分子实验报告

1、蚯蚓纤溶酶的纯化与鉴定姓名：程辉088316150张忠先088316118班级：科文08生物一、实验目的：1、掌握从生物体中分离纯化蛋白质的基本原理。2、掌握蛋白质分离的基本操作技术。3、掌握蛋白质的抽提与沉淀技术盐析。4、掌握蛋白质脱盐的方法和操作步骤。5、掌握凝胶层析分离蛋白质的原理和技术步骤。6、掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的原理和操作技能。7、掌握酶活性的检测方法。二、实验原理：1）、蛋白质盐析：盐在水中电离所形成的正负离子可吸引水分子，从而争取蛋白质分子上的水化膜，还可以中和部分电荷，致使蛋白质聚集，从而达到盐析沉淀蛋白质的目的。2）、脱盐：经中性盐析分离纯化的蛋白质溶液，尚需要

2、通过脱盐及浓缩的方法才能得到所需要的蛋白质。使用葡聚糖凝胶G-100装柱过滤，即凝胶层析法脱盐，效果比较好。经过葡聚糖凝胶G-100柱，经生理盐水洗脱，一开始洗脱出来的为各种蛋白质，隔一段时间洗脱出来的为盐，从而达到使蛋白质脱盐的目的。3）、离子交换层析：其是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对溶液中各种离子的结和力不同而达到分离的目的。4）、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：在此系统中加入阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）和少量巯基乙醇，单体蛋白质或亚基的多肽链处于伸展状态，此时SDS以其烃链与蛋白质分子的侧链结合成复合体。结果：1、所有的

3、SDS-蛋白质复合体都具有相同的荷质比。2、具有相同的构象。因此蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与原来所带的电荷和分子形状无关。三、材料与试剂：1）、材料：处理过的蚯蚓、葡聚糖凝胶SephadexG-1002）、试剂：葡聚糖凝胶SephadexG-100、DEAE-SepharoseCL-6B阴离子交换剂、0.2M磷酸盐缓冲液、60%饱和度的硫酸铵、PH=8.0的磷酸盐缓冲液、1MNacl、检测板、分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、电极缓冲液、样品缓冲液、30%Arc-bis贮液、10%过硫酸胺、TEMED原液、染色液CBBR250、脱色液。四、实验步骤：1、粗酶液的抽提：1）、

4、蚯蚓冲洗干净（可先让其吐泥1-2天），称取2克左右。2）、放入两倍体积的pH8.0的0.02M磷酸盐缓冲液用匀浆器匀浆，置于4摄氏度条件下浸提1224小时。2、盐析：1）、离心6000rpm,10min取上清，用60%饱和度的硫酸铵盐析24小时。2）、离心10000rpm,2min取沉淀、进行脱盐3、脱盐（凝胶过滤，采用葡聚糖凝胶SephadexG-100）：1）、凝胶处理：取国产SephadexG-100以蒸馏水浸泡过夜（必要时加热溶胀），倾出上清液及微细及破损凝胶颗粒，即可准备装柱。2）、装柱：取直径0.81.2cm,长1720cm层析住，先将柱垂直放好，关闭出水口，自顶部缓缓加入稀薄的S

5、ephadexG-100悬液，待底部凝胶沉淀12cm，再打开出水口，继续加入上述悬液，至凝胶沉积达15cm即可，关闭出水口。操作过程中注意防止产生气泡与分层，表面需平整。如果表面出现凹陷现象，可用细玻璃棒轻轻搅动表面使凝胶自然沉降。3）、连接检测器。4）、平衡：用45个柱体积的缓冲液洗脱。5）、加样：打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。加入蛋白质样品：用吸管将透析后的样品沿管壁环绕移动加到色谱柱的顶端。加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全渗入凝胶层后，关闭出口。加入磷酸缓冲液到适当高度。（注意：样品的体积越小，浓度越大效果越好。）6）

6、、洗脱：启动蠕动泵，打开下端出口，进行洗脱，根据A280收集蛋白质。4、离子交换层析（采用DEAE-SepharoseCL-6B阴离子交换剂）：1）、装柱及缓冲液平衡：柱胶要求均一、粗短，胶面要求平整；柱装好后用两个柱床体积的缓冲液平衡2）、上样：对样品液的体积和浓度无要求。3）、洗脱（流速不超过0.75ml/min,采用梯度洗脱）：启动蠕动泵，打开下端出口，进行洗脱，根据峰值收集蛋白质。4）、检验收集的峰值蛋白质活性。5、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对纤溶酶进行纯化和鉴定：1）、配置不连续的凝胶（5%浓缩胶，12%的分离胶，采用化学聚合法）：在模具中灌注分离胶后，小心地在分离胶的表面上加一层水

7、，封住胶面，以促使聚合并使凝胶表面平直。凝胶在3040摄氏度放置约40min1h后，可以看到一个界面，表示凝胶聚合。吸掉水用浓缩胶缓冲液贮液淋洗凝胶，然后灌注浓缩胶溶液，并插入与模具大小相同，与凝胶厚度相当的梳子。为防止气泡陷入，梳子应倾斜插入。聚合约40min1h。将聚合好的凝胶连同制胶模具装置在电泳槽上，拔掉梳子，用电极缓冲液清洗样品孔，然后将上下电极槽注满电极缓冲液，检查上槽无泄漏，即可加样。2）、加样：每空加30ul。（注意：（样品处理）加样前，样品溶液与样品缓冲液按1:1混合，100摄氏度煮沸35分钟。）3）电泳：加样完毕后，打开直流稳定电源（负极接上槽，正极接下槽），80120v稳

8、压电泳至染料迁移至下端1cm处，停止电泳。4）剥胶、染色、脱色五、实验结果：1）、脱盐：rr-r数据体积：吸收值：1.98ml0.0055.7ml1.5077.5ml0.4792、离子交换层析：数据OD值0.1300.0920.0880.1690.1750.1450.2350.2600.224V/ml02.54.67.611.21416.116.817.5OD值0.2420.2270.2200.2050.30.3500.2100.1870.636V/ml2021.622.323.625263033.135OD值0.3500.2740.3420.3750.1540.1250.1100.2290.187V/ml36.437.438.639.641.24243.24547.2OD值0.1520.2750.2200.110V/ml49535455经验总结：在本次试验的最后一步电泳加样时，我们误将放于台子上的样品当成样品缓冲液来使用，导致首次加样失败。原因主要是平时我们在实验室中做实验时太心急，未能很好的联系老师上课时所讲的内容，样品缓冲液和样品有着