里氏木霉液体发酵法生产纤维素酶

1、余晓斌具润漠(无锡轻工大学生物工程学院, 无锡, 214036)(韩国仁荷大学 生物工学科)摘 要通过比较几株霉菌产纤维素酶活力, 发现里氏木霉 R u t C - 30 活力最高; 采用A v ice l 与麸皮复合碳源, 以及使用 KH 2PO 4 - K 2H PO 4 缓冲系统控制发酵液 pH , 28摇瓶发酵 6d, 最高酶活达到 CM C a se 100- 125U /m l, F PA 9- 12U /m l。采用 2. 5 升发酵罐培养, 通过控制 pH 和溶氧, 纤 维素酶活力为CM C a se 133. 4U /m l, F PA 11. 67U /m l。用硫铵盐析法

2、提取制得纤维素酶干粉, 其活力为 CM C a se3074. 9U /g, F PA 166. 7U /g。关键词 里氏木霉 CM C a se F PA - 葡萄糖苷酶纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称, 其最大的潜在用途是把纤维素 类物质酶法水解成葡萄糖, 葡萄糖可用于生 产燃料酒精、食品和各种化学品, 此外近年来 发现纤维素酶在众多的工业领域具有广泛的 应用价值, 如食品、饲料、医药、纺织、洗涤剂 和造纸工业1 等。国外对纤维素酶有近 40 年多年的广泛 研究, 纤维素酶产生菌代表性菌株有木霉、青1. 1菌种里氏木霉 ( T rich od e rm a reese i )

3、R u t C -30 ( 简写为 R u t C - 30) , 里氏木霉 QM 9414 (QM 9414) , 里氏木霉 QM 9414 的紫外线诱变株 (QM - m ) , 黑曲霉 (A sp e rg il lu s n ig e r )6 (A sp 6)。-1. 2培养基1. 2. 1斜面培养基土豆 PDA 斜面, 30培养 6d 后使用。1. 2. 2发酵培养基摇瓶发酵培养基: 蛋白胨 0. 3% , 硫铵0. 2% , 酵 母 膏 0. 05% , KH 2 PO 4 0. 4% ,霉和曲霉等, 其中里氏木霉 R u t C -30 被认为是最好的纤维素酶产生菌之一2 ;

4、我国对纤维素酶的研究和生产也已开展了广泛的研 究, 但大多采用固体发酵方式3, 4 , 对液体发酵生产纤维素酶的研究报道尚不多见, 固 体发酵虽有许多优越之处, 但仍有发酵水平 不稳定, 不适于大规模生产等弊端, 因此对纤 维素酶液体深层发酵的研究很有意义。 高活 力纤维素酶通常是在发酵罐中通过分批发酵或流加发酵获得的5, 6 , 但对在实验室摇瓶条 件下如何获得高活力酶活及酶的提取, 国内 外文献报道均不多见。 本论文对摇瓶条件下 如何获得高活力的纤维素酶活进行了研究, 使用 2. 5 升发酵罐进行了初步上罐试验, 并进行了酶的提取。C a2C l2 2H 2O03% , Tw een -同

5、碳源添加后,M gSO 4 7H 2O0. 03% ,0.80 0. 02% 为基础培养基, 不121灭菌 20m in 后使用。2. 5 升发酵罐培养基:A v ice l 3% , 麸皮1% , 蛋白胨 0.3% , 硫铵 0. 2% , 酵母膏 0.05% , KH 2 PO 4 0. 3% , C a2C l2 2H 2O 0.M gSO 4 7H 2O03% ,0.03% , Tw een -800. 02% , 消泡剂 (A n t ifo am 204 S igm a Co. ) 适量。1. 3发酵方法摇瓶发酵, 采用生理盐水斜面孢子悬 液, 按 10% 种 量 接 种 至 50

6、m l 培 养 液 中,250m l 三角瓶, 28旋转摇床 150 rpm 培养6d。1材料与方法 收稿时间: 1997- 09- 11, 改回时间: 1997- 10- 15第 24 卷第 1 期余晓斌等: 里氏木霉液体发酵法生产纤维素酶212. 5 升罐 (K F - 2. 5L ,水杨素溶液 (溶于 pH 4. 8 0. 1M HA c- N aA c缓冲液) , 50反应 30m in , 加入 3m lDN S 试 剂测糖。以上酶活均扣除发酵液中的还原糖后计 算酶活力, 酶活采用国际单位, 其定义为每分钟水解生成 1m o l 葡萄糖的酶量为 1 个活 力单位。1. 5酶提取方法发

7、酵液用离心机 4000 r/m in 离心 10 分 钟, 除去固形物和菌体, 得清液, 缓缓加入60% (W /V ) 硫铵, 溶解后, 静置过夜, 加适量 助滤剂, 抽滤得酶泥, 40真空干燥 1d, 经研磨后得酶粉。Ko rea F e rm en to rCo. ) 发酵, 将培养 48h r 的液体种子, 按 10%种量接种于 1. 4 升培养基中, 通风量 10. 2 1vvm , 转 速 250 - 400r/m in , 通 过 流 加2N N H 4O H 自动控制发酵液 pH 为 4.0; 通过 控 制 风 量 和 转 速, 保 持 溶 氧 饱 和 度 在20% 。1. 4

8、酶活测定 7 羧甲基纤维素酶活 (CM C a se ) 的测1. 4. 1定取适当稀释酶液 0. 5m l, 加入 0. 5m l1%CM C 溶液 ( 溶于 pH 4. 8 0. 1M HA c - N aA c 缓冲液) , 50反应 30m in , 加入 3m lDN S 试 剂, 沸水浴 5m in , 冷却后加水稀释测糖。1. 4. 2 滤纸糖酶活(F PA , F P a se) 测定称取 50m g W h a tm an N o. 1 滤纸, 加 1m l pH 4. 8 0. 1M HA c- N aA c 缓冲液, 加入适当结果与讨论22. 1 产酶菌种活力比较对实验室

9、保藏的几株纤维素酶产生菌,进行了反复的比较, 表 1 列举了用不同培养 基二次摇瓶试验比较结果, 表明 R u t C - 30 产酶活力最高, 产酶性能稳定, 因此选用 R u t C - 30 做进一步研究。稀 释 酶 液 0. 5m l, 50反 应3m lDN S 试剂测糖。1. 4. 3葡萄糖苷酶活测定1h r, 加 入取适当稀释酶液 0. 5m l,加入 0. 5m l1%表 1 菌株产酶活力比较注: 以 1%A v ice l+ 1% 麸皮为碳源, 28培养 4. 5d。2. 2摇瓶发酵过程中 pH 的控制要获得纤维素酶的高产, 发酵培养基应 含有较高的基质浓度和营养, 以供菌体

10、的充 足生长和酶的大量合成, 但在以纯纤维素如A v ice l、So lk f lo c 等为碳源的情况下, 纤维素 酶的合成过程中伴随着产酸, 产酸被认为是酶合成过程中所必需的, 并可能对酶合成的 启动具有诱导作用8 。在大量的摇瓶试验中,我们曾试图通过增加基质 A v ice l 浓度来提 高产酶量, 但发现 1%A v ice l 产酶最好, 产酶量随 A v ice l 浓度的增加而下降, 即 1%A v i2ce l 2% 3% 4% 5% , 其原因为在高浓度碳源条件下, 由于菌体代谢碳源大量产酸,导致培养液 pH 急剧下降, 当 A v ice l 浓度提 高到 2% 时, 发

11、酵液 pH 就已低于 3. 0。 当发酵液 pH 3. 0,将导致酶的失活和菌体生长的停滞5, 9, 因此 pH 的控制被认为是发酵产生纤维素酶成败的关键因素之一。表 2 表明,当以 2%A v ice l+ 1% 麸皮为碳源时, 发酵终 了 pH (2. 69) 很低, 因此酶活相对也较低。在 摇瓶发酵试验过程中, 我们曾试验了多种pH 控 制 方 法 中, 发 现 K 2H PO 4 ( 0. 3% ) -菌株QM 9414QM - mR u t C - 30A sp 6CM C a se (U /m l) ICM C a se (U /m l) II19. 1432. 011. 0427

12、. 922. 3537. 74. 414. 61食品与发酵工业22Foo d and F e rm en ta t io n Indu st r ie s V o l. 24 N o. 1KH 2 PO 4 ( 0. 4% ) 缓冲系统具有较好的效果,而且操作简单方便, 当 A v ice l 浓度增至 2%仍可有效控制 pH , 从表 2 可见, 当培养基中采用 K 2H PO 4 - KH 2 PO 4 缓冲系统后, pH 得到有效控制, 酶活显著提高。表 2 不同培养基产酶比较1% A v ice l+ 1% 麸皮+ K 2H PO 4 - KH 2 PO 4培养基2% A v ice

13、l+ 1% 麸皮1% A v ice l+ 1% 麸皮CM C a se (U /m l)发酵终了 pH18. 0558. 481. 52. 692. 983. 68注: 28培养 5d。2. 3碳源及各种碳源与麸皮复合对产酶的影响对霉菌而言, 纤维素酶是诱导酶, 不同碳 源对纤维素酶的合成具有显著的影响, 因此 试验了一系列碳源及与麸皮复合对产酶的影响, 结果见表 1, 可见A v ice l 与麸皮复合碳源产酶最高, 而且麸皮与所试碳源复合后均可 促进产酶。表 3不同碳源对里氏木霉 R u t C -30 产酶的影响2. 4 A v ice l 与麸皮的配比对产酶的影响为了探明A v ic

14、e l 与麸皮的最佳配比, 试验了不同配比对产酶的影响。碳源浓度 (% W /V )CM C a se (U /m l)F PA (U /m l)终 pH 值A v ice lA v ice l+ 麸皮So lk f lo cSo lk f lo c+ 麸皮 纸浆纸浆+ 麸皮 乳糖乳糖+ 麸皮 淀粉淀粉+ 麸皮CM CCM C + 麸皮 麸皮 麸皮纤维素粉葡萄糖1. 01. 0/1. 01. 01. 0/1. 01. 01. 0/1. 01. 01. 0/1. 01. 01. 0/1. 01. 01. 0/1. 01. 02. 01. 01. 058. 3179. 6263. 7873. 27

15、53. 3869. 2816. 1559. 064. 6933. 294. 2920. 7822. 689. 8772. 8919. 855. 155. 614. 605. 084. 104. 961. 164. 730. 222. 580. 252. 181. 982. 884. 540. 923. 052. 992. 952. 875. 905. 224. 573. 034. 883. 226. 706. 526. 456. 345. 243. 46第 24 卷第 1 期余晓斌等: 里氏木霉液体发酵法生产纤维素酶23表 4 A v ice l 与麸皮的不同配比对产酶的影响注: 因培养基中使

16、用高浓度A v ice l, 添加 K 2H PO 4 于培养基中, 防止 pH 偏低。当使用 1%A v ice l 时, 酶活随麸皮浓度的增加而增加; 当使用 2%A v ice l 时, 加入3% 麸皮产酶较好。因此对摇瓶培养而言, 1%A v ice l 与 5% 麸皮或 2%A v ice l 与 3% 麸皮为碳源是较佳配比。2. 52. 5 升罐发酵图 1 2. 5 升全自动发酵罐产酶过程曲线: CM C a se, : F PA , : - 葡萄糖苷酶, : 还原糖由于采用发酵罐培养, pH 易于控制, 使用缓冲体系已无必要, 因此加大 A v ice l 浓 度, 提高至 3%

17、 , 通过流加 2N N H 4O H 控制 发酵液 pH 于 4. 0 左右, 兼补充氮源。由图 1可见, 发酵 2 天后, 酶活迅速增长, 培养至130. 5h 后酶活达最大值, CM C a se 133. 4U /m l, F PA 11. 67U /m l, 但整个发酵过程中 - 葡萄糖苷酶活力一直很低。 对高浓度基质流加发酵试验, 采取如下两个方案:其初步试验, 初始碳源使用 2% A v ie l 及 1% 麸皮, 发酵开始后, 根据发酵液 pH 下 降速度慢, 至 54h 后, 流加 2%A v ie l, 并通过流加氨水控制 pH 为 4.0 左右, 至发酵终了(130h )

18、 CM C a se 活力为 155. 0U /m l, 比分批发酵酶活 (CM C a se 133. 4U /m l) 有所提高。 对流加发酵策略的建立及条件优化等研究工作, 正在详细进行之中。碳源A v ice l/麸皮 (% W /V )CM C a se (U /m l)F PA (U /m l)发酵终 pH1. 0/1. 01. 0/2. 01. 0/3. 01. 0/4. 01. 0/5. 02. 0/1. 032. 0/2. 032. 0/3. 032. 0/4. 0379. 0695. 98100. 83112. 33115. 5095. 32120. 36125. 7812

19、0. 746. 217. 468. 259. 2312. 857. 889. 3310. 589. 883. 062. 982. 972. 993. 223. 764. 084. 484. 91食品与发酵工业24Foo d and F e rm en ta t io n Indu st r ie sV o l. 24 N o. 1发酵初始碳源为 2%A v ie l 和 1% 麸皮, 发酵开始后, 根据发酵液 pH 下降速度变 慢, 至 54h 后, 流加 2%A v ie l, 用 2N N H 4O H 控制 pH 为 4. 0 左右, 至发酵终了 130h , CM 2C a se 活力

20、为 155. 0U /m l, 比分批发酵 CM 2C a se 133. 4U /m l 有所提高。通过对流加发酵 流加策略、流加浓度、流加次数、间隔时间等工艺条件的进一步优化, 酶活可望再进一步提高。2. 6酶的提取盐析和溶剂沉淀法是二种常用的酶提取 发法, 硫铵盐析和乙醇沉淀曲线可为酶的提取提供基本数据。图 2 硫铵盐析曲线(: 上清液 CM C a se, : CM C a se 酶活收率)图 3 乙醇沉淀曲线(: 上清液 CM C a se, : CM C a se 酶活收率)当 硫 铵 添 加 浓 度 为 60% (W /V ) 时,CM C 收率最大为 99. 8% , 几乎完全

21、回收; 当 乙醇浓度为 80% (V /V ) 时, 酶活收率最大为84. 8% 。由于硫铵盐析酶活收率高, 因此采用该法进行酶的提取。 1. 4 升上罐发酵液经离心除去固形物和菌体后, 得 875m l 酶清液,提取结果见表 5。表 5 纤维素酶粉提取结果酶活收率 F PA 低于 CM C a se, 其原因可能是在盐析后, 使用了滤纸过滤, 滤纸对外切 纤维素酶具有较强的吸附作用所致。 所制得 酶粉为浅黄色, 在水中溶解性良好。今后可考虑采用超滤和薄膜浓缩技术, 制备液体酶。结语3本文通过优化摇瓶发酵培养基成分和pH 控制的策略, 可获得高活力纤维素酶, 产 酶菌种的性能得到了客观的表达,

22、 这对产纤 维素酶菌的育种和筛选具有十分重要的意 义。本文上罐发酵为分批发酵, 如采用高浓度项目样品量CM C a se(U /m l)F PA(U /m l)总活力 (U )酶活收率 (% )CM C a se F PACM C a se F PA发酵清液875m l133. 3511. 67116681 10211纤维素酶粉31. 7g3074. 9 (U /g)166. 7 (U /g)97474 528483. 5 51. 8第 24 卷 第 1 期余晓斌等: 里氏木霉液体发酵法生产纤维素酶25基质流加发酵, 产酶量可望得到进一步提高。B io tech no l. B io eng.

23、 1981, 23: 18376W a t so n T G, N e lligan I and L e ssing L.参 考 文 献B io tech no l. L e t te r, 1984, 6 (10) : 6677 W oo d W A , Ke llo gg S T. M e tho d s in E n2 zym o lo gy. V o lum e 160, B iom a ss P a r t A C e llu lo se and H em ice llu lo se, A cadem ic P re ss, IN C.8 M ande ls M and A nd r

24、eo t t i R E. P ro ce ssB io ch em ist ry, 1978, 13: 61 胡学智编. 酶制剂生产技术, 北京: 化学工业出版社, 19942 Ing r id P , Fo lk e T , and B a rbe l H. P ro ce ssB io ch em ist ry, 1991, 26: 65- 743 张树政, 王修恒主编. 工业微生物成就, 北 京: 科学出版社, 1988, p 604 刘淑华等. 微生物学通报, 1992, 19 (3) : 1519S te rnbe rg D and D o rva l S. B io tech n

25、o l.B io 2eng.1979, 21: 181- 1915T angnu S K , B lanch H W and W ilk e C R.The Ce llula se Produc t ion by T r ich od e rm a reese iin Subm erged Ferm en ta t ionY u X iao b in(Schoo l o f B io eng inee r ing,W ux i U n ive r sity o f L igh t Indu st ry,W ux i, 214036)Koo Yoo nm o(D ep t. o f B io lo g ica l E ng inee r ing, Inh a U n ive r sity, Incho n , Ko rea)A BSTRACT B y com p a r in g ce llu la se ac t iv ity o f d iffe ren t st ra in s, T rich od e rm a reese i R u t C