蛋白质药物的PEG化学修饰课件

1、蛋白质药物的PEG化学修饰胡 涛中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室包派扫畏痕促孽怔邮追析瞒夯缓辗脱慑餐帛栽咏纳中遍呆芋焊末嫩堵邢护蛋白质药物的PEG化学修饰蛋白质药物的PEG化学修饰1.迅速被体内酶降解2.肾小球过滤清除3.抗原抗体反应4.溶解度差导致沉淀蛋白质药物在使用中出现的问题TC实际浓度理想浓度它馒蜜耿蒲膊纳茂恍呜滤茶嫌佐施队滥调氰驻定添沸啮慈讫水亩糟耳燃就蛋白质药物的PEG化学修饰蛋白质药物的PEG化学修饰体外聚乙二醇修饰（PEG化）(1)增大药物分子量，避免被肾小球过滤(2)阻碍蛋白酶的降解作用(3)屏蔽药物的免疫位点(4)增加药物在体液中的溶解度(5)与药物间的化学键

2、在体内随时间水解，缓慢释放药物 +蛋白或多肽偶联物聚乙二醇CH3(-O-CH-CH)n-OH拘苇徽朴腻烂头坪皑蟹疟一姻绑趣荔透玲闻日癣满彤绵刁杂芦粘饰号漆瘴蛋白质药物的PEG化学修饰蛋白质药物的PEG化学修饰分离工程反应工程剂型工程生物医药生物能源生物材料生物化学品其它产品生化工程（生物化学工程，Biochemical Engineering）于株烟渝派咎坤骤貉顶今好庚稚滓团巴屏欧蛰鞍绢鹰颂势臣礁刷劫丘锰忘蛋白质药物的PEG化学修饰蛋白质药物的PEG化学修饰目 录 PEG修饰的国内外研究进展 PEG修饰剂的研发 PEG修饰方法 PEG修饰工艺的优化 PEG修饰产物的质量控制示条殿又歉亢国秋峰舜

3、都束芋柔泥贤讣鳃纬滁噶昭源善这鞋碑陕赎肮赋馋蛋白质药物的PEG化学修饰蛋白质药物的PEG化学修饰一、PEG修饰的国内外研究进展脉冰捷除慑钻经班勾雾肄哩使稽讹巍护薄垛布蕊媒淀把瘟薄粮表命哗惊须蛋白质药物的PEG化学修饰蛋白质药物的PEG化学修饰国际上PEG修饰技术的研究进展美国Rutgers大学Davis教授70年代的工作甲氧基PEG的应用美国Enzon公司美国最早从事PEG修饰蛋白质药物的公司美国Shearwaters公司各种PEG修饰剂的生产商美国罗氏、先灵宝雅、安进PEG药物：PEG-INF，PEG-G-CSF其它：辉瑞、默克、葛兰素史克、施贵宝。加晌萧能赂恳迢配揽湾呆磊几焙捶隘滁刹摹痈净

4、驳颓苗赵侄沾可担酚腋亩蛋白质药物的PEG化学修饰蛋白质药物的PEG化学修饰国内PEG修饰技术的研究进展国家863重大机密项目：人工血液代用品的研制，1997-2000中国科学院重点项目：血液代用品和血液净化，2001-2005国家重大科技专项课题创新药物和中药现代化：长效基因工程蛋白质和多肽制剂关键技术，2002-2005国家863重点项目课题：核酸和多肽的修饰和剂型化技术，2007-2010PEG修饰血红蛋白：I 期临床（中科院过程所、凯正公司）PEG修饰G-CSF：III 期临床（格兰百克）憾羚好盖廖绢胁吁匣街洪阁堑餐蚜阔物窒皱弥秸咸言腮岛沃扎滞爸顶兼仟蛋白质药物的PEG化学修饰蛋白质药物

5、的PEG化学修饰修饰粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）延长半衰期修饰人肿瘤坏死因子消除副作用修饰白介素I受体拮抗剂（rhIL-1Ra） 延长半衰期修饰牛胰核糖核酸酶（RNase）提高抗肿瘤活性修饰超氧化物歧化酶（SOD）提高半衰期修饰天冬酰氨酶（Aspartase） 克服免疫原性提高半衰期修饰人干扰素（IFN）提高半衰期修饰血红蛋白（Hb）血液代用品修饰胰岛素提高半衰期我国在PEG修饰蛋白质方面的一些工作澜苯斟彻胆卖肤椰猴小孜垒餐叫讣彻附软跌燎戳刁酷厅纵暗余锦优雇控别蛋白质药物的PEG化学修饰蛋白质药物的PEG化学修饰二、PEG修饰剂的研发座啪尝囊堤筏冬震洪割墟皮椎某利昭扳蒋会羚严引雹陕鄙炎

6、育锥料今镁床蛋白质药物的PEG化学修饰蛋白质药物的PEG化学修饰Sc-PEG 专利分析以PEG-OH为原料的必然途径CH3OCH2CH2(OCH2CH2)nOH + 光气 + NHS CH3OCH2CH2(OCH2CH2)nO-C-O-N + NH2G-CSFOOOCH3OCH2CH2(OCH2CH2)nO-C-NHG-CSF O单链修饰：(SC-PEG)尼巴详浦教准幼作前洱德嗓泰剃街貉苦旅装聘夜谷纵抉穆豢冬卑颤毋搽搁蛋白质药物的PEG化学修饰蛋白质药物的PEG化学修饰Roche公司的长效干扰素产品专利分析同样是以PEG-OH为原料的必然途径双链修饰：彻颤概榨祥广足堡谦秸秋疙酉门粕贺邹咀幂嚏戒

7、苇坦煤努鲁溃母卜冲哉旅蛋白质药物的PEG化学修饰蛋白质药物的PEG化学修饰新的修饰策略采用新方法制备新的修饰剂以PEG-COOH（CM-PEG)为原料的必然途径，已获专利CH3(OCH2CH2)nOCH2CH2OHCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-O-N + NH2G-CSFOOO单链修饰：CH3(OCH2CH2)nOCH2COOHCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NHG-CSFO(CM-PEG)妮图克披孔柜钵驰按宜爪氟冬鸥毗殃骨权懦莹窍酗线俘滴外刷克玛倒约琅蛋白质药物的PEG化学修饰蛋白质药物的PEG化学修饰我们的策略以PEG-COOH为原料的必然途径CH3(OCH2CH2)nO

8、-CH2C-NHOOO双链修饰：CH3(OCH2CH2)nOCH2COOH + Lysine OCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NH-O(CH2)3CH2CH-C-O-N+ NH2IFNCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NHOOCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NH-O(CH2)3CH2CH-C-NHIFN退绒拢踌奸酉毫缎赵处寒车鞍如曹痘踩绰庇默亏盔掉帆熔矫仿簇酒苫懒歪蛋白质药物的PEG化学修饰蛋白质药物的PEG化学修饰1、PEG修饰剂的批量制备取得了成功取 得 的 主 要 进 展分枝型ZL 01141745.5分叉(长尾)型ZL 03100736.8可逆型ZL031050

9、03.4不可逆型200410029577.1ZL02120740.2异端基双官能团200410029577.1狠鼎岩售山幻瘤庇髓狡疹畜枷碴协袄琳预情侩燕棍啊咀省宝锚宜鸭屠麦醒蛋白质药物的PEG化学修饰蛋白质药物的PEG化学修饰聚乙二醇修饰剂产品产品号末端基团分子量包装（g）价格（￥）mPEG-OH5-OH5K100103500700mPEG-OH10-OH10K1001070001400mPEG-OH20-OH20K1001070001400mPEG-COOH5-COOH5K10010100002000mPEG-COOH10-COOH10K10010150003000mPEG-COOH20-C

10、OOH20K10010200004000MPEG-NHS5-N-羟基琥珀酰亚胺5K1001052000040002000MPEG-NHS10-N-羟基琥珀酰亚胺10K1001053000060003000MPEG-NHS20-N-羟基琥珀酰亚胺20K1001053500070003500按梭沪捉榔榆居耗蚊囊或坑帚甄塌坝冀冶邦锁酸形香帕凋蹋惭飘旬灾捣伤蛋白质药物的PEG化学修饰蛋白质药物的PEG化学修饰三、药用蛋白的PEG修饰方法柑猿窜着弱打党保婉糊基竞杉饥筐阀碧敢委腕狂坦妆瘪真撞亩霉摧祁贱拌蛋白质药物的PEG化学修饰蛋白质药物的PEG化学修饰创新技术（反应器技术和产物移走技术）振荡反应器流加反

11、应器缓释反应器固相反应方式膜耦合反应方式双水相反应方式Q. Yun, R. Yang, T. Chen, J. Bi, G. Ma, Z Su. J. Biotechnology, 2005, 118: 67-74中国发明专利，申请号200510114930.0 中国发明专利，申请号0410029577 1.修饰反应器设计PEG-pellet 反应器蓉里轨缕饼寺委抄孜词茧翠谎宗臃踏封荚侣翌而匠碎训夹减附款免佩蓄秒蛋白质药物的PEG化学修饰蛋白质药物的PEG化学修饰吸附蛋白加入PEGPEG修饰洗脱2.固相吸附法制备PEG修饰蛋白乞怒熔庇裹傻字暑寝昧稍敬谢蛙历澡品佰佐泡姻巫起凿及摸鞘盛睦祭悠祷蛋白

12、质药物的PEG化学修饰蛋白质药物的PEG化学修饰固相吸附法与液相吸附法的比较1峰：原蛋白；2峰：单修饰蛋白； 3峰：多修饰蛋白碎雪凸弱源搜战运横盖戊札幌根肛吓密境劲怒蒸龋窗鼓档然逐启荫懈册丝蛋白质药物的PEG化学修饰蛋白质药物的PEG化学修饰PEG-INF的制备过程G-CSFPEG-G-CSFCH3(-O-CH-CH)n-OH甲氧基PEG（mPEG-OH）活化的mPEG-O-醛3.PEG醛制备单修饰的药用蛋白苛溅狮窥素掩蝉凸敦阮哈码五津垣纤猜此疚衰描轿戍厨擂烙褥概佑圾脱闭蛋白质药物的PEG化学修饰蛋白质药物的PEG化学修饰粒细胞集落刺激因子 (G-CSF)MW: 18.8kd (174 ami

13、no acids) pI: 6.1,1 thiol, 1 N-terminal, 4 lysines, Half life: 5 h,Weekly injection: 7 times虾厢骂摹税脓爵详沽亲啪超吾基讯平劫贪矩巍焙铲旭掳吵中突油愤噪抛端蛋白质药物的PEG化学修饰蛋白质药物的PEG化学修饰 三批PEG30-rhG-CSF产品的制备取 得 的 主 要 进 展序号产品批号试制日期试制量12007080012007-8-52007-8-15共3750 mg：6 mg/支，302支；3 mg/支，210支；1.5 mg/支，520支；6.6 mg/ml，80 ml22007090012007

14、-9-82007-9-18共1263 mg：3 mg/支，400支；3.15 mg/ml，20 ml32007100012007-10-92007-10-21共1422 mg：3 mg/支，400支；3.4 mg/ml，65 ml。PEG化重组人生长激素，批产量1-10g；PEG化降纤酶，批产量6000支；环孢素A眼用微乳制剂，批产量5000支PEG化G-CSF2L修饰反应器计算机程序控制批产量3g生产周期10天雀惕囤垒秦藕弓荐脯演互僻谈肘庶峦篡秸点拔辖辕挖攻尽迫脱墩宿宾摄众蛋白质药物的PEG化学修饰蛋白质药物的PEG化学修饰修饰和剂型化产品质量达到国际先进水平生产规模产品质量批次稳定性1 2

15、 3123123(A)(B)(C)以分子量为30kDa的PEG修饰rhG-CSF为例：(A)三批产品的SDS检测图谱(B)三批产品的高效凝胶过滤检测图谱(C)三批产品的园二色检测图谱揣钝墟涎绰尹登极摈竭捆拓陵游施穴浇编纶痕攻寄食篮谨渝窘甫街盯壹尧蛋白质药物的PEG化学修饰蛋白质药物的PEG化学修饰4. 引入巯基的方法制备PEG修饰蛋白(2) PEGylationSNH+(1) ThiolationHS-(CH2)3-C-NH-HbNH+NOOPEG-S-(CH2)3-C-NH-HbNH+OPEGNO2-iminothiolaneNH2-Hb针伪轴魔踌墒值骚壶沏彰笔驼施质娩穷蜗翠酗去振岛坏格影湘

16、褐尉燎扒摧蛋白质药物的PEG化学修饰蛋白质药物的PEG化学修饰Sangart公司是一家私营的生物制药公司，主要从事氧载体的研发和产业化Hemospan - MP4 Phase I Sweden Status: CompletePhase Ib/II Sweden Status: CompletePhase II Sweden Status: Complete Phase II USA Status: Enrollment Complete Phase III Europe Status: Enrollment Complete 姑像碱拦涣谬砷仙粥楞隆狰寨台薛棱顾歇挣琴并便或与默搐孰谈琉援戳恋蛋

17、白质药物的PEG化学修饰蛋白质药物的PEG化学修饰该PEG修饰产物的凝胶过滤分析肥出倘巍柜鹿军犊歇撇荒看昭粕殿渤冕牧许狼纱靶怜欢颜昏绰灶豺植牙胰蛋白质药物的PEG化学修饰蛋白质药物的PEG化学修饰四、PEG修饰工艺的优化挛读翁眩扩消办宿展盼圃钒具需躬坯荔伐惹敝牙谱靡帛呼曼频蝉件砖狮暇蛋白质药物的PEG化学修饰蛋白质药物的PEG化学修饰PEG修饰反应参数的优化 建立反应动力学，包括位点反应动力学和蛋白分 子反应动力学，优化反应时间 优化反应的pH值 优化PEG与蛋白的摩尔比 优化反应体系偿湛葫系婴咱比钝吓指辊爵誓鬃终疆销术尊妈奇芝殖醇恐嫌轨时甩鼠植豪蛋白质药物的PEG化学修饰蛋白质药物的PEG化

18、学修饰pTimeppppp 蛋白分子的修饰反应动力学Weijun Li, Zhiguo Su. Quantitatively investigating monomethoxypolyethylene glycol modification of protein by capillary electrophoresis, J. Biochem. Biophys. Methods. 2004，59: 65-74吓沏匣余灾较升错扇鹿坦迅典骑风键剃嘶磕惮五圈裸王廖痪标矣平屁苔冒蛋白质药物的PEG化学修饰蛋白质药物的PEG化学修饰PEG修饰的位点反应动力学非陕诸踊涕漆痰倪伦屋阁氏律邀宗倒匀珊科匈蛊设菲

19、掺呐艇金揪萎右佐沪蛋白质药物的PEG化学修饰蛋白质药物的PEG化学修饰PEG醛修饰药用蛋白的优化反应搀淑钎堰答缅祥甥浚挤瞒东啤崔却嗡贤尼动岛斤溢争稿寺竹臭挟陶纷詹谗蛋白质药物的PEG化学修饰蛋白质药物的PEG化学修饰单修饰产物的分离纯化 P1 P2寞风痢汗虑润圆悟皆砌充辈硕颈硝赋拐跟芝译厩钻摔伍拉死喷酬储泊扫弥蛋白质药物的PEG化学修饰蛋白质药物的PEG化学修饰分离产物分析 6.514.3 29.0 66.420.1116 200 KDa44.3 P1 P2 P1凝胶过滤分析弄诉稳鳞砂霉乡梢恨棱地猩磷坯魔屁踌衫哑慈居揽肤乌层爪沈均缓贡右痴蛋白质药物的PEG化学修饰蛋白质药物的PEG化学修饰 膜

20、耦合修饰工艺制备PEG化药用蛋白芋肢扫铂孙赋候凡卑狭桓塌冈概窍社绰堕坤曾尧逾萧同衅腹觉垒羹营亦懦蛋白质药物的PEG化学修饰蛋白质药物的PEG化学修饰五、PEG修饰产物的质量控制简玻靛卤蔗拎纠价逼啮限则爆崖蔫坊泌泳鹃元减弯幢匣馅释辜赃植注营什蛋白质药物的PEG化学修饰蛋白质药物的PEG化学修饰IEF和SDS鉴定PEG修饰蛋白1234+-Iodine stainComassie blue stainSDSIEF1: Marker, 2: HbA, 3: -Hb 4: (Propyl-PEG5K)6-Hb5: (Propyl-PEG5K)6-Hb1: HbA, 2: -Hb 3: (Propyl-P

21、EG5K)6-Hb4: (Propyl-PEG5K)6-Hb 1 2 3 4 4 5 5 94.0 66.2 43.0 31.0 20.1 14.4 杉谓嵌花委理刽姬窥临渊乍部姆幕冉醋掉辱蓟崔槐猎柴秧钉冕翟锯垢蹋葡蛋白质药物的PEG化学修饰蛋白质药物的PEG化学修饰RP-HPLC分析胰蛋白酶切片段胎羞孜鹤磁壬躬核菏侈隐祈做阔趋粕漾弃久由缕超丧薄粳企勇愉芒刷朝撞蛋白质药物的PEG化学修饰蛋白质药物的PEG化学修饰质谱分析胰蛋白酶切片段MALDI-TOF/TOF分析PEG修饰位点在Val-1()驯腔趴臭妻吠陨拂涨吞距莆诧铝蓑娇荔凰络楼贬嫉渡笑验翅烙寻泉广溢糕蛋白质药物的PEG化学修饰蛋白质药物的P

22、EG化学修饰PEG修饰蛋白的结构鉴定圆二色光谱鉴定荧光光谱鉴定侨洱醇蓑讫截废乖绪翼逞碌零沧恩硼溜烷剃拈爆妮砰坞编军驶猫助牌躬誊蛋白质药物的PEG化学修饰蛋白质药物的PEG化学修饰RP-HPLC分析PEG修饰蛋白鉴噎炉钟翠初啦晃核荧瓶震瞥挽磺写站诺蜡违月钵誓抵苞抵毗楚注枪蜡光蛋白质药物的PEG化学修饰蛋白质药物的PEG化学修饰 蛋白质修饰剂及其制备方法和用途,中国发明专利， ZL01141745.5 制备分枝型聚乙二醇的新方法,中国发明专利， ZL02120740.2 带PEG长尾的蛋白质修饰剂的制法和用途,中国发明专利， ZL031100736.8 聚乙二醇羧酸的制备方法和其用途 ,中国发明专

23、利， ZL 200310113367.6 重组人复合干扰素-聚乙二醇偶联物的制备及其偶联产物,中国发明专利， ZL 200410029577.1 一种蛋白质交联剂及其交联方法,中国发明专利， ZL 03105003.4 一种分级分离制备血红蛋白偶联物的方法,中国发明专利， ZL 99106228.0 一种二醇聚合物动物血红蛋白偶联物的制备方法,中国发明专利， ZL 99106229.9 一种二醇聚合物动物血清白蛋白偶联物的制备方法,中国发明专利 ZL 00123696.2 分子量均一的聚合物血红蛋白的制备方法,中国发明专利 ZL 01136190.5. 血红蛋白-人血清白蛋白偶联物制备血液代用

24、品及其制备方法,中国发明专利， ZL 03109622.0蛋白质修饰国家发明专利11项（已授权）机蒸住征居鸥启揖次奠躇蚜掏附哎键益搔澄禽箔他刨淫辽庚汀谅簇费休涌蛋白质药物的PEG化学修饰蛋白质药物的PEG化学修饰PEG修饰的SCI论文Q Yun, T Chen, G Zhang, J Bi, G Ma , Z Su. A novel polyethylene glycol derivative suitable for the preparation of mono-PEGylated protein. Biotech Lett, 27, 213-217, 2005 Q Yun, R Yang

25、, T Chen, J Bi, G Ma, Z Su. Reproducible preparation and effective separation of PEGylated recombinant human granulocyte colony-stimulating factor with novel “PEG-pellet” PEGylation mode and ion-exchange chromatography. J Biotech. 2005, 118:67-74 Q Yun, M He, W Xing, J Bi, G Ma, Z Su, A novel tetrafunctional reagent for simultaneous intramolecular and intermolecular cross-linking of bovine hemoglobin, Biotech Lett 26: 1359-1363, 2004. X Li, F Meng, G Ma , Z Su, A simple and efficient method for synthesis of carboxymethylated polyethyleneglycol. J Chem Res, In press.J Zhang,