras

5、tically influenced thebiomass and biosynthesis of VB12. With the increase of initial concentration of A, thegrowth rate decreased during exponent phase, and the biomass changed from lower tohigher and to lower again. And the same change to the biosynthesis of VB12. Wheninitial concentration of A was

6、 7% or beyond, the biomass and VB12 production wasrepressed.3. The influence of supplemented A on VB12 productionThe experiment results showed that supplemented A could promote VB12production, and the promotion effect may be caused by the increase of biomass or theelimination of feedback inhibition

7、to VB12 biosynthesis. When concentration of A wassustained about 4% and was maintained about 20-30h, fermentation titer wasimproved largely.4. Screening of nitrogen resourceThe results showed that nitrogen resource B was the best for VB12 fermentation.5. The influence of supplemented ammonia on VB12

8、 productionThe result showed that supplemented ammonia was beneficial to improve thebiomass and fermentation titer of VB12. But if the feeding time was beyond 90h andlast the whole period of fermentation, the fermentation titer fell.6. Analysis of the components of nitrogen resource BNitrogen resour

9、ce B from different firm had different effect on VB12fermentation. We analyzed the content of protein and the kinds and the content ofamino acids of B in order to find the cause that led to the difference. But the resultsIIIAbstractdid not tell the difference.7. The change of amino nitrogen vs. time

10、We studied the change of amino nitrogen vs. time. The results showed that initialconcentration of A and inoculums quantity both had influence on the change of aminonitrogen.8. We also researched the influence of temperature and pH on the growth and thechange of A. And the effect of VB12 precursor on

11、 the VB12 fermentation9. Other additional components on the VB12 fermentation was studied too.10. propionic acid on the VB12 fermentationThe results showed that propionic acid had bad effect on VB12 fermentation.Key words vitaminB12, carbon resource, nitrogen resource, fed-batch, propionic acidIV第 1

12、 章 文献综述第 章文献综述所谓维生素 是指动物体内物质代谢所必需的要素 是基于生化功能的各种各样物质的总称 植物一般都有合成维生素的能力 微生物中合成维生素能力随着种属的不同而有较大的差异 可是具有合成能力的微生物并不少 细菌中既有合成维生素能力的菌株 也有为了生长繁殖必须由外界供给维生素的菌株 酵母能合成几乎全部的维生素霉菌有合成大部分维生素的能力超过 种以上的各种维生素不但化学性质完全不同而且在生物合成途径上也看不出它们的联系 到目前为止 大部分维生素的生物合成途径还没有完全研究清楚然而多数已能用化学的方法进行合成利用微生物进行维生素工业生产的优点 是能够比较容易选择性地得到化学合成有困

13、难的物质 或一种有异构体的化合物 至于维生素生产采用化学法还是微生物法则应根据各种具体情况而定微生物能产生大量维生素的例子有用三孢布拉霉（）好食脉孢菌（ sp.）等生产胡萝卜素（原维生素 ）用阿舒假囊酵母（）棉阿舒囊霉（）等生产维生素 用链霉菌诺卡氏菌丙酸菌（Propionibacterium）等生产维生素用濮膜青霉等生产叶酸用特异青霉生产 阿拉伯糖型抗坏血酸（异维生素 ） 用啤酒酵母 青霉等生产麦角甾醇（原维生素 ）等 现时工业规模生产的有维生素 胡萝卜素 麦角甾醇 部分工艺是微生物发酵的有维生素 维生素 概述 年 以和 发现用肝脏抽提物可以治疗人类恶性贫血病 这一发现使他们获得了 年诺贝尔

14、医学奖 年 和 从肝脏提取物中分离出结晶维生素 维生素 又称（氰钴胺素） 族维生素之一 是一种由微生物合成 动物必需的维生素它主要存在于动物性食品如内脏肝肾和猪心等瘦肉鱼牛乳以及蛋黄也存在维生素 植物中不含维生素 放线菌人和动物的肠道菌能合成维生素 动物所需的 主要靠从食物中摄取 或吸收肠道微生物产生的 但是人类只能从食物中获得 因为人体肠道微生物合成的1异维生素 等河北大学理学硕士学位论文 不能被人体吸收由于动物组织中 含量很低没有商业性生产价值化学合成也不可能因为 结构复杂 合成 需要 步反应 第一次大批量获得 是从生产抗菌素如链霉素氯霉素新霉素等发酵液中分离得到的一种副产品其含量约随着对

15、 需求的增加 选育出了 的高产菌株 目前工业化生产 已 全 部 采 用 发 酵 工 艺世 界 上 维 生 素 的 重 要 制 造 商 有意大利 英国的 美国的 公司和法国的 公司等维生素 作为一种人体和动物必需的维生素其独特的功能性及其复杂的结构和产生条件决定了其较为苛刻的生产条件 正是这种不易获得性使其价格非常昂贵多年来人们一直在尝试通过化学合成的途径来降低维生素 的成本但由于其庞大而复杂的结构 虽在近些年已获得成功 但同时使化学家们陷入了新的困境 副产物太多 难以提纯 于是 人们又重新审视维生素 的生产方法再次将重点转向发酵法生产能产生维生素 的菌种较多但由于其作为次级代谢产物 始终在发酵

16、水平没有新的突破 在国内 仅近年才出现了两个生产厂家 但其年产量与庞大的国内需求市场相比微不足道 因此 在国内实现维生素 的低成本化将会有巨大的市场潜力维生素 的结构维生素 是自然界中存在的结构最为复杂的小分子化合物之一 它是含三价钴的多环系化合物 基本结构是钴啉 由四个四氢吡咯环组成 它与卟啉环的区别在于 环和 环之间缺少一个甲川桥 经验式为 其结构式经多次修正 从结构式中可以看出 钴胺酰胺上的核糖 位上连接一个异环基团 二甲基苯并咪唑 该基团上另外一个氮原子又与钴形成配位键 含有其它异环基团的 类似物（用嘌呤或苯并咪唑替代 二甲基苯并咪唑）可由微生物转化或在培养基中添加这些物质产生 与 二

17、甲基苯并咪唑相比其他取代基团取代后形成的 衍生物 在脊推动物体内 生理作用较低 嘌呤碱基取代的 衍生物在人体内无效2第 1 章 文献综述图 维生素 的结构图维生素 的物理和化学性质及其应用维生素 为深红色吸水的针状结晶或结晶粉末 无一定的熔点 于 时变暗 在 分解 无臭无味 溶于水 乙醇和甲醇及酚 不溶于氯仿 丙酮和乙醚 结构性质相当稳定 水溶性为中性 具有左旋光性 在中性溶液中耐热酸碱日光氧化剂和还原剂均能使其破坏维生素 水 稳定性维生素 在中性或微弱酸性溶液中均稳定但在 或 中 完全失效水溶液 时最稳定，钴胺素去掉氰基 换以 脱氧腺嘌呤核苷基 就成为维生素 辅酶 化学名称为 脱氧腺嘌呤核苷

18、钴胺素维生素 是人类及其他一些动物维持生长和生血最重要的一种维生素3它溶液在波长 和 处有最大吸收 分别为 河北大学理学硕士学位论文是造血过程中的生物催化剂 能促进血液中有形物质的成熟 用于治疗恶性贫血和其他巨细胞型贫血 具有趋脂性作用 防止脂肪在肝中的沉积 有机体在受到射线的作用后 能恢复造血功能自然界中的维生素 有五种左右的类似物主要是分子中与 连接的基团不同 分别为 和 它们具有相同的生理活性维生素 以辅酶形式参与各种代谢过程促进甲基的形成和转移 参与某些化合物的异构化作用 维持 基的还原状态 促进 和蛋白质的合成 促进细胞的成熟维持神经组织的正常功能缺乏维生素 时会发生恶性贫血 神经系

19、统的损害等 临床上可用于治疗恶性贫血 肝脏疾病神经炎神经痛等在饲料工业上也可用于促进猪鸡等牲畜的生长维生素 的产生菌维生素 虽然广泛的存在于自然界 但是自然界维生素 唯一来源出于微生物的合成 高等植物和动物组织对此维生素的合成 至今尚未得到令人信服的证实许多微生物在不同的培养基中都能合成维生素 产生维生素 的主要为放线菌和细菌放线菌中链霉菌属的主要有Albidoflavus Antibioticus Aureofaciens Colombiensis Griseus Olivaceus Roseochromogenus 细菌主要包括有 Aerobacter aerogensBacillus m

20、egatherium B.subtilis Clostridium butyricum Cl. Cochhlearium Cl.flabelliferumCl.tetaromorphumum Escherichia coli the Flavobacerium species acetylicum acidificum aqu atilearborescensdevoranL.caseiPropionibacterium freudenreichii 等 另外米根霉的一些种也可合成维生素 维生素 的生物合成及其相关调控基因维生素 生物合成是自然界中最复杂的生物合成之一 约需 步酶促反应通常有两

21、种合成维生素 的路径 一条路径需要氧分子作为环收缩的前提故称好氧路径 另一个路径可以在缺乏氧分子的条件下 利用钴离子进行环收缩称为厌氧路径现已确定了好氧路径的各个中间产物并从反硝化假单胞菌分离出所需酶的编码基因厌氧路径涉及维生素 合成酶的编码基因也已经从鼠伤寒沙门氏菌 巨大芽孢杆菌中分离并测序薛氏丙酸菌4第 1 章 文献综述两条路径的差异除了体现在钴离子插入的时间和对氧分子的需求不同外 在基因上也有区别 反硝化假单胞菌有 个基因 在鼠伤寒沙门氏菌中未发现相应的基因 而鼠伤寒沙门氏菌中的 个基因在反硝化假单胞菌中也没有对应的基因基因编码的是一个单体加氧酶需要 作为辅助因子所以 可作为好氧路径中的

22、一个标志基因 而 可能作为厌氧路径的标志基因 在大多数产钴氨素的厌氧生物中未发现一般来说 好氧路径的基因前缀为 而相应的厌氧路径基因为 其后的字母代表该基因在操纵子中的顺序甘氨酸琥珀酰 CoA-氨基乙酰丙酸尿卟啉原CH3 基卟吩胆汁烷粪甾原Co2+1-氨基-2-丙醇原卟啉Mg2+NH35-脱氨腺苷鈷啉醇酰胺血红素叶绿素5-脱氨腺苷鈷啉醇酰胺GTP5-脱氧腺苷鈷啉醇酰胺鸟苷二磷酸血红蛋白5 6-二甲基苯并咪唑核黄素-核唑-5-P5-脱氨腺苷鈷胺素磷酸5-脱氧腺苷鈷胺素(B12)图 维生素 的合成维生素 B12 好氧与厌氧生物合成路径5河北大学理学硕士学位论文合成前咕啉 和钴前咕啉步骤 由氨基乙酰

23、丙酸，形成胆色素原，在 脱水酶 也称为 合成酶 的催化下 个 分子缩合形成 个 分子 基因编码该酶 生物合成也有 条途径 一种是在 合成酶催化下由琥珀酰辅酶 和甘氨酸缩合生成 另一途径较为复杂 由谷氨酸的完整碳架形成 步骤 合成羟基甲基后胆色素原，由 基因编码的 脱氨酶催化 个 分子脱氨并羧化形成线性的四吡咯步骤 合成尿卟啉原，尿卟啉原 合成酶由 基因编码 催化 生成 的地位十分重要 除维生素 外 它还是生成血红素 叶绿素 等的必要中间产物细菌叶绿素 铁氢卟啉 步骤 在尿卟啉原 的 和 位置甲基化及厌氧路径中的钴螯合尿卟啉原 甲基转移酶是维生素 生物合成的关键酶 催化将 腺苷蛋氨酸 上的 个甲

24、基转移到尿卟啉原 上 第一个甲基转移到 位置形成前咕啉 接着在 位置又进行一次甲基化反应 产生前咕啉 当该酶的底物浓度大于 的时候显示出底物抑制因此 在钴氨素生物合在厌氧生物鼠伤寒沙门氏菌中 尿卟啉原 甲至此 好氧和厌氧路径并没有差别但厌氧路径在形成前咕啉 后 随即发生钴螯合反应 形成钴前咕啉 这样在厌氧路径 钴离子在一个相对较早的阶段插入进来 而好氧路径 钴在一个相对较晚的阶段插入从这以后两个路径开始出现差异鼠伤寒沙门氏菌的 基因编码蛋白由 个氨基酸组成 是一个多功能 可能也起钴螯合酶的作用在该菌中又发现了另一个蛋白6需要 及 个独立的酶参与在反硝化假单胞菌中 该酶由 基因编码成过程中可能起

25、调控作用基转移酶由 基因编码性的酶 该蛋白 端 个氨基酸 具有甲基转移酶活性 而 末端（ ）具有钴螯合酶的作用 等人第 1 章 文献综述从薛氏丙酸菌中分离的尿卟啉原 甲基转移酶基因钴螯合酶编码区 而与反硝化假单胞菌的 基因更相似 故也称为 基因相似 末端的 个氨基酸与 发现于 相似故该钴螯合酶的编码基因称为 步骤 位置甲基化在好氧路径 由 基因编码的前咕啉甲基转移酶在前咕啉 的 位置催化甲基化反应生 成 前 咕 啉 也 称 前 咕 啉 在厌氧路径 该甲基化反应由 催化 将钴前咕啉转化成钴前咕啉 该酶的反应活性要比 至少小 倍合成前咕啉和钴前咕啉环收缩可能两条路径间最大的差异就在于环收缩的机制不

26、同 在好氧路径 需要两步反应和不同的两个酶将前咕啉 转化成前咕啉而在厌氧路径将钴前咕啉 转化成钴前咕啉仅需 个酶步骤 前咕啉 的氧化作用和内酯的形成在好氧路径 催化在前咕啉 的 位结合 发生羧化作用 先生成内酯随后形成前咕啉 羟基内酯 也称为前咕啉或前咕啉 由于厌氧生物不需要 故没有相应的步骤因此 可作为好氧路径的一个标志性基因步骤 位置甲基化及环收缩在好氧路径中由 基因编码的甲基转移酶引入第四个甲基即在前咕啉 的 位发生甲基化作用形成前咕啉该反应依赖 如果缺少用则反应不能进行环收缩由此次甲基化作用所引发 并不需要任何酶的作在厌氧生物鼠伤寒沙门氏菌中 该步反应与好氧路径基本相似 催化在钴前咕啉

27、 位甲基化形成钴前咕啉环收缩也是由此次甲基化而引发在薛氏丙酸菌中由一个整合的基因 催化完成该步反应而在鼠伤寒沙门氏菌中 分别是 个独立的基因合成前咕啉 和前咕啉钴前咕啉 和钴前咕啉7由于不具有 的薛氏丙酸菌的钴螯合酶共含有 个氨基酸 其 末端的 个氨基酸与 河北大学理学硕士学位论文步骤 在 发生甲基化反应合成前咕啉 和钴前咕啉在好氧路径 前咕啉 甲基转移酶 由 基因编码催化在 位发生甲基化反应 产生前咕啉 该反应需要 移酶由 编码-7在厌氧路径 相应的甲基转步骤 在 发生甲基化反应合成前咕啉和钴前咕啉在好氧路径 由 基因编码的前咕啉 甲基转移酶是一个双功能酶 它既催化前咕啉 的脱酰反应也在随后

28、依赖 的 位甲基化反应中起催化作用生成前咕啉在厌氧路径由钴前咕啉 向钴前咕啉 的转化与好氧路径有所差异该过程需要打开内酯环脱醛及 位甲基等三个步骤目前催化这一过程的酶尚未发现令人奇怪的是在好氧生物反硝化假单胞菌中由 负责这一过程 而在鼠伤寒沙门氏菌中却缺少相应的酶 这暗示了在厌氧生物 一定存在一个前面已确定的甲基转移酶 也许是 或 在 位甲基化反应前咕啉钴前咕啉 形成氢巴啉酸钴巴啉酸步骤 还原前咕啉钴前咕啉 产生双氢产物由 基因编码的前咕啉 还原酶催化前咕啉 的还原反应 产生双氢前咕啉也称前咕啉该反应依赖 的存在 在厌氧路径 相应的还原酶是由 基因编码 但其作用机制尚不清楚步骤 位置发生甲基化

29、和脱羧反应形成前咕啉 钴前咕啉这一过程的 个反应由一个多功能的酶前咕啉 合成酶所催化 反应同时进行该酶 基因编码不仅催化 位置上的两次甲基化反应 依赖 而且还在 位的醋酸根脱羧反应中起催化作用 形成前咕啉由于前咕啉 合成酶的氨基末端与其他甲基转移酶具有同源性所以可能羧基末端也具有脱羧酶的活性 在缺少 的情况下 则不发生脱羧反应 这暗示了在脱羧反应以前 该酶就已经结合上 或者至少发生过 次甲基化反应8又发挥一次作用第 1 章 文献综述就目前已知的遗传学数据来看 在大多数厌氧生物中 催化这一反应的酶并不是单个的蛋白 而是分别由 个独立的酶来完成 例如 负责 位的甲基化 负责 位的脱羧反应 步骤 位

30、甲基转移到 位产生氢巴啉酸 钴巴啉酸前咕啉 变旋酶或称 合成酶由 基因编码催化 位的甲编码的酶催化钴前咕啉 甲基重排形成钴巴啉酸在厌氧路径中 由 基因由氢巴啉酸 钴巴啉酸形成钴巴啉酸 二酰胺步骤 合成氢巴啉酸二酰胺，钴巴啉酸二酰胺（），及钴螯合好氧与厌氧路径之间的另一个差异在于钴巴啉酸二酰胺的合成 在厌氧生物中该步骤较为简单 催化钴巴啉酸发生酰胺化作用形成钴巴啉酸二酰 基因编码的 双酰胺合成酶催化产生 二酰胺 接着在钴巴啉酸二酰胺合成酶的作用下 将钴离子螯合到大环上 该酶至少包含 个亚基分别由 基因编码其中 起主要的作用至此好氧和厌氧路径便汇合以后的步骤完全相同步骤 还原钴 巴啉酸二酰胺生成钴

31、 巴啉酸二酰胺 （），催化这一过程的酶及其基因在 条路径中均未发现步骤 钴巴啉酸 二酰胺发生腺苷化反应在钴 巴啉酸 二酰胺腺苷转移酶的催化下形成腺苷钴 巴啉酸，二酰胺 （），该酶在反硝化假单胞菌中在鼠伤寒沙门氏菌中由 基因 不同于前面提到的甲基转移酶 编码在薛氏丙酸菌中由 基因控制步骤 位置的羧基发生酰胺化反应由腺苷钴巴啉酸合成酶作用在 位置的羧基发生腺苷化反应产生腺苷钴巴啉酸见图 底物中需要有腺苷基团在9基向 位迁移 产生 该酶受产物抑制胺 但在好氧路径中 这一过程较为复杂 先在 和谷氨酰胺存在下 由由 基因编码河北大学理学硕士学位论文好氧生物中 由 基因编码该反应所需的酶 在厌氧生物中相应

32、的是 基因步 骤 在 腺 苷 钴 巴 啉 酸 上 连 接 氨 基 丙 醇该反应所需的酶由 个蛋白和组成基丙醇发挥作用生成腺苷咕啉醇酰胺 现已知 和 基因编码蛋白蛋白的编码基因尚未发现在厌氧生物 由 基步 骤 将 腺 苷 咕 啉 醇 酰 胺 转 化 为 腺 苷 咕 啉 醇 酰 胺该过程需两步反应但由一个双功能酶咕啉醇酰胺激酶 基因编码催化前一个反应是依赖 的磷酸化反应后面的反应是 形成 步反应分别形成磷酸腺苷咕啉醇酰胺和腺苷咕啉醇酰胺 既在第二个反应中作底物 又在第一个反应中作为调控因子增加与底物腺苷咕啉醇酰胺的亲和力在鼠伤寒沙门氏菌中相应的酶步骤 将腺苷咕啉醇酰胺转化为腺苷钴氨素 此步骤是形成

33、钴氨素的最后一步即核唑或磷酸核唑取代腺苷咕啉醇酰胺上的 最终生成腺苷钴氨素该反应所需的酶为钴氨素合成酶在好氧路径由 编码 厌氧路径中相对应的酶为 的基因产物反应中所需的磷酸核唑来自二甲基苯并咪唑和烟酸单核苷酸在反硝化假单胞菌中 基因编码的酶催化这一反应 在鼠伤寒沙门氏菌中相应的酶在薛氏丙酸菌的发酵工业生产中 通过添加二甲基苯并咪唑来促进丙酸菌合成维生素 以上即是腺苷钴氨素好氧与厌氧生物合成的完整路径最后用氰化物取代腺苷钴氨素的腺苷基团便转化为维生素 即氰钴氨素关于这 条维生素 生物合成路径的分子水平进化方面 比较容易接受的观点是厌氧途径是更为原始的维生素 生物合成路径两个路径所需的甲基转移酶是

34、高度相似的这不能简单地解释为它们在 亿年前 随着光合作用的10并且依赖 及 氨因编码的酶催化该过程由 基因编码由 基因编码第 1 章 文献综述开始 大气中氧气量随之增加而产生 如果事实是这样的话 那就不能解释厌氧途径如何在已 牢记 含钴底物的酶的作用下 而突然转变成能利用氧分子和一套新的中间产物 这与达尔文通过自然选择和变异的进化论并不相符 相反 这 条途径一定是从一个更早的阶段在光合作用出现之前开始分化的 很可能好氧途径最初进化是作为厌氧途径的一种可替代的方式进行的维生素 生物合成的代谢调控维生素 是微生物次级代谢的产物反馈调节在次级代谢产物的生物合成中有着重要的作用在维生素 的生物合成中

35、对维生素 代谢途径的第一个酶 合成酶有反馈抑制作用 尿卟啉原对 脱水酶存在反馈抑制作用维生素 生物合成中的代谢调控如图 微生物在正常生长条件下可以通过自我调节使机体内的代谢途径互相协调和平衡 但在人为控制下 可对代谢途径进行修饰 改造 使微生物过量产生次级代谢产物 大量提高目的产物的产量随着对维生素 需求量的增加现有生产水平不能满足需求要想大幅度提高维生素 的产量 对基因工程菌的研究势在必行 要培育维生素 生产菌 就要了解其生物合成途径 关键酶的反馈调控机制 考虑解除的方法 从而设计正确的育种方案 应用 重组技术 克隆关键酶的基因并在工程菌中表达从而选育出高产优质易于自动化生产的基因工程菌除了

36、克隆维生素 生物合成的关键酶及其基因外还可对非维生素 合成的重要基因进行调控研究 如我们知道薛氏丙酸菌的特性是在代谢过程中将葡萄糖分解成丙酸及其他产物 而丙酸抑制了菌体的生长 在丙酸产生过程中 甲基丙二酰 变位酶是一个关键酶 该酶由 个亚基组成 分别由 和 基因编码 该酶量的降低可导致丙酸产量的下降基因组测序计划也为深入研究维生素 生物合成的调控及进化提供了可靠的信息资源 维生素 的生物合成给化学家和生物学家提出了一个巨大的挑战目前 已揭示出许多令人感兴趣的生理特性 毫无疑问 还将有更多的奥秘得到阐明11河北大学理学硕士学位论文图 维生素 生物合成途径的代谢调控维生素 的发酵生产抗生素废液中提

37、取早在 年美国 等人就发现 当用加有钴化合物的培养基培养灰色链霉菌时可大大提高维生素 在整个培养液中的浓度但是对于钴化合物的浓度要求要适量 过高的浓度会对菌体细胞产生毒性 另有研究表明 添加适量的氰化合物也同样可促进抗生素废液中 类似物的含量但需严格掌握其用量放线菌发酵自从人们发现可从抗生素废液中提取得到维生素 后许多科学家将目光转向了采用放线菌其中主要是链霉菌属中的灰色链霉菌和橄榄色链霉菌（Streptomyces olivaceus）来发酵生产维生素 由于链霉素的生成而始终未能使得维生素 的产生处于主导地位因此我们应选出链霉素发酵支路的关键酶并将其抑制这样便可大大提高维生素 的得率 使得大

38、量产生维生素 下水道废液中提取采用生物活性污泥法处理的废水中通常含有多的 干的活性污泥可先用水浸提然后过滤掉固形颗粒之后可分离纯化 由此得到的 有如下特点 无需前培养 这样大大减少了前期投入 能耗大 尤其是浓缩这一关键性步骤将造成大的能量损耗 用此法得到的 的浓度虽并不低 但受活性污泥这一来源的影响由此获得的 并不能直接进入食品或药品级产品而丙酸菌发酵12成为可能通常只局限于饲料添加剂第 1 章 文献综述能够产生 的菌株较多如巨大芽孢杆菌 Bacillus megaterium橄榄色链霉菌Streptomyces olivaceus等产量较高的菌株主要来自傅氏丙酸杆菌Propionibacte

39、rium freudenreichii薛氏丙酸杆菌Propionibacteriumshermanii 和脱氮假单胞菌 Pseudomonas denirificans 丙酸菌 例如 Propionibacterium freudenreichii 和 Propionibacterium shermanii常用作 的产生菌 这类细菌常采用厌氧发酵 采用丙酸菌发酵的特点 在于培养基在发酵过程中产生丙酸而使得培养基 下降 从而可避免杂菌的污染因为是厌氧发酵勿需设计供氧系统和搅拌系统可减少设备投入和节约能耗随着发酵过程丙酸钙的产生而丙酸钙通常是用作防霉和防腐添加剂的 从而可进一步减少染菌的可能性 研

40、究表明 可采用如下几种方法来增加 的产量在培养基中添加 左右的 可成倍地增加 的产量 添加增稠剂 可增加 的产量 这是由于一方面细胞悬浮于培养基中没有任何干扰 从而增长细胞的生长速度 更为重要的是通常高浓度的钴化合物对于菌体细胞本身是有害的 而在加入增稠剂后 丙酸菌对钴化合物的耐受性增大 可达 这样 既能避免对菌体的毒害 又可以最大限度地提高 的产量加入前体物质已知的可促进 产生的前体物质有四种（）正丙烯二氨 （）苯并咪唑 （） 二甲基二氨基苯 （） 二甲基苯并咪唑 其中（）和（）可促进真正 的生成 而（）和（）可增加 类似物的含量 当以甘氨酸作为补充氮源时可增加其产量由巨大芽孢杆菌生产 以巨

41、大芽孢杆菌为例 将培养基用氨水调至 发酵液需要连续不停地搅拌和大量通气 温度需控制在 左右 每隔一定时间需用 的氨水来调 同时需定期补充碳氮源以期达到最高产量采用转基因的 发酵生产目前人们对于 的控制基因已经非常清楚因此这就使得将其转入大肠杆菌以期大量生产但该方法真正用于大生产还有待时日即使用于生产也会不可避免地存在这样的问题 如导入的质粒不能稳定地遗传下去 会随发酵条件的变化而脱落以及 产生肠毒素素 的生产仍需按传统发酵来完成-4内毒素等因此就近些年维生13河北大学理学硕士学位论文原生质体融合菌株的生产研究应用现代遗传工程技术 能大大提高 的产量 将 Protaminobacter rube

42、r和 Rhodopsendomonas spheroides 两个菌株进行原生质体融合 得到一株融合菌Rhodopseudomonas protamicus 能利用葡萄糖做碳源 不需要添加 二甲基苯并咪唑 的产量可大达 维生素 的测定方法比色测定法本法是药物样品中维生素 测定的常用方法其原理是样品经浓硫酸和高氯酸钾消化后样液中的钴与 二（吡啶酮）吡啶联腙生成钴的红色化合物可以进行比色测定再从钴的含量换算成维生素 的含量离子交换测定法药物中的维生素 可以从弱酸性阳离子交换树脂中得到 分离洗脱下来例如 桔子酱中的维生素 通过 土为吸咐剂进行层析分离后 在 波长处测定其含量 原子吸收法维生素 的分子

43、中含有钴原子占维生素 的 采用原子吸收分光光度法可以测定其中的钴含量再换算成维生素 含量在测定药品中维生素 时 可以直接将药品的溶液吸入原子分光光度计中测定 但用于测定食品中的维生素 时 先将样品预先处理 样品用提取剂提取 于滤液中加入 用 调节至 再加入 活性炭振摇用无灰滤纸过滤维生素 被吸附在活性炭上将活性炭连同滤纸一起在 下灰化完全用 的硝酸将残渣溶解 然后用原子吸收分光光度法测定钴的含量 本法与微生物法结果一致微生物法微生物法原理同微生物学浊度法试验菌种采用乳酸酐菌（）灵敏度高效液相色谱法（）14第 1 章 文献综述维生素 发酵生产面临的问题及今后的发展方向（）搞好维生素 发酵菌株的选

44、育工作 同时可借助于紫外线诱变 原生质体融合等生物技术工程手段提高单株的产量（）进行高密度培养首先增加生物量 以期提高单位发酵效率（）由于目前关于维生素 的代谢途径和基因表达序列已基本研究清楚 因此 可采用基因工程手段 使该基因片段能在宿主细胞中多次表达 并使其能稳定遗传将会是维生素 发酵的一大革命（）研制新型的诱导剂以进一步提高其产量 （）研制高效专用的生物反应器采用连续流加培养（）采用固定化技术将菌种包埋或吸附于载体上 实现连续化生产（）近 年来 国外开展了大量的利用各种醇类和烃类化合物作为碳源生产 的菌种筛选工作并获得了大量能产生 的菌株 但烃类和高级醇作为碳源发酵收率较低 采用甲醇作为

45、碳源似乎具有较好的前景 例如 筛选到一株甲烷八叠茵甲醇基质浓度为 采用流加工艺发酵 的发酵浓度可达 本研究的目的及意义本实验从实际角度出发与生产紧密联系对影响维生素 发酵的各种因素和操作做了研究 并对厂家提出的一些生产上的问题进行了初步研究 以期为厂家进行生产工艺的改进提供一些参考15河北大学理学硕士学位论文第章碳源对发酵的影响材料菌种薛氏丙酸杆菌主要试剂Propionibacterium shermanii试剂 甲液溶解结晶酚于 中并稀释至在此溶液中加入亚硫酸氢钠 乙液 称取酒石酸钾钠 加到中 再加入 二硝基水杨酸溶液 将甲液与乙液相混合即得黄色试剂贮于棕色瓶中在室温下放置天以后使用 标准液

46、 准确称取分析纯的 预先在量蒸馏水溶解后定容至实验器材培养箱（日本公司）UV 2000型紫外分光光度计日本HITACHI公司培养基干燥至恒重用少穿刺培养基母瓶培养基发酵培养基略略略以上培养基的灭菌条件均为研究方法正交实验原理正交试验法也叫正交试验设计法 它是用“正交表”来安排和分析多因素问题试验的一种数理统计方法这种方法的优点是试验次数少效果好方法简单使用方便 效率高 因此 正交试验法在工农业生产和其它科学研究领域中得到广泛的应用 并取得显著的效果 在研究比较复杂的问题中 往往都包含着多种因素 我们把准备在试验中考察的有关影响试验指标的条件称为因素 把在试验16冰箱保存备用第 2 章 碳源对

47、VB12发酵的影响中准备考察的各种因素的不同状态称为水平（或位级） 而且这些因素与各种水平是互相交织在一起的 为了寻求最优化的生产条件 就必须对各种因案以及各种因素的不同状态进行试验方法这就是多因素的试验问题选用因素水平的正交表分别选取碳源氮源和一种无机盐 三种因素的三个不同水平进行正交实验 对于选取个水平 选取个水平 选取个水平 对结果进行直观分析确定各因素对发酵的影响程度不同碳源种类对发酵的影响用不同种类的碳源替换原有发酵培养基中的碳源 研究薛氏丙酸杆菌对不同生物量的测定母瓶中生物量的测定将穿刺培养基中的菌体用生理盐水充分洗出 接种于母瓶培养基中 以不接发酵瓶中生物量的测定将母瓶中的菌体接

48、种于发酵培养基中以不接种菌体的发酵培养基作为对照每隔四个小时取样稀释倍于下测定发酵过程中浓度的测定原理试剂是由 二硝基水杨酸 氢氧化钠 酒石酸钾钠 苯酚和亚硫酸氢钠加蒸馏水配制而成 方法适于碱性条件 与还原糖共热后发生氧化还原反应生成了氨基硝基水扬酸棕红色的氨基化合物 在一定的范围内还原糖的量和反应液的颜色强度成比例关系利用比色法可测知样品的含糖量与还原糖进行反应并显色 显色煮沸时间对还原糖的测定有很大影响显色时间在内显色液的吸光度随显色时间的延长而增加 之后 吸光度随时间变化不大 尤其在之后 显色后的吸光度已基本趋于稳定 所以 一17（ ）碳源的利用情况种菌体的母瓶培养基为对照 每隔四个小时

49、取样 稀释倍 于下测定河北大学理学硕士学位论文般取与反应的显色时间为标准曲线的绘制取支试管分别按下表顺序加入各种试剂空白溶液蒸馏水 试剂 加热冷却 均在沸水浴中加热分钟立即用流动冷水冷却蒸馏水 光密度 将上述各管溶液混匀后在进行比色测定用空白管调零点记录光密度值以浓度为横坐标光密度值为纵坐标绘制出标准曲线测定方法用取液器取发酵液置于离心管中 离心分钟去除菌体及杂质取上清液稀释倍然后再取上清稀释液置于刻度试管中加入蒸馏水试剂 混匀在沸水浴中充分加热分钟立即用流动水冷却 然后再加入蒸馏水定容至 小时内 在波长下比色测定光吸收值对照标准曲线查出相应的的含量 按下述公式计算出的百分含量每个样品重复测定

50、次取平均值含量（毫克数样品稀释倍数）样品体积摇瓶补料方法盛取溶于水中的溶液加于摇瓶中灭菌分钟 备用补料时用移液管吸取一定量发酵液中含量的测定化学法粗略测定发酵液中含量高效液相色谱法测定发酵液中含量18第 2 章 碳源对 VB12发酵的影响结果与讨论正交实验结果及分析因素A-碳源 %B-氮源 %C-无机盐%水平1236%5%4%4%3.5%3%0.5%0.4%0.3%表正交试验设计及实验结果因素水平处理号1A2B3C结果1234567891112223335%5%5%4%4%4%3%3%3%1231231234%3.5%3%4%3.5%3%4%3.5%3%1232313120.5%0.4%0.3

51、%0.4%0.3%0.5%0.3%0.5%0.4%0.2180.2070.1470.1570.1370.1130.1250.1370.1070.1930.2040.1580.1560.1460.1180.1310.1310.107K1K2K3R11278287383899809637382429109388459319表正交试验因素水平表（ ）河北大学理学硕士学位论文正交试验结果直观分析图（）图对发酵的影响（）图对发酵的影响（）图对发酵的影响20酵 单 位 （）发酵 单 位 （）发发 酵单位（）第 2 章 碳源对 VB12发酵的影响碳源对产生菌生物量和发酵单位的影响本实验考察了工业生产当中常用

52、的碳源对产生的影响 每种碳源分别选取三个浓度梯度（）实验结果表明对于菌株生长以及合成的最佳碳源为 该菌株在其它碳源的三种浓度梯度的培养基中有的生长缓慢有的生长停滞有的甚至发生自溶初始浓度对产生菌生物量和发酵单位的影响在确定为最佳碳源后 进而确定初始浓度的合适添加量 从正交表可以看出在不流加的情况下在的初始浓度范围内的发酵单位随初始浓度的上升而增加实验研究了初始浓度对发酵的影响选取 六个不同的初始浓度研究对菌体生物量以及发酵单位的影响初始浓度对发酵生物量的影响1 的 初 始 浓 度（）图不同初始浓度对发酵生物量的影响初始浓度对发酵单位的影响21菌体密度（）河北大学理学硕士学位论文1的不同初始浓度

53、 （）图不同浓度对发酵单位的影响结果表明初始浓度并不是越高越好 我们在 的初始浓度的条件下进行实验时 观察到的浓度与的浓度在菌体的生物量上相差不大 但是在初始浓度为时 的发酵单位要比时的高 菌体在初始浓度为时生长缓慢菌体生物量和发酵单位都迅速下降在更高的初始浓度下生长停滞 甚至出现自溶 因此浓度在以上是不适合菌体生长及合成的 补料操作对发酵的影响补料的作用和依据补料是在发酵过程中补充某些养料以维持菌的生理代谢活动和合成的需要补料的内容有补充微生物能源和碳源 补充菌体所需的氮源 补充某些微生物生长或合成需要的微量元素或无机盐等等 补料的原则就在于控制微生物的中间代谢 使之向着有利于产物积累的方向

54、发展 为此 要根据菌体的生长代谢 生物合成规律 利用中间补料的措施给于生产菌适当的调控 鉴于我们对微生物的代谢规律尚未充分掌握 现有的各种补料措施都是根据实验方法确定的 补料的时机也不能单纯以培养时间作为根据 还要根据基础培养基中碳源种类 用量和消耗速度 前期发酵条件 菌种特性和种子质量等因素判断 因此 根据代谢变化如残糖含量值或菌丝形态来考虑比较切合实际标准曲线的绘制在沸水中加热反应冷却后定容至在22下测定溶液的酵 单 位 （）发第 2 章 碳源对 VB12发酵的影响值用作标准曲线并得出线性方程为（）图的标准曲线的标准曲线的回归方程为 （：浓度 吸光度值）在每次实验测定发酵过程中的消耗曲线时

55、 重新绘制的标准曲线 以使得结果保持一致不同初始浓度的条件下发酵过程中残曲线及生长曲线的测定初始浓度为时的消耗曲线和菌体的生长曲线 时 间（）图浓度和生物量随时间的变化初始浓度为时的消耗曲线和菌体的生长曲线23（）菌体密度（）（）河北大学理学硕士学位论文 时 间（）图浓度和生物量随时间的变化初始浓度为时的消耗曲线和菌体的生长曲线60.85432100.70.60.50.40.30.20 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 01 1 01 2 0时 间（）图浓度和生物量随时间的变化从图 图 图可以看出随着初始浓度的降低 代谢终点到来的时间也随之提前 在

56、图中代谢的终点约在小时左右 在图中的代谢终点约在小时左右而对于图代谢的终点在小时左右并且随着代谢终点的到来 菌体都停止了生长 进入了稳定期 并随着培养时间的延长出现了自溶 测定了在发酵过程中的代谢规律 这就为确定补料的时间和补加的量值提供了依据初始浓度为时菌体的生长曲线24（）菌体密度（）菌体密度（）（）第 2 章 碳源对 VB12发酵的影响 时 间（）图不同初始浓度对生长的影响从图可以看出 虽然在初始浓度为的条件下 最终的菌体生物量以及的发酵单位相对较高代谢终点到来的时间比较晚 但在初始浓度为的条件下菌体生长并不处于最佳状态从上图可以看出产生菌的最大比生长速率随起始质量浓度的增加而降低 在初

57、始浓度为的情况下 菌体的对数生长期相对其他的两个浓度要晚一些即菌体生长的迟缓期时间相对较长对于维生素的发酵来讲由于是胞内产物因此要提高维生素的产量首先必须保证菌体能够达到一定的生物量 如果在前期能够使菌体的生长速率加快 使得菌体生长的迟缓期缩短在生产中无疑是有益的因此可采取使初始的浓度降低而在后期进行补料的方式维持菌体的生物量和的发酵单位接种量对生长曲线和代谢的影响选择 个接种量 考察对的影响 其中为原始接种量 接种量增大 菌体的停滞期缩短 使菌体迅速的处于快速繁殖的对数期 的发酵单位随接种量的增加有所提高 提高幅度以增加到为最大 因此以下选择作为接种量25菌体密度（）河北大学理学硕士学位论文

58、0.850.800.750.700.650.600.550.500.450.400.350.300.250.200.1517%12%0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100110120时间 ）图不同接种量对菌体生长的影响从图可以看出 增大接种量有利于初期菌体的生长和繁殖 能够使菌体较早的进入对数生长期 从而对生产较为有利 因而 我们进一步测定了接种量增大至后发酵过程中在不同初始浓度下的代谢曲线 初始浓度为时的消耗曲线和菌体的生长曲线 时 间（）图浓度和生物量随时间的变化初始浓度为时的消耗曲线和菌体的生长曲线26菌体密度菌体密度（）（）第 2 章 碳源对 VB12发酵的影

59、响 时 间（）图浓度和生物量随时间的变化初始浓度为时的消耗曲线和菌体的生长曲线 时 间（）图浓度和生物量随时间的变化初始浓度为接种量为时菌体的生长曲线 时间（）图不同初始浓度对生长的影响27（）菌体密度（）菌体密度（）菌体密度（）（）河北大学理学硕士学位论文接种量增大至后初始浓度对菌体生长的影响及消耗的影响和接种量增大之前的规律相似 从各个代谢图的对比中可以看到 增大接种量后代谢的终点都提前了约个小时 从的消耗曲线可以看出 在初始阶段小时左右的消耗速率较慢菌体浓度上升也较慢这可能是由于菌体处于适应期在到小时为的高消耗阶段 浓度下降很快菌体生物量也大量上升 初始浓度为时的补料试验以 作为初始浓度

60、 分别依据消耗曲线 确定补料的时间及补料的具体的量值表不同初始浓度下的补料试验及其结果初始浓度最终浓度液相测定结果产量增幅对照样品的效价为对于初始浓度为的样品 在 小时时补 对和的样品分别在小时时补 从结果来看以三个初始浓度进行补料都取得了一定的效果且的效果略优于和而且从总浓度来看比和的要低 并且从图可以看出菌体在较低的初始浓度下生长速率较快 因而以下实验选择为初始浓进一步进行补料实验初始浓度在时的补料实验对为初始浓度的样品的消耗曲线进行比较精确的测定 28第 2 章 碳源对 VB12发酵的影响 时 间（）图浓度随时间的变化从图中可以看出 以为初始浓度的样品其实际浓度要高于分析可能是由于培养基