蛋白质定量新方法及相关技术研究汇报课题四

1、集成化蛋白质组定量分析系统项目编号：2012CB910604参加单位：中国科学院大连化学物理研究所复旦大学外协单位：中国计量科学研究院国家重大科学研究计划“蛋白质定量新方法及相关技术研究”项目进展汇报会2014年7月4日，上海汇报内容拟解决的关键科学问题目标完成情况主要研究进展下一步工作计划一、拟解决的关键科学问题 针对蛋白质组样品处理、分离和定量分析多为离线多步操作，存在费时、费力、样品易污染和丢失等问题，通过发展蛋白质定量样品处理新装置以及自动化标记新技术，构建集成化定量蛋白质组分析系统，提高规模化蛋白质定量的通量、准确度、精密度和自动化水平研究内容集成化蛋白质组定量分析系统多维液相色谱-

2、质谱数据解析蛋白质快速变性、还原溶液快速置换蛋白质在线酶解固相标记二、目标完成情况年度预期目标目标完成情况第三年1）建立2-3种目标蛋白质组的选择性固相原位标记方法2）完成在线固相标记系统的评价和验证，形成标准操作流程3）将在线标记系统与分离鉴定系统联用，实现样品标记、色谱分离和质谱鉴定的全自动分析4）建立基于色谱激光诱导荧光检测技术的目标蛋白质的定量标准曲线1）发展了4种选择性固相同位素标记方法2）完成了在线固相标记系统的评价及验证，下半年拟形成标准操作流程3）建立了3种集成化蛋白质组定量分析系统，可以实现在线样品前处理、在线标记、色谱分离和质谱鉴定的全自动分析4）基于色谱激光诱导荧光检测技

3、术的目标蛋白质的定量标准曲线，实现了人肝脏中22种蛋白质的绝对定量三、主要研究进展固相标记方法 糖蛋白质组 磷酸化蛋白质组集成化定量分析系统 膜蛋白质组 全蛋白质组三、主要研究进展固相标记方法 糖蛋白质组 磷酸化蛋白质组集成化定量分析系统 膜蛋白质组 全蛋白质组固相标记反应标记的样品溶液交换，除盐等溶液标记反应离心影响定量准确性降低灵敏度 样品损失提高灵敏度和样品回收率 简化实验步骤溶液标记 vs. 固相标记 糖基化肽段的固相标记反应基于酰肼微球的固相富集手段二甲基标记方法富集特异性高达90%以上反应快速完全，易于操作；标记试剂价格低廉基于酰肼微球的固相标记主要进展一人类肝脏糖蛋白质组相对定量

4、分析 多酶酶切技术使用彼此间有着切割位点互补性的多种蛋白酶来酶解蛋白蛋白的鉴定数目蛋白的覆盖率固相标记技术N-糖基化肽段的富集以及二甲基标记都是在酰肼微球上进行富集回收率检测灵敏度正常和肝癌人肝组织N-糖基化蛋白质组规模化差异分析Zou HF et al. Clinical Research, in press多酶酶切trypsin, trypsin & Glu-C, chymotrypsin固相标记实验方案共定量到1632个N-糖基化位点vs. Trypsin 595个位点多酶酶切技术鉴定到含有相同糖基化位点的不同长度肽段GlycositeEnzymeSequenceRatioAverage

5、 ratioRSDERAP2N119TrypsinDIEITN*ATIQSEEDSR0.851.0013.7%Trypsin+Glu-CITN*ATIQSEEDSR1.03Chymotrypsin IIIHSKDIEITN*ATIQSEEDSRY1.12有效提高了位点的定量覆盖率RSD50% 743个N-糖基化位点有769个N-糖基化位点可以在两到三个酶切方法中被定量到正常人肝脏糖蛋白质组定量分析定量准确度蓝点：742个(99.9%)落在log2 Ratio=-11，仅有1个例外黑点：831个(95.0%)落在log2 Ratio=-11，有32个例外 99.9%准确定量95.0%准确定量蓝点

6、：二到三个酶切方法中定量到的糖基化位点黑点：单个酶切方法中定量到的糖基化位点正常人肝组织的N-糖基化蛋白组定量分析定量到1052个N-糖基化蛋白的2329个N-糖基化位点vs.Trypsin 754个位点(32.4%)三次质谱重复分析目前为止得到的人肝组织N-糖基化蛋白组的最大定量数据集正常和肝癌人肝组织的N-糖基化蛋白组的差异性分析位点分布0.5r2或r0.5蓝点583275黑点676428设置门槛，每一种酶切方法三次技术重复的RSD90% 的定量比值在0.8-1.2 之间，而使用传统的方法，这一比例小于80%磷酸化肽段鉴定效果与定量准确度人肝及肝癌组织磷酸化肽段定量分析比较文献：Sci.

7、Signal. 2009, 2, ra46 ; Nat. Meth. 2011, 8, 655.从0.5mg的人肝与肝癌样品中一次可以定量到5000条以上的磷酸化肽段，磷酸化肽段的定量精密度优于使用TiO2富集结合SILAC定量的方法显著上调主要是嗜酸性激酶CKII的底物；显著下调主要是嗜碱性激酶的底物三、主要研究进展固相标记方法 糖蛋白质组 磷酸化蛋白质组集成化定量分析系统 膜蛋白质组 全蛋白质组优势实现膜蛋白质酸性增溶剂溶解和碱性条件酶解兼容整个膜蛋白质样品预处理时间缩短至3.5 h （常规16 28h）减少样品损失，适用痕量样品分析，并可提高定量分析的准确度和精密度Zhang LH et

8、 al. Anal. Chem. 2013, 85, 8507-8512基于双相柱的膜蛋白质组样品预处理主要进展三SCX微反应器双相柱微反应器peptidecoveragepeptidecoverageBSA3154%5981%Myo1377%1994%Cyt C1360%1365%marker上样液双相柱 SCXpH 置换液双相柱 SCXBSAMyoCyt C双相柱微反应器回收率50 ng 鼠脑微量膜蛋白质组分析蛋白质肽段跨膜蛋白质疏水性肽段跨膜肽段时间双相柱 微反应器14137964142173.5 h文献方法34681021116 h微量细胞样品定量分析 微反应器方法文献方法细胞数蛋白质

9、肽段蛋白质 肽段300 0006181762520159330 0003308194853Zhang LH et al. unpublished data在线样品预处理装置样品在预处理时间由离线的28 h缩短到 4 min基于该膜构建的集成化在线样品预处理装置对蛋白质的回收率可以达到94%1.3% (n=3) 集成化蛋白质样品预处理装置 A: 蛋白质变性和还原；B: 蛋白质除盐；C: 蛋白质酶解Zhang LH et al. Anal. Chem., unpublished data主要进展四基于SILAC标记的集成化定量蛋白质组分析平台SILAC标记的蛋白质组样品通过在线预处理系统进行变性、

10、还原、除盐和酶解，并结合多维色谱分离质谱鉴定系统，构建了集成化蛋白质组相对定量平台Zhang LH et al. Unpublished data定量平台性能评价以H/L=1的Hela细胞提取蛋白质为样品，考察了平台的准确性和精密度 平行三次分析，共同定量2274个蛋白质，其中99.99%的蛋白质定量比例为1:1, 90%蛋白质定量的相对标准偏差小于15%（n=3)与传统离线方法比较SampleamountNumber of quantified proteinsMean ratio of H/L labelled proteinsRelative standard deviation (n=

11、3)On-lineOff-lineOn-lineOff-lineOn-lineOff-line2 g4212940.9901.0039.7%8.4%10 ng5031.0041.1436.0%13.5%与传统离线方法相比，定量到的蛋白质数目不仅分别提高了1.4和16倍，而且分析时间也缩短到1/20。此外，随着样品量的降低，定量的准确性和精密度也得到明显改善人肝癌高低转移细胞定量蛋白质分析RSD 5 文章12篇Nature Method 1 篇Angew. Chem. 1 篇Chem. Commun. 1 篇Anal. Chem. 5 篇 J Proteome Res. 3 篇Applied Materials & Interface 1 篇申请发明专利12项，其中国际专利2项培养博士后2人，毕业博士研究生7人 四、下一步工作计划严格按照课题任务书执行冲击高水平论文建立标准化操作流程，加强新技术新方法的推广应用致 谢科技部项目专家组和顾问组各参加单位及主管部门课题组所有成员及项目组其他成员敬请各位评委指正基于荧光标记和二维色谱分离的蛋白质绝对定量荧光探针选择完全衍生鉴定模拟定量多维色谱分离蛋白质定量采用与质谱分析相兼容的荧光试剂，5-吲哚乙酰氨基荧光素，对蛋白质中的半胱氨酸进行标记，提出了基于色谱分离定量-荧光高灵敏度检测