食品质量安检测技术W430HLB柱、MCM柱在兽药残留检测中的应用-微教材

1、农产品与食品质量检测技术教学资源库农产品/食品质量安全检测技术课程-微教材微课编号W4404微课名称HLB柱、MCX柱在兽药残留检测中的应用所属模块兽药残留检测子模块M4-4兽用违禁促生长药物的检测 猪肉中瘦肉精（盐酸 克伦特罗、沙丁胺醇和莱克多 巴胺）的检测关键词固相萃取；HLB柱；MCX柱；瘦肉精；猪肉是否通用，通用 农产品 食品是否重点建设是 ，否微课类型讲授型，实验实训型微课形式混合拍摄式微课类型讲授型，实验实训型教学目标了解周相萃取前的样品处理目的和要求；掌握基质固相分散萃取与分散固相萃 取的概念和用途；了解固相萃取技术发展趋势；了解HLB柱特点及MCX柱特 点；通过猪肉中瘦肉精残留

2、的净化操作掌握固相萃取仪的操作。教学内容知识点技能点1、周相萃取前的样品处理2、基质固相分散萃取匕分散固相萃取3、周相萃取技术的展望4、HLB柱特点5、MCX柱特点1、周相萃取仅规范操作2、瘦肉精残留净化的规范操作一、周相萃取的概述1、周相萃取前的样品处理周相萃取利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，与样品基体和干扰化合物分 离，然后再用洗脱液洗脱，或加热解吸附达到分离和富集目标化合物的目的。是用高效、高选 择性的固体物质作为萃取剂进行萃取的样品预处理技术。周相萃取技术是基于固态（SPE吸附剂）与液态或气态样品之间的相互作用力而实现将目 标化合物从样品基质中分离出来的，这项技术的局限性之

3、一在于要求样品必须是液态或者气 态，因此如果样品是固态或者半固态，必须将其先制备为液体形态才能进行固相萃取操作。即1 / 12农产品与食品质量检测技术教学资源库使是液体样品，周相萃取也有其额外的苛刻要求， 即液体必须洁净度高，不能有悬浮物或其它 固体颗粒，否则会在柱前形成堵塞，无法继续过柱及洗脱操作。所以固体样品要制备成液体， 液体样品最好还要过滤。周相萃取前的样品预处理主要目的归为三点：1将目标化合物溶解在适当的液体中；2、通过预处理使目标化合物呈现被固相萃取柱保留的游离状态3、调节液体样品的pH值、离子强度和黏度。在建固相萃取方法过程中，样品基质的性质与目标化合物同样重要，因为样品基质的p

4、H极性或非极性特征，离子强度等对目标化合物在 SPE柱的保留产生影响。以生物组织的预处理为例，生物组织中有大量不溶于水和有机溶剂的蛋白质等组分，在分析前必须除去，同时目标化合物及其代谢物在生物组织中可能会与蛋白质生成共腕物，必须通过适当方法将这些化合物从蛋白质分子中释放出来。常用的方法有蛋白质沉淀，强酸水解，酶水解，超声波萃取，加速溶剂萃取及微波辅助萃取等。对于生物组织样品来说，周相萃取往往 不是萃取手段，而是净化手段。2、基质固相分散（MSPD）和分散固相萃取（d-SPE）基质固相分散（MSPD是1989年美国Staren Barker首次提出并给予理论解释的一种崭 新的SPE技术，可同时分

5、散和萃取固体、半固体样品。基于SPEWSPDE术，兼有SPE勺优点，而且在操作上比SPEE简便，提取、净化能一步完 成。减少样品损失。其基本操作是将试样直接与适量反相填料研磨、混匀制成半固态装柱淋洗。MSP掘缩了传统的试样前处理中所需的试样均化、组织细胞裂解、提取、净化等过程，避免 了试样均化、转溶、乳化、浓缩等造成的待测物的损失。是简单高效的提取净化方法。自提出 以来，MSPDft各个领域得到广泛应用，尤其是在食品中药物、毒物的安全分析中，显示出独 特的性能。2 / 12农产品与食品质量检测技术教学资源库amplei sad 1 spirting mate rid(II)Tranter io

6、 swinge barM and ccrnpress修即再E二 Uajnf，bkuJ m enliimnSTEPthrueJ C|tajntl 口OffllJSTEP MSPD eIkueih *rk1 TiMrkmh fkjVj&+! * 1 JI H际介了Olect mntcciilc款版hnpuriEieh以别他小Idcnlificahon sitciAAACA 1rAIAJ1中悔性错治:)Condilioibirtg(Mnpalar 号口 I vcni)Li A A A ATT 除的罐 1.极件溶剂 Was lyingnotwular iuhcn)沈照(出破件溶剂IElminn(pol

7、zr sotvfnlji图4.分子印迹固相萃取（MI-SPE）的4个步骤5 / 12农产品与食品质量检测技术教学资源库3、更加自动化、高通量随着科技的发展和检测需要，周相萃取正经历着从手工操作到自动化发展的进程，使操作人员从繁琐重复的劳动中解放出来， 提高分析结果的重现性。市面上已经出现全自动固相萃取 仪，能自动完成固相萃取的全部步骤， 以及出现圆盘式固相萃取柱可以增大检测量， 但仍属于 初步发展阶段，今后会有一批高通量、合适不同分析领域要求的自动化固相萃取仪器问世。3. 1全自动周相萃取仪吉尔森公司ASFK XLi 全自动固相萃取仪制SPE柱的萌处理, 上样、杂腾的洗涤出分析物的洗脱(可进行

8、单组分 收集，也可进行多组分收集)吉尔森公司全自动囿相萃取仪的工作原理iibiima niiil(C)对萃取物官动进行IIPLCLC-MS 分析图6.全自动周相萃取2圆盘式SPESPE0盘类似一张扁平过滤膜,厚度1mm直径约496mm dSPEM有比cSP刖对较大的横6 / 12农产品与食品质量检测技术教学资源库截面、固定相薄，这就使允许流速增大，萃取速度也增大，特别适合环境样品如水中痕量有机 物的分析，可以加大样品体积以提高检测灵敏度。图7.圆盘式SPE4、更加小型化、简单化小型化简单化是样品前处理的发展趋势，固相萃取技术也在不断朝该方向努力，如瑞典公 司开发的微固相萃取技术，填充吸附剂微萃

9、取（MEPS将1m酮相吸附剂装填在注射管或注射 针头与针管之间的萃取节中，操作方法同吸嘴型固相萃取相似，主要用在生物液中药物的萃取。还有固相微萃取（SPME）技术，SPMESP豉术发展而来，是根据吸附-解吸原理，由萃取 头（纤维）吸附样品中挥发性或半挥发性有机污染物， 吸附一定时间后，取出萃取头，置于气相 色谱或高效液相色谱等仪器进样口， 进行热解吸（Gc）或溶解（HPLC）o其显著优点是集萃取、净 化、浓缩、进样功能于一体，操作简单、所需时间短、无需溶剂、用样量少、选择性强、容易 实现自动化，是极具发展前途的农药残留分析前处理技术。0图8.固相微萃取5、多种前处理技术结合，在线联用多种样品前

10、处理技术结合，特别是将不同的自动化样品前处理仪器结合在一起，如加速溶7 / 12农产品与食品质量检测技术教学资源库剂萃取与固相萃取一起，微波辅助萃取与固相萃取一起，超临界萃取和固相萃取一起等。并连 接到分析仪器上，是样品从前处理到分析实现真正意义上的自动化将是分析领域的一个发展方 向。如超临界周相萃取SFE以超临界流体（CO2为洗脱液，使SFEJ口SP的合为可用于液体样 品萃取的整体萃取技术。以超临界流体作流动相，直接从固体（粉末）或液体样品中将目标物 质（有机物）萃取出来的一种分离方法。在线联用技术是样品制备和处理技术发展的另一方向，可减轻劳动强度，节省人力，而且 可以防止人工操作产生的误差

11、，提高灵敏度、准确度与重现性。SPE柱 泵H4样品溶液固相萃取与高效液相色谱联用装置图 9.LC-SPEg边学边练、任务：HLB柱和MCX柱净化猪肉中瘦肉精的提取液样品：猪肉参考标准：国标标准GB/T 21313-2007:动物源性食品中自受体激动剂残留检测方法（液 相色谱-质谱/质谱法HPLC-MS/MS ）猪肉中的盐酸克伦特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺的残留进 行测定。首先了解B-受体激动剂的结构特点。B -受体激动剂具有苯乙醇胺结构母核， 为苯乙醇胺类物质。按照苯环上取代基的不同，可 分为苯胺型和苯酚型，而苯酚型 B-受体激动剂又分为邻苯二酚型、间苯二酚型及水杨醇型， 结构如图10所示。B-

12、受体激动剂的母核结构及主要化合物列于表 1。可以看出B-受体激动 剂含有羟基，呈弱碱性。8 / 12农产品与食品质量检测技术教学资源库一 f”O)-CH一NH甩/ R. R,段图1苯酚型受体激动剂分子姑构图片称RiRiR3R4Rs笨酣型沙胺醉CHiOHOHHHc3CHs莱克专巳胺HOHHHHCH2-CH2-P-OH苯胺型克伦挣罗C1nh2ClHch5ch51天.-受郎激前手.，的母核赤陶,及其E登正合物HLB是一种全能型亲水亲脂平衡的水可浸润性的反相吸附剂，即使填料抽干，HLB仍可保持高保留性能和重现性。HLB是由亲脂性二乙烯苯和亲水性 N-乙烯基叱咯烷酮两种单体按一定 比例聚合成的大孔共聚物

13、，为反相吸附剂，通过一个 特殊的极性捕获基团”来增加对极性物质 的保留，并提供很好的水浸润性。主要用于酸性、中性和碱性化合物的通用型吸附，包括巴比 妥类，抗生素，吹类，咖啡因，染料，芳香油，脂溶性维生素，杀菌剂，除草剂，苯酚，类固 醇，表面活性剂，维生素，磷酸酯、药物代谢物等。MCX固相萃取柱MCX是一种混合型强阳离子交换反相吸附剂。MCX提供了双重保留模式，即离子交换和反相，保留作用发生在一种洁净、稳定、高表面积，在 pH0-14范围内 稳定的共聚物上。MCX柱对碱性化合物具有高的选择性和灵敏度，可耐受有机溶剂。可用来 分离塑料制品，食品或生物基质(如血浆、尿液及组织匀浆)中的碱性化合物，如

14、苯丙胺，奶 粉及奶制品中三聚鼠胺、扑尔敏等。9 / 12农产品与食品质量检测技术教学资源库图ll.Waters Oasis柱的官能团结构为什么选用这两种固相萃取柱？HLB是亲水亲脂的填料，对极性和非极性的物质均有较好的吸附作用，对含有羟基（非 极性基团）的有机物，有较好的保留作用。具有高回收率，高吸附容量，是用于酸性，中性和 碱性化合物的通用型吸附剂通过对 HLB柱的使用可以获得更干净的本底。MCX柱为混和弱阳离子交换柱，通过疏水相互作用和阳离子交换使有机物保留，对碱性化合物具有高选择性和高灵敏性，适于吸附弱碱性化合物。根据,受体激动剂的结构特点，本实验采用这两种固相萃取柱猪肉提取液中的瘦肉精

15、 可以达到良好的净化作用。二、操作技术要点：前面，我们已经将猪肉中的瘦肉精进行了提取操作，接下来看下净化部分。HLB柱净化活化。将HLB固相萃取柱在固相萃取仪上安装好，使用前用 6mL甲醇、6mL水活化， 大约各用两管，一管即为液面刚好达到萃取柱的柱口 。过柱。将猪肉提取液以2mL/min3mL/min的速度过柱，弃去滤液。此时不开真空泵， 以防止流速太快，出现待测样未被萃取完全吸附，从而导致测定结果偏低的情况。淋洗。用2mL 5%甲醇淋洗，小柱抽干。此时应开启真空泵，将固相萃取柱尽量抽干， 以除去水分。否则洗脱液中会含有水，氮吹较难将水吹干。洗脱。装上3支10mL离心管，用6mL甲醇洗脱，收

16、集洗脱液。此时应开启真空泵， 将萃取柱尽量抽干10 / 12农产品与食品质量检测技术教学资源库氮吹。洗脱液用氮气吹至近干。调整氮吹针距液面1cm左右，调整合适的氮气流量，吹至近干。复溶。用大约3mL0.1mmol/L高氯酸溶液溶解残渣，采用漩涡振荡混合均匀，供 MCX 柱净化用。MCX柱净化活化。将MCX柱在固相萃取仪上安装好，使用前用 3mL 5%甲醇氨、3mL甲醇、3mL 水、3mL 0.1mmol/L高氯酸（pH4.0）溶液活化。过柱。将刚才用HLB柱制得的溶液过柱，弃去滤液。淋洗。用1mL甲醇淋洗，此时可不抽干，再用1mL 2%甲醇水溶液淋洗。此时需要抽干， 否则将造成结果偏小。洗脱。

17、最后用7mL 5%甲醇氨洗脱，收集洗脱液于10mL离心管中。注意控制流速，流 速不宜过快，应使洗脱液成滴流下，最后要用真空泵抽干。氮吹。洗脱液用氮气吹至近干。氮气吹干实际是个富集浓缩过程，在惰性的氮气流中将溶剂吹干，既可以保护被测物质， 又可以将其浓缩，加大浓度，以备上机检测之用。复溶。用甲醇-0.1%甲酸水（5+95）定容至1.0mL,漩涡混合1min,将样液用巴氏管转 移入进样瓶中，用于HPLC MS/MS测定。扉TII拓展阅读周相萃取技术就是利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，与样品的基体和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱或加热解吸附， 达到分离和富集目标化合物的目的。 该技术

18、 基于液-固相色谱理论，采用选择性吸附、选择性洗脱的方式对样品进行富集、分离、纯化， 是一种包括液相和固相的物理萃取过程： 也可以将其近似地看作一种简单的色谱过程。 在此过 程中。首先要选用适当的溶剂对吸附在吸附剂上的干扰物进行洗脱，然后再用洗脱剂对目标物质进行洗脱，最终得到目标物质。与传统的液-液萃取方法相比，SPE显著的优势为：提高样品处理量，大大减少溶剂的消耗和废物的产生，回收率高，重现性好，极低的杂质干扰，无乳 化现象，多种分离模式选择，易于实现自动化。（缺点需要预先知道吸附、解析条件，否则需要摸索条件。）常用的固相萃取柱的类型有极性柱、非极性柱、阳离子交换柱、阴离子交换柱、共价型柱11 / 12农产品与食品质量检测技术教学资源库等。根据目标化合物性质和样品类型选择合适的固相萃取柱和淋洗剂。影响固相萃取效果的主要因素有：吸附剂类型及用量、水样体积、洗脱剂类型等。尽量选 择与目标化合物极性相似的吸附剂，正相吸附剂保留极性有机物，反相吸附剂保留非极性有机 物或弱极性有机物，阴离子交换树脂则适用于离子型的有机物。洗脱剂体积应以淋洗完全为前 提，体积最小的为最佳。样液中pH值也影响吸附效率。在吸附