(医学)生物化学第10章复制课件

1、第三篇基因信息的传递及其调控Transmission and regulation of genetic information第1页，共81页。DNA是遗传的物质基础1996年克隆羊多莉的诞生1981年由我国科学家童第周研制的克隆鱼第2页，共81页。基因的概念与发展1944年，Avery首次证实基因的化学本质是DNA。1953年提出了DNA双螺旋结构模型。1958 Crick提出遗传信息传递的中心法则。60年代 RNA研究取得大发展（操纵子学说,遗传密码,逆转录酶）。Jacod和Monod研究细菌基因调控时发现基因是可分的，功能上是有差别的。70年代：建立DNA重组技术，改变了分子生物学的面

2、貌，并导致生物技术的兴起。80年代：RNA研究出现第二次高潮：ribozyme、反义RNA、“RNA世界”假说等等。90年代以后，实施人类基因组计划（HGP）, 开辟了生命科学 新纪元。生命科学进入后基因时代第3页，共81页。基 因: 指编码蛋白质多肽链或各种RNA的DNA功能片段，以及该片段上下游的调控序列。基因组: 一个细胞或病毒颗粒所含全部遗传信息的总和。基因的概念与发展第4页，共81页。中 心 法 则1958年Crick提出遗传信息传递的方式-中心法则.1970年Temin和Baltimore发现逆转录现象,补充了中心法则.第5页，共81页。基因表达第6页，共81页。第十一章 DNA的

3、生物合成(复制)DNA Biosynthesis，Replication第7页，共81页。本章主要内容复制的基本规律DNA复制的酶学和拓扑学变化DNA生物合成过程逆转录和其他复制方式DNA损伤（突变）与修复第8页，共81页。复制(replication)是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。亲代DNA子代DNA复制第9页，共81页。第一节 复制的基本规律半保留复制(semi-conservative replication)复制的高保真性(high fidelity)双向复制(bidirectional replication)半不连续复制(semi-discontinu

4、ous replication)第10页，共81页。一、半保留复制DNA复制时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全重新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。（一）概念:第11页，共81页。AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGT

5、GACC+母链DNA 复制过程中形成的复制叉子代DNA 1953年,Waston 和Crick即已提出DNA半保留复制的假设第12页，共81页。子链继承母链遗传信息的几种可能方式 全保留式 半保留式 混合式 （二）半保留复制的实验依据第13页，共81页。1958年Messelson和Stahl进行密度梯度实验证实了半保留复制假说. 含重氮-DNA的细菌培养于普通培养液 第一代继续培养于普通培养液 第二代梯度离心结果普通DNA重DNA普通DNA普通DNA重DNA重DNA第14页，共81页。半保留复制的意义遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。半保留复制保证亲代的遗传特征完整无误的传

6、递给子代，体现了遗传的保守性,保证了物种的延续和遗传的稳定。第15页，共81页。原核生物复制时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。 复制中的放射自显影图像二、双向复制复制叉：DNA双链解开成为两股单链，各自作为模板，子链沿模板延长所形成的Y字形结构。第16页，共81页。A. 环状双链DNA及复制起始点B. 复制中的两个复制叉C. 复制接近终止点(termination, ter)oriterA B C第17页，共81页。原核生物只有一个复制的起始点，是单复制子完成复制。真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子 的复制。 第18页，共81

7、页。53oriorioriori535533复制子5533 习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子。复制子是独立完成复制的功能单位。第19页，共81页。三、复制的半不连续性3355解链方向35335领头链随从链岗崎片断解螺旋酶第20页，共81页。顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链(leading strand)。另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随从链(lagged strand) 。复制中的不连续片段称为岡崎片段(okazaki fragment)。 领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。

8、第21页，共81页。参与DNA复制的物质 1.底物: dATP,dGTP,dCTP,dTTP2.聚合酶: 依赖DNA的DNA聚合酶，简写为DNA-pol3.模板: 解开成单链的DNA母链4.引物: 提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合 5.其他的酶和蛋白质因子第二节 DNA复制的酶学第22页，共81页。一、复制的化学反应 (dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi GAT第23页，共81页。1.DNA 新链生成需引物和模板； 2.新链的延长只可沿53方向进行。3.新链的合成遵循碱基互补配对规律。聚合反应的特点:第24页，共81页。二、DNA聚合酶酶活性：1. 53的聚合活性

9、 2. 核酸外切酶活性 全称：依赖DNA的DNA聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase)简称：DNA-pol53外切酶活性-能切除突变的DNA片段。35外切酶活性-能辨认错配的碱基对,并将其水解。第25页，共81页。（一）原核生物的DNA聚合酶第26页，共81页。5 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5外切酶活性 5 3外切酶活性?能切除突变的 DNA片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解。 核酸外切酶活性 第27页，共81页。5 核

10、酸外切酶活性DNA聚合酶活性 5核酸外切酶活性木瓜蛋白酶大片段/Klenow 片段604aa 小片段323aa原核生物DNA聚合酶的功能DNApol 对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。 第28页，共81页。DNA-pol 1. DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。 2. 它参与DNA损伤的应急状态修复。 是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。 DNA-pol 第29页，共81页。（二）真核生物的DNA聚合酶延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。DNA-pol 起始引发，有引物酶活性。参与低

11、保真度的复制 。在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。在线粒体DNA复制中起催化作用。DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 第30页，共81页。复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。复制保真性的酶学机制：（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读 （二）复制的保真性和DNA-pol对碱基选择三、复制保真性的酶学依据第31页，共81页。A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的碱基。B：碱基配对正确， DNA-pol不表现活性。（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读第32页，共81页。 DNA聚合酶靠其大

12、分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。 嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。 （二）复制的保真性和聚合酶对碱基选择第33页，共81页。DNA复制的保真性至少要依赖三种机制 1.遵守严格的碱基配对规律； 2.聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能； 3.复制出错时DNA-pol的及时校读功能。第34页，共81页。四、复制中的分子解链及DNA分子拓扑学变化 （一）解螺旋酶、引物酶和单链DNA结合蛋白第35页，共81页。解螺旋酶(helicase) 利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链。引物酶(primase) 复制

13、起始时催化生成RNA引物的酶。单链DNA结合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB) 在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整。 第36页，共81页。（二）DNA拓扑异构酶10 8 局部解链后第37页，共81页。拓扑异构酶作用特点既能水解 、又能连接磷酸二酯键分 类 拓扑异构酶 拓扑异构酶切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP。切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能，连接断端， DNA分子进入负超螺旋状态。第38页，共81页。第39页，共81页。五、D

14、NA连接酶连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。 DNA连接酶作用方式:第40页，共81页。HO5335DNA连接酶ATPADP5353第41页，共81页。 DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。 在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。 也是基因工程的重要工具酶之一。DNA连接酶的生理功能第42页，共81页。一、原核生物的DNA生物合成 复制的起始复制的延长复制的终止第三节 DNA生物合成过程第43页，共81页。（一）复制的起始需要解决两个问题：1. DNA解开成单链，提供模板。2. 合成引物，提供3-OH

15、末端。第44页，共81页。E.coli复制起始点 oriC GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTCTTATTAG. 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA58 66 166 174 201 209 237 245 串联重复序列 反向重复序列53531. DNA解链第45页，共81页。解链过程主要由DnaA, DnaB（解螺旋酶）, DnaC这三种蛋白质共同参与完成.DnaADnaBDnaC第46页，共81页。2. 引发体的生成和引物引发体: 在复制起始阶段，形成的含有解螺旋酶（DnaB） 、D

16、naC蛋白、引物酶（DnaG）和DNA复制起始区域的复合结构。 Dna B、 Dna CDNA拓扑异构酶SSB3535引物酶第47页，共81页。引物：是由引物酶催化合成的短链RNA分子，长度一般为十几个至数十个核苷酸，合成方向为53。 3535引物3 HO5引物酶引物酶引物酶55第48页，共81页。（二）复制的延长复制的延长指在DNA-pol催化下，底物dNTP以dNMP的方式逐个加到引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。 第49页，共81页。dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTP 5 353OH3DNA-polDNA-pol第50页，共81页。领头

17、链的合成第51页，共81页。随从链的合成第52页，共81页。复制过程简图第53页，共81页。原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。oriterE.coli8232 ori terSV40500（三）复制的终止第54页，共81页。 随从链上不连续性片段的连接555RNA酶OHP5DNA-pol dNTP55PATP ADP+Pi55DNA连接酶第55页，共81页。逆转录(reverse transcription): RNA指导下的DNA合成过程, 催化此反应的酶为逆转录酶(reverse transcriptase).一、逆转录病毒和逆转录酶第四节 逆转录

18、和其他复制方式第56页，共81页。逆转录病毒细胞内的逆转录过程RNA模板逆转录酶DNA-RNA杂化双链RNA酶活性单链DNADNA作模板的dNTP聚合酶活性双链DNA逆转录酶有三种活性：RNA或DNA作模板的dNTP聚合酶活性和RNase活性。第57页，共81页。逆转录酶 AAAAAA TTTTTTAAAAAASI核酸酶 DNA聚合酶碱水解 TTTTTT分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法。 以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。 cDNA complementary DNA试管内cDNA合成*第58页，共81页。

19、二、逆转录研究的意义 逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。 逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。逆转录酶和逆转录现象，作为获取基因工程中目的基因的重要方法之一。第59页，共81页。突变(mutation)：遗传物质的结构改变而引起的遗传信息改变，均可称为突变。从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基的改变。在复制过程中发生的DNA突变称为DNA损伤(DNA damage)。第五节 DNA损伤（突变）与修复第60页，共81页。一、突变的意义（一）突变是进化、分化的分子基础（二）突变导致基

20、因型改变（三）突变导致死亡（四）突变是某些疾病的发病基础第61页，共81页。二、引发突变的因素1.物理因素 紫外线、各种辐射。 UV第62页，共81页。2.化学因素稠环芳香烃硝基胺和芳香胺某些药物变质食物无机物第63页，共81页。化学因素第64页，共81页。三、突变的分子改变类型错配 (mismatch)缺失 (deletion)插入 (insertion)重排 (rearrangement)框移(frame-shift) 第65页，共81页。DNA分子上的碱基错配称点突变(point mutation)。发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。 1. 转换发生在异型碱基之

21、间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。 2. 颠换（一）错配第66页，共81页。同义突变：密码子第三位核苷酸的碱基改变而不改变密码子的意义（仍为相同氨基酸的密码子）。 转换和颠换可能引起的突变效应有:CGACGC精氨酸精氨酸第67页，共81页。误义突变：碱基置换使一种氨基酸密码子变成另一氨基酸密码子。 无义突变：一个碱基的置换使代表氨基酸的密码子变成无义密码（即终止密码）CAACGA谷氨酰胺精氨酸终止密码CGAUGA精氨酸第68页，共81页。镰形红细胞贫血病人Hb (HbS) 亚基N-val his leu thr pro val glu C 肽链CAC GTG基因正常成人Hb (HbA)亚基N-va

22、l his leu thr pro glu glu C 肽链CTC GAG基因第69页，共81页。HbA：N Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-LysHbS： N Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys镰状红细胞贫血症正常红细胞第70页，共81页。（二）缺失、插入和框移缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。缺失或插入都可导致框移突变 。框移突变是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。 第71页，共81页。缺失和插入可引起框移突变谷 酪 蛋 丝5 G C A G U A C A U G U C 丙 缬 组 缬正常5 G A G U A C A U G U C 缺失C第72页，共81页。（三）重排DNA分子内较大片段的交换，称为重组或重排。 第73页，共81页。