RNAi与基因沉默课件

1、RNAi与基因沉默 朱启顺 第一章 绪论 一、基因沉默 1.基因沉默： 基因沉默可以分为两大类,第一类:位置效应(position effect),由于外源基因插入基因座(loci)两侧的或插入特定的染色质部位对插入的基因起到了负影响所致(异染色质区)；第二类是由于多拷贝的外源基因存在于同一染色体中而诱发的一种表遗传失活(epigenetic inactivation)现象,由于是同源或互补的序列所诱导,所以也称为同源依赖的基因沉默(homology dependent gene silencing, HDGS)2转录水平的基因沉默(transcriptional gene silencing

2、, TGS)： 转录水平的基因沉默是指由于的修饰(如甲基化等)等原因使基因不能正常转录,而导致外源基因不能表达；3转录后水平的基因沉默(post- transcriptional gene silencing, PTGS)： 转录后水平基因沉默是指外源基因在核内能够正常转录甚至超常转录,但是转录产物在细胞质中的积累却很低或根本检测不到。一般来说,同一染色体上的两个同源基因相互作用所产生的顺式沉默、不同染色体的两个同源基因所产生的反式沉默,以及DNA甲基化所造成的沉默都属于转录水平上的沉默。而由反向重复序列产生的双链RNA(double strand RNA, dsRNA)所诱导的沉默或由单拷贝

3、转基因所产生的异常RNA(aberrant RNA)介导的沉默都属于转录后基因沉默。 反式沉默: 一些转录上的沉默现象可以被同一转基因植物上存在于基因组不同位置的同源启动子之间的相互作用所激发；或者被某一复合转基因位点上不同部分之间的相互作用所激发。其它的似乎与转基因在染色体上插入的位置和插入位点周围的序列有关 。顺式沉默 同一染色体上的两个同源基因相互作用所产生的二、基因沉默与RNA干扰的发现 PTGS和RNAi是在研究植物，蠕虫等真核细胞的遗传转化中发现的，在研究过程中发现，尽管转基因编码的mRNA的转录水平很高，但是其同源性内源基因的mRNA的表达却很低或没有表达。1.转基因沉默2.共抑

4、制现象.三、RNA干扰的机理 第一步靶mRNA的dsRNA的产生， 第二步是dsRNA的识别以及2123bp的小RNA（siRNA）的产生，至关重要的一步是siRNA对靶mRNA的识别与选择性地降解mRNA。1.植物体内基因沉默 植物 位置效应 转基因沉默 （拟南介）2. 线虫 dsRNA 基因沉默3.果蝇 RNaseIII siRNA 基因沉默4. 鼠胚胎细胞 siRNA 基因沉默 （ dsRNA能够引起正常细胞的非程序性凋亡）4. RNA阈值模型(RNA threshold model) ： Lindbo 等认为RNA 干涉是细胞质中mRNA 的监控系统,当某种mRNA 超量表达时,监控系

5、统就将这种超量表达的mRNA 降解。5.异常RNA模型(aberrant RNA model)： 转基因DNA和RNA相互作用或内源和外源基因DNA间的相互作用导致基因转录区域的甲基化，产生异常RNA，异常RNA触发所有相关转录物的特异性降解 6.分子间(内)碱基配对模型(inter-or intra-molecular base pairing model)： 指转录物间的碱基配对以及转录物内的碱基配对造成同源转录物的降解。7.RdRP模型： 在线虫中，小量的dsRNA能够使大量的靶RNA沉默，这种现象至少有三种机制：A、Dicer酶将长dsRNA分子切成短的“初级”siRNA，因为每一个s

6、iRNA具有结合一个同源mRNA的能力，效应的放大水平取决于dsRNA的长度。B、siRNA在酶作用中，可多次应用，能提供进一步放大。C、短RNAs可作为靶mRNA的引物启动一个RNA诱导的RNA聚合反应，产生次级siRNAs8.沉默复合体（RISC）： 由Dicer酶，Argonaute蛋白，siRNA等多种生物大分子装配而成。 Argonaute蛋白： 是一个高度保守的家族,该家族包括许多成员,它们组成了RNA诱导的沉默复合体的核心元件,是RNA干扰所必须的。其包括两个结构域:PAZ和PIWI两个结构域， Argonaute蛋白选择性地与miRNA和siRNA结合,并与Dicer酶相互作用

7、,其PIWI域与Dicer的RNase结构域直接相互作用,PIWI与Dicer之间的相互作用可能会促进miRNA/siRNA的释放。Argonaute蛋白很可能是RNA干扰中核酸内切酶活性的执行者。9. Dicer: 是RNase III家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因，病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(siRNAs)，每个片段的3端都有2个碱基突出。 它包括一个氨基终端 域、PAZ 域，二个核糖核酸酶III 域, 和一个 dsRNA 结合域。 PAZ：含100个氨基酸，能够调节底物与Ar

8、gonaut蛋白的相互作用。10.参与基因沉默的基因： A、线虫：rde-1 B、链孢霉：gde-2 C、拟南介：ago-1 RNAi干扰模式图 四、RNA干扰所涉及的技术 一般来说，任何克隆的基因都可能成为寡RNA的靶，不管该RNA是人工设计的，还是RNA表达的病毒载体，只要其与靶基因转录的mRNA具有序列互补性即可。下面将RNAi主要涉及到的技术做一般的介绍1. 干扰RNA（siRNA）及合成原则： A、一般选择的区域是以靶基因转录物的AUG起始密码子下游50100bp处开始选择siRNA作用位点; B、5和3非编码区和起始密码子附近区域应尽量避免，因为这些区域或是编码调节蛋白结合位点、非

9、编码区结合蛋白或翻译起始复合物的区域，它们可能对RISC复合物的形成造成干扰，而削弱了RNA的作用。C、找出起始密码子下游的AA二连序列 ，将连同其后19个bp一起作为siRNA的作用位点。D、DNA模板可来源于质粒、PCR产物和寡核苷酸链，与普通模板所不同的是，改进的DNA模板必须含有启动子，启动子区域是RNA聚合酶结合和RNA开始合成的部位。D、RNA聚合酶是体外转录合成siRNA的关键性酶，常用的RNA聚合酶有T7、T3、SP6，它们都以DNA为模板，并要求有特异性的启动子序列。每个RNA聚合酶对应的启动子共有序列如下： T7 TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GA

10、 SP6 ATT TAG GTG ACA CTA TAG AAG NG T3 AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA GA RNA聚合酶与双链的DNA启动子结合后，它将打开双链DNA模板合成互补于DNA的RNA链。2. RNAi质粒和病毒载体的构建 在进行RNAi研究中为什么要用到表达质粒和病毒载体呢？A、一个主要的原因是表达载体可以在细胞中持续产生siRNA以达长久抑制靶mRNA的目的。B、特定的病毒载体对特定的细胞非常有效，尤其是对后有丝分裂的细胞特别有效，能增加细胞的转染率。C、就病毒载体本身而言，其可以在细胞中持续进行表达。 Brummelkamp等研发了一种新的载体系

11、统，该系统能够在哺乳动物细胞系中进行siRNAs的稳定表达，他们使用的是聚合酶III H1-RNA基因启动子。A、该启动子能够产生一段尾端不带多聚A，有精确转录起始和终止信号的小RNA。B、该设计还包括一个插入子，该插入子来源于靶转录物、具有序列特异性大小为19bp，这一插入子被一短小的间隔子（spacer）与一段序列相同，但是反向互补的19bp的核苷酸序列所分开，C、这样就形成了19bp配对的茎环结构。Brummelkamp等所构建的载体系统可以在不同类型的培养细胞中获得对靶基因表达的有效抑制。 目前已有许多研究小组成功地构建了包含U6启动子控制下的，合成siRNA的DNA模板的质粒。 3.

12、 转染方法 传统的寡脱氧核糖核酸和DNA质粒导入细胞的方法已成功地用于siRNAs导入细胞的研究，然而到目前为止还没有一种siRNAs的转染方法能适宜对所有细胞类型的转染，所以必须优化转染条件以便获得最理想的基因沉默。 A、利用钙磷酸盐介导的转染已在一些研究中获得成功；B、利用脂质体介导siRNA对粘连的和不粘连的癌细胞进行转染以沉默ErbB3基因，结果发现在对没有粘连的细胞进行转染时没有获得成功。 五、RNAi在功能基因研究方面的意义 RNAi技术已广泛用于对培养细胞和活体的研究，研究的最终目的是了解单 个或多个蛋白质的最终功能，经过几年的研究，证明RNAi是一种研究细胞功能基因强有力的工具

13、。 1. RNAi在动物功能基因组研究中的应用2. RNAi在植物功能基因组研究中的应用3. RNAi在信号传导中的研究 最近的一些研究已经证实了siRNA介导的信号蛋白敲除的有效性并阐述了这类蛋 白质在细胞生物学反应中所扮演的角色。 4. 细胞周期调节的研究 目前，有一些研究小组利用siRNA技术敲除一些细胞周期中相关的基因，来研究这些基因在细胞周期中所起的作用。A、Stucke等证实了Mps1激酶在纺锤体组装中起关键作用；B、 Ohta等发现了一个新的，命名为Cep135的中心体蛋白，该蛋白在微管的组织过程中起关键作用。C、Boehm等证实了调节细胞周期的依赖细胞周期蛋白的激酶抑制子p27

14、（cyclin-dependent kinase inhibitor p27(Kip1)）,利用RNAi技术沉默Pik1，结果发现随着Pik1的剔除，细胞中的细胞周期蛋白B被激活了，细胞周期蛋白B的激活抑制了中心体的扩展。5. 生物体发育的研究 生物体从单细胞的受精卵迅速地发育成多细胞的组织、器官和完整的生物个体，这其中包含了细胞的迅速增殖与分化等复杂的变化与生物化学的反应，在此过程中留下了许多人类未解之密。在这一研究领域为RNAi的应用提供了广阔的舞台，人们正试图利用有关RNAi的技术来揭示生物体发育，细胞分化等过程中的细胞与分子机理，更好地了解生命的实质。6大分子合成与降解的研究7细胞运动

15、的研究8细胞的凋亡研究凋亡细胞：的形态学特征主要是核固缩、胞质浓缩、胞体急剧变小、细胞骨架解体，最终形成凋亡小体。 A、Kartasheva等利用siRNA沉默了p73基因，从而阻止了细胞的程序性凋亡，他们通过进一步的分析，发现p73基因在p53基因介导的细胞程序性凋亡过程中起着关键性的作用；B、Peng等以人类的成纤维细胞作为研究对象，用siRNA对细胞中的DNA依赖蛋白激酶催化亚单位进行了沉默，结果发现DNA依赖蛋白激酶催化亚单位的缺失增加了成纤维细胞对放射诱导性死亡的敏感性，因为这种酶的缺失影响了对DNA放射性损伤的修复和识别的能力。 9病毒入侵与复制的研究 人们利用RNAi技术来证实病

16、毒入侵细胞过程中RNAi的作用机理，并揭示病毒入侵细胞过程中分子间的相互作用。利用有针对性的siRNA来处理相关病毒和不同类型的培养细胞，可以证实靶蛋白在病毒入侵细胞以及在细胞中复制方面所起的作用。 六、RNAi在医疗工作中的应用 RNAi在医学方面最常见的应用是，利用RNAi技术选择性的剔除一种或多种特殊蛋白质以达到减慢或终止疾病的目的。从目前研究的情况来看，虽然从基础分子生物学的角度来讲，利用RNAi来治疗疾病可供选择的靶基因很多，但理想的主要集中于对癌症，感染性疾病，心脑血管疾病和神经退行性紊乱等方面的研究，目前也主要集中于对这四类疾病的RNAi临床前研究。1癌症的研究2. 感染性疾病的

17、研究3. 心脑血管疾病的研究4. 神经退行性紊乱 七、RNAi在生物与医学研究中的前景 RNAi现象的发现及其作用机制和功能的初步阐明,为RNA的研究展现了一个新的领域,为RNAi的应用提供了理论基础,给基因功能研究和疾病的基因治疗带来了新的希望。RNAi技术主要应用于研究基因功能,通过RNAi特异性抑制基因的表达来揭示基因在生物体的特定功能；它还可用于研究和开发基于RNA的基因治疗药物。 第二章 RNA干扰的生物化学 发现RNAi后不久, 在秀丽线虫，拟南芥（Arabidopsis thaliana）, 粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）, 莱茵衣藻(Chlamydomonas

18、 reinhardtii) 和黑腹果蝇中的遗传筛选，鉴定了转录后基因沉默（PTGS）需要的基因。这些研究有助于RNAi路径的确定，但是要认识RNAi路径只有通过生物化学分析的方法，详尽地认识单个蛋白质在干预过程中的确切作用，最终了解组分蛋白结构域的确切功能。在此基础上才能了解这一机理，全面认识RNAi完整的生化基础。RNAi的生物化学研究也有生物学和科技上的意义。 一、RNA干扰的生物化学 1. 活体中RNAi的早期研究 最早的RNA沉默是在研究植物的过程中发现的，但是dsRNA作为基因沉默的激活物则是由Fire等在以秀丽线虫为研究材料的实验中首次得到证实的。尽管秀丽线虫是最早且一直被用作RN

19、Ai遗传分析研究的材料，但后来一直都没有有力的证据证明，线虫在RNA沉默的生化研究中的独特作用。2. RNAi研究的生化模型 通过检验RNAi每一步生化反应所涉及到的对三磷酸腺苷(ATP)的依赖性，并利用路径中的中间物（intermediates）来激活RNAi，以及用经典的生化分馏法提取产生RNAi所需要的蛋白质酶和蛋白质-RNA混合物，来分析这些物质在RNAi路径中所扮演的角色。这些研究证实：A. 通过在体外的实验证实了这样一个事实，即特异性的dsRNA是使靶mRNA降解的真正物质；B. 在体外的研究还证实了，长的dsRNA进入细胞后，被特异性地降解为大约长22个核苷的短干扰RNA（siR

20、NA）；C. 体外实验进一步证实了siRNA是RNAi路径中沉默靶基因的关键物质。 在RNAi的反应中，siRNAs指导 RNA-蛋白质复合体即RNA诱导的沉默复合体（RISC）的形成， RISC是最终降解靶mRNA的物质；D. 体外研究表明，以siRNA为基础形成的 RISC 指导核苷酸内切酶在磷酸二酯键切割靶RNA，其在靶RNA上的位置取决于它与siRNA 5端的距离；E. 对无细胞的细胞提取物的研究证实了与RISC相关活性物（RISC-associated activities）完全能够降解靶mRNA；F. 利用人工合成的siRNA能够成功诱导靶mRNA的降解；G. 说明RNAi是一种普

21、遍存在的现象。H. RNAi的每一步生化反应均涉及ATP 二、RISC：RNAi的催化引擎 RISC是一种核糖核蛋白复合体，是由核酸内切酶，核酸外切酶，解旋酶和siRNA等组成，其中的一个成分最近在果蝇中被确定，它是Argonaut家族中4个成员之一的Argonaut2。RISC具有切割mRNA活性的复合体，切割发生在与siRNA同源的mRNA上，这样靶mRNA被切割降解，最终不能再翻译成相应的蛋白质。但是来源不同的RISC，它们的大小有很大的差异。1. 线虫： 在线虫中Arg基因家族中的rde-1、alg-1、alg-2与RNAi密切相关2. 拟南介： 在拟南介中Arg-1、Arg-4与RN

22、Ai密切相关 3. 链孢霉 在链孢霉中qde-2(Arg基因家族的同源基因）与RNAi密切相关；4. 果蝇 在果蝇中人们鉴定了4个与RNAi有关的Arg基因，分别是Arg-2、vig、FXR和TSN Agg蛋白是进化上非常保守的蛋白质，机会存在于所有的真核细胞，是RNAi机理中关键的组成成分 三、Dicer与siRNA siRNA 双链体有21-25个核苷酸长，双链结构有 2个核苷3突出端。每条siRNA链有一个5磷酸化末端和3羟基末端。siRNA的结构为探索其起源提供了强有力的线索。其中有一个特异性的dsRNA核糖核酸酶家族RNase III 家族与之密切相关。 在实验研究中发现该类酶裂解产

23、生的产物的特征与siRNAs极为相似。siRNA是RNAi复合体中的组成成分，可以通过果蝇胚胎溶解物中的dsRNA片段裂解成siRNA来获得小RNA，这一反应过程需要ATP的参与。 Dicer 是RNAase 家族中的一员，主要切割dsRNA或者茎环结构的RNA前体成为小RNAs分子。对应地，我们将这种小RNAs分子命名为siRNAs和miRNA. Dicer有着较多的结构域，最先在果蝇中发现，并且在不同的生物体上表现出很高的保守性。A. 推测Dicer含有一个或多个dsRNA特异性的核酸酶功能区 B. 因为在实验中加入ATP可以提高siRNA的产量，故认为这个酶有一个ATP结合区（ATP-b

24、inding motif）。C. RNaseII酶 在Dicer中，主要还包括含有串联核酸酶区域的RNaseII和RNaseIII酶。在接近RNaseII酶的羧基未端有两个RNaseIII的功能区。 D. RNaseIII酶 在靠近RNaseIII酶的氨基末端处还有其它结构域。尤其是RNaseIII酶有一个依赖于ATP的解螺旋酶和PAZ结构域，RISC复活体中的Argonaute家族蛋白质也发现有PAZ结构域。E. 生化分析表明,体外实验以及培养的果蝇细胞中由dsRNA 到siRNA 中RNaseIII 解旋酶蛋白(又称Dicer 酶) 需要多个结构域 。它包含依赖于ATP 的RNA 解旋酶结

25、构域,一个Piwi/ Argonaute/ Zwille(PAZ) 结构域酶、串联的RNaseIII 结构域和一个dsRNA 的结合区(dsRBD)。Argonaute蛋白家族: 是小RNA复合物的主要成分，它们在真核生物中是保守的。Argonaute家族具有PAZ（Piwi Argonaut and Zwille）和PIWI结构域。从结构和生化方面的研究表明，Argonaute蛋白能够与小RNA直接发生相互作用，作用部位是PAZ结构域与小RNA的3端,PIWI结构域以及中间的一个结构域与小RNA 5端发生作用。小RNA分子指导Argonaute蛋白找到它的靶位点,从而导致了基因沉默。 四、D

26、icer与miRNA microRNA (miRNA)是一类在真核生物中广泛存在的大小约22 nt的非编码小分子单链RNA，它可以通过对靶标RNA的剪切或抑制靶标RNA的翻译调控靶标基因的表达。miRNA不仅参与了植物器官的形态建成，还参与调控植物的信号转导系统等与生长发育相关的基因表达调控过程。与植物抗病毒RNA沉默途径一样，miRNA途径也受到病毒沉默抑制子的干扰。 1. siRNA 与miRNAA. miRNA 介导的基因调控是生物体内除了siRNA 引起的RNA 沉默之外,另一条小RNA (small RNA, sRNA)调控路径。B. miRNA 最重要的功能之一是控制转录因子, 从

27、而调控生物体的正常发育。C. miRNA 还可以将诸如蛋白水解代谢离子运输以及信号转导途径中的多种mRNA 作为靶点进行降解或阻止翻译。D. siRNA 是由反向重复序列病毒复制或RDR (RNA-dependent RNA polymerase)合成的dsRNA产物在Dicer 作用下产生的。E. miRNA 与siRNA 在化学性质和作用效果上极其类似但又有着本质上的不同。 近年来的研究发现,miRNA 在代谢上与siRNA 共享着一些相似的蛋白和路径, 如都是Dicer 蛋白加工的产物, 都需要解旋酶的参与, 所结合的复合体siRISC 和miRISC (或称miRNP, miRNA-r

28、ibonucleoprotein complex)都包含有至少一个Agonaute 家族蛋白。F.miRNA与siRNA 的来源不同, miRNA 来自于基因组DNA 的非编码区, 存在于小的单链发夹状转录前体, 是内源性的。G.siRNA 也可以由内源基因产生,如由DCL3(Dicer-like) 产生的siRNA; 其他siRNA 来源于外源核酸入侵或病毒复制形成的双链RNA。H. miRNA 存在于前体的一条臂, 最终产生的是单链RNA, 结合于miRNPs(miRISCs)复合物而行使功能。I. siRNA 初为双链,能精确识别位于外显子区域的互补靶序列, 并可能由反义链和RISC 组

29、成siRNA-RISC(siRISC)复合物, 最终导致靶序列的降解而诱导RNA 沉默。J. 在作用方式上, siRNA 介导的沉默最终导致靶标RNA 的降解, 而miRNA 介导的RNA 调节可以是对靶标RNA 的剪切或对靶标RNA 翻译的阻遏, 这主要取决于miRNA 与其靶标mRNA 的序列互补的程度。2. miRNA 具有以下几个特征:A .成熟的miRNA是一类1925 nt 的小RNA ,可通过Northern 印迹检测到； B. miRNA 能够互补配对结合于基因序列的侧翼区域； C. miRNA 一般来源于染色体非编码蛋白区域； D. 由核酸酶Dicer 作用于前体的双链部分生

30、成单链的miRNA。E. miRNA 最重要的功能之一是控制转录因子, 从而调控生物体的正常发育。 与的作用模式图五、哺乳动物细胞中RNAi的生物化学特性 哺乳动物的RISC介导的靶mRNA的裂解发生在单一磷酸二酯键上，靠近反义siRNA链的中心。Gem3和Gem4也是SMN（survival of motor neurons）复合体的组成成分，SMN复合体是snRNP（small nuclear ribonucleoportein）生物发生所必需的成分。SMN复合体与RISC的明显区别是SMN复合体中的SMN蛋白质与两个eIF2C 中的任一个有同源关系。 研究人员在哺乳动物细胞中发现了一个复

31、合体，其组成成分与果蝇的RISC成分相似，在这类哺乳动物细胞中，通过转染siRNAs能够激活RNAi。这个复合体包括siRNA或miRNA，一个Argonaute家族成员（eIF2C/Ago-1），VIG (内含子基因蛋白质)哺乳动物的同源体，脆性X金属阻遏蛋白(the Fragile X mental retardation protein)和与RISC有关的和哺乳动物同源的微球菌核酸酶族（P100）。 六、不同生物种中的RNAi 人们推测在线虫细胞中具有放大初始dsRNA的机制，放大后的dsRNA所产生的siRNA可以弥补每个细胞周期对siRNA稀释效应，使得线虫的RNAi能持续许多代。在

32、植物中观察到沉默信号的“传播”（spreading）而不是RNAi传递。 七、RNAi 与人类疾病 八、RNAi与基因组 RNAi技术已广泛用于对培养细胞和活体的研究，研究的最终目的是了解单个或多个蛋白质的最终功能，经过几年的研究，证明RNAi是一种研究细胞功能基因强有力的工具。同时，随着基因组测序工作的深入开展,人类已积累了大量的基因序列数据,而这些序列大部分缺乏明确的功能注释,后基因组时代的到来使确定基因功能这项任务更为迫切。如今人们对于某个基因功能的认识一方面通过分离突变体与野生型进行比较来确定；另一方面通过以基因阻断技术为基础的遗传学方法获得。近年来基因阻断技术在机理和功能研究中都有很

33、大进展,显示了良好的前景。目前基因的阻断主要在DNA和mRNA两个水平。前者主要包括基因剔除及DNA陷阱,后者主要有反义技术,肽核酸及RNAi。RNAi就是最近几年发现和发展起来的新兴基因阻断技术。九、RNAi 在动物功能基因组研究中的应用 目前,RNAi作为研究基因功能的有力工具,已在线虫、锥虫、果蝇、涡虫、水螅、低等脊椎动物(如斑马鱼)以及哺乳动物基因功能研究中获得成功。 Ravi等利用喂养表达dsRNA的大肠杆菌方法,从秀丽线虫1号染色体构建的粘粒库中,随机挑选了86个基因,从产生的表型中鉴定了13个基因的功能。 Momoyo等利用RNAi技术筛选线虫胚系发育相关基因,从消减杂交cDNA

34、文库中检测了168个克隆,共获得15个阳性克隆,为进一步研究虫体发育机制打下基础。 Harborth等则利用siRNA在培养的哺乳动物细胞系中鉴定了大量细胞生长所必需的基因,包括以前认为非必需基因如核纤层蛋白B1和B2、胞浆动力蛋白、蛋白激酶cdkl、肌动蛋白和等。 Fraser等与Gonczy等人在研究RNAi中利用RNAi特异性这一优点,合成了上千个与开放读框相应的dsRNA，并在细菌中表达这些dsRNA,然后分别用微量注射和喂食的方法导入线虫体内,干扰同源基因的表达,再运用子代分析和定时差异干扰比较(differential interference contrast,DIC)显微分析法

35、,成功地在基因组水平上大规模地筛选了功能基因(称为RNAi筛选),证实了线虫染色体和染色体中与早期胚胎细胞分裂及细胞代谢等有关的所有基因功能。 Andrew等用可分泌的细菌喂养线虫,研究了染色体约90%的预测基因,13 9%的基因与其功能对应起来,使已知表型的基因数量由70增至378。这种筛选方法与经典基因筛选方法相比各有千秋,但它主要的一个优点是逆基因分析,即已知特定的基因序列,通过阻抑这一特异基因的表达而出现功能或个体表型的改变,进而得到与其对应联系十、RNAi 在植物功能基因组研究中的应用 现在研究线虫、果蝇、涡虫的RNAi时,普遍采用了dsRNA微注射方法,但它对研究植物RNAi却没成

36、功。 Chuang等人构建了可以在细胞内转录为dsRNA的DNA嵌合结构,再利用农杆菌把此结构转化到拟南芥中,利用RNAi作用证实了拟南芥中与花发育有关的基因的功能,并证明RNAi在对应的转基因植物中是稳定的,并可以传给后代。而植物中RNAi作用稳定的这一特点在其它方法产生的RNAi(如dsRNA微量注射的动物、RNA转染的细胞)的生物体内并未体现。 梅洛(Craig Mello)生于1960年，是被恐龙骨引入科学世界的。梅洛童年时经常跟着父亲在美国西部寻找化石。从那时起，他就迷上了远古时代、地球历史和人类生命的起源等问题。高中时代，梅洛的兴趣逐渐转移到了基因工程方面。法尔(Andrew Fi

37、re)1959年出生在美国加利福尼亚州，本科在加利福尼亚大学伯克利分校主修数学，仅用3年时间就拿到学位。与梅洛类似，他逐渐对涉及生命奥秘的遗传学产生兴趣，并将其作为自己终身的学术追求。 第三章 核糖核酸酶超家族 一、RNase超家族RNA聚合酶：合成转运RNA（tRNAs）、rRNA 5S及其他可以在细胞核及原生质找到的细小的RNA 核糖核酸酶（RNase）家族是一类识别特定序列对双链RNA进行切割的内切酶，切割后一般产物3末端会带有两个碱基的粘性末端。目前RNase家族研究得最多的是在RNA干扰途径中起重要作用的Dicer酶，它负责切割双链双链RNA后产生小干扰RNA；而结构较简单的细菌RN

38、ase则是这一类酶的典型代表。 Substrate (RNA 5) and a Product (RNA 6) of Aa-RNase III (D44N)Schematic Representation of RNase III-dsRNA Interactionsendonuclease domain (endoND)a dsRNAbinding domain (dsRBD)The Overall Structure of A.aeolicus RNaseIII(D44N)RNA根据分子量和肽链的复杂性将RNase同源物分为4类。A. 第一类是细菌的RNase酶。拥有单个dsRNA接合区（

39、dsRBM）和催化区。Rntlp（ RNase III ）延伸的氨基末端对于二聚体的稳定性及最佳的加工活性起着重要的作用；B. 第二类是Saccharomyces cerevisiae同源物的Rntlp。该类酶有单一的dsRBM，但是有双重的催化结构区，氨基末端区域包含长的可变异区和保守区；C. 第三类是果蝇的Drosha（ RNase III ）D. 第四类型酶属于哺乳类的Arg，其含有催化的串联重复区，这个区域的氨基末端有RNA解旋酶区。 二、细菌RNase的功能 所有类型的细菌基因组，即便是含有“最简单”基因组的Mycoplasma genitalium（生殖支原体），都包含有RNase

40、基因。这种保守的情况暗示了RNase包含有一种或多种重要的细胞功能。许多对同源物的研究集中于E.coil 的RNase，E.coil RNase是一个基因表达的全方位的调控子，在Neisseria sp（奈瑟氏球菌属）中RNase具有分解富含重复序列转录物的功能(图示）。 1. rRNA和tRNA的成熟 A. E.coil RNase切割大小约为5500bp由7个rRNA操纵子转录生成的核苷酸，从而为16S，23S，以及5S rRNA提供了直接的前体，因为切割作用发生于转录过程中，所以全长度的RNA并不多见，RNase的切割位点位于16S和23S rRNA 5及3端侧链的互补配对序列；B. R

41、Nase也参与其它结构的RNA的成熟过程，其中包括tRNA； C. 在T4噬菌体转录物编码的8个tRNAs中，RNase可对第一个tRNA序列的上游进行切割，在形成正确的tRNAGln过程中,这一切割作用是非常必要的。 RNase III超家族成员功能区结构模式图PAZ domain： 大约有130个氨基酸，其上有一个带有正电的凹陷处，可以辨认siRNA的3端(带负电)并和之结合；而PIWI大约有300个胺基酸，是属于RNase H (是一种核糖核酸内切酶,它能够特异性地水解杂交到DNA链上的RNA磷酸二酯键,故能分解RNA/DNA杂交体系中的RNA链。该酶不能消化单链或双链DNA）家族成员之

42、一2. mRNA的成熟（附： RNA的生物合成转录） E.coil RNase具有位点特异性地切割细胞和噬菌体编码的mRNA前体的功能，通过E.coil RNase的切割形成具有完整功能的成熟的mRNA。A. RNase切割位点位于T7噬菌体多顺反子早期mRNA前体内的5个顺反子之间，通过切割提供了成熟的mRNA。B. RNase的切割作用对这些mRNA是至关重要的，因为它的切割使得mRNA的3形成茎环结构，从而避免了35核酸外切酶的降解；C. E.coil RNase能切割噬菌体的转录物及控制溶解溶原现象；D. 还有一种调节成分涉及到了RNase对N mRNA 5引导链的切割，这种作用需要大

43、量N蛋白的合成。3. mRNA的降解与反义RNA调节 E.coil RNase 具有诱发mRNA降解的功能。A. RNase多在聚核苷酸磷酸化酶（PNPase）mRNA的5非翻译区内的特异性位点切割，能够快速诱发其它核酸酶的降解，PNPase也参与这个作用机制，而且受到产物的自动调控，B. RNase 也可以自动调节它的产物，这个调控过程是通过它的mRNA 5UTP(三磷酸尿苷)内的特异性位点的切割导致快速诱发随后的降解来实现的；C. RNase通过切割质粒编码的mRNA来进行基因表达的负调控；D. RNase 还参与对细菌反义RNA的作用。在通过对正义-反义RNA双链体的RNase酶切割，能

44、够对细菌质粒的拷贝数量或抑制蛋白的生成进行负调控。尽管一些例子已证实正义-反义RNA双链体的形成能够产生抑制作用，但还是不能忽视RNase的切割作用。其它细菌RNase同源物三、细菌RNase同源物的底物反应抗原表位 抗原表位（抗原决定基）：抗原分子中具有特殊的立体构型和决定抗原特异性的化学基团。 RNase 切割产物的功能依赖于RNase对底物的精确切割（类似抗原与抗体的特异性结合）。A. 切割位点的选择决定着mRNA的半衰期（half-life）及翻译的活性;B. 细胞底物特异性的切割对应于复杂或简单的dsRNA的随机切割，是随机的还是特异性的取决于Dicer对小调节RNA前体的特异性切割

45、，并最终决定着siRNA的形成。 四、细菌RNase的作用机制 在RNase 中dsRBM和催化区的配对都是保守的，虽然会有一些变化，但人们希望dsRNA的接合及切割作用也是保守的，特别是在底物识别方面。 对E.coil酶的研究有利于认识RNase成员的作用机制。我们已经应用生物化学和遗传学的方法去确定dsRBM和催化区如何在催化循环中协同工作的。对于dsRBM的结构和E.coil RNase的催化区以及Aquifer aeolicus的RNase而言，它们提供了确定dsRNA切割保守机制的新方法。催化区：功能及结构特点A. 在常规的体外转录情况下，E.coil RNase 的催化功能区需要d

46、sRBM对底物的切割。然而，当降低盐浓度以及Mn2+置换Mg2+后，缺少dsRBM 的Rnase 删简形式同样具有活性。B. 在类似的条件下，Rhodobacter删简形式的RNase也能分解底物。在低盐环境下能提高切割活性的现象，可以用离子间竞争作用的降低来解释，反之，必须的Mn2+有可能影响其它未达到最佳状态的底物-酶间的相互作用，它可能作用于活性位点来产生影响作用。C. E.coil RNase的催化区是一种二聚体，对于dsRNA来说，具有严格的特异性，并且能被溴化乙锭所抑制，所有这些都是全酶产生作用的必要条件。催化区同样也是底物识别的关键部分，因为删简形式的酶也有标准的切割位点可用。

47、2. dsRBM：结构及功能特点 A. dsRBM 是E.coil RNase保持活性必不可少的部分。 B. 在生理条件下，dsRBM可以提供底物接合必须的亲和性，虽然E.coil RNase dsRBM对切割位点的选择或dsRNA的特异性并不很严格，但是其可能有另外的底物特异性识别与活性调节的功能。在其它拥有不同功能的dsRNA接合蛋白中观察到了dsRBM。 C. E.coil RNase dsRBM的可溶解结构可以通过核磁共振（NMR）来加以确定，通过分析发现dsRBM 由组成的超二级结构，在3条反向平行的折叠链的同一个面上有两条螺旋链，这样的折叠存在于所有的dsRBM中，它只能识别dsR

48、NA。 D. 在单位细胞内，两条双螺旋同轴堆积后形成了准连续螺旋体。E. dsRBM-dsRNA相互间作用的跨幅为16bp，并且dsRBM连接到螺旋体的一个面上，这个面包含两个小槽和主要的插入槽。F. dsRBM有三个特殊区域与RNA相连，这三个区域包含1螺旋（区域1），一个环连接的1和2链（区域2）以及2的氨基末端（区域3）。G. 蛋白-RNA之间主要依靠氢键连接，核糖能够识别的两条链为dsRNA提供了特异性识别的基础。 根据共结晶体结构的数据，利用分子模型技术，研究人员提出了一种RNase 全酶-dsRNA的复合体模型，在此模型中:A. dsRBM“加入”到Aa-RNase催化区，该区也是

49、dsRNA结合的地方。B. 全酶可以连接23-bp的双螺旋体，在各自的分解反应中，它们连接到一起并释放出19-bp大小含有2核苷酸3突出端的螺旋体。C. RNase 全酶-dsRNA的复合体具有双折叠对称性，与印迹（footprinting）和干扰分析的结果一致。D. 全酶能随机地接合长dsRNA，通过对长dsRNA的加工获得一定大小范围的产物（12-15bp）。3.所涉及到的活性位点的结构和二价金属离子 E.coil RNase的磷酸二酯酶活性需要有二价金属离子的参与，其中Mg2+是最理想的，其它如Mn2+，Co2+和Ni2+也同样能起辅助催化作用。 五、酵母RNase同源物：底物及功能 在

50、对S.cerevisiae核苷酸酶Rntlp和Schizosaccharomyces pombe Paclp的研究中，发现真核RNase同源物是如何识别底物反应抗原表位，如何选择加工的路径来调节基因的表达。酵母 RNase 的同源物也表现出相同的现象，正如在纯化和活性分析中所观察到的一样。 稳定的RNA成熟涉及Rntlp和Paclp，它们的一种功能就是通过切割25S rRNA 3末端下游的茎-环结构，从而促使35S rRNA前体的成熟。 六、高级真核细胞RNase同源物的结构与功能 有两种哺乳动物基因组仅编码两种RNase 同源物，而Arabidopsis thaliana 基因组却至少编码9

51、种已知的RNase 同源蛋白。通过对催化区和dsRBM的保守配对分析，它们均有相同的的催化作用。哺乳动物的RNase 鼠和人的基因组编码两种RNase同源物，其中的一种就是Dicer，另一种被称为RNase，每一种蛋白都由单拷贝基因编码，它们都位于染色体上的不同位点。 七、RNAi与小调节RNA成熟中的Dicer Dicer作为一种RNA成熟的核酸酶而不是一种降解核酸酶是很精确，因此 Dicer的作用之一是完成小调节RNA的成熟；另一个作用是，Dicer能分解多种dsRNA，提供抑制基因表达的siRNA。1.siRNA的产生 RNAi的内源性功能包括抑制病毒基因的表达和反转录子的移动。RNAi

52、的作用是识别双链RNA，将它们认为是“异常”的RNA进行降解。A. 首先产生一种称为小干扰RNA（siRNA）（-21bp）的双链RNAs。在体外研究系统中，人们发现siRNA是直接由dsRNA通过分解生成的，并证实了Dicer在加工dsRNA为siRNA过程中的作用。B. siRNA加入一些蛋白中形成称为RISC的复合体, RISC能直接降解同源RNA靶序列。果蝇RISC含有一种Argonaute蛋白家族的成员（Argonaute-2），这说明在其它有机体中也存RNAi现象。靶RNA的切割作用机理目前尚还不清楚，但可以肯定其并不涉及Dicer的作用。2. 小调节RNA的成熟与Dicer Di

53、cer还有一个重要的作用就是加工小调节RNA的前体。在最早涉及Dicer的研究中，发现A.thaliana(拟南芥） 中Dicer基因变异会引起花分生组织无节制增殖，从而导致花的非正常发育，其它的研究如在秀丽线虫中的研究也得到证实，Dicer在生殖细胞的发育过程中是一个不可缺少的酶。A. Dicer作用所产生的小调节RNA包括小的暂时性的RNA（stRNA），例如线虫的let-7 小RNA（microRNA）。这类小调节RNA是通过对它们的前体RNA进行位点特异性切割得到的。在体外的研究证实纯化的人的重组Dicer能将let-7 的microRNA前体切割为大小正确的成熟的RNA，成熟的let

54、-7 microRNA粘连到靶mRNA的3UTR的互补位点上，以目前未知的作用机理调节mRNA的翻译。B. Dicer通过对多顺反子和单顺反子前体的切割生成一定数量的小调节RNA，小调节RNA调节对应mRNA的转录后翻译这已成为人们的共识。与siRNA的形成相比，小调节RNA前体的切割是不对称的，这主要涉及到Dicer作用的底物反应抗原表位，因此人们推测在细菌和酵母中RNase底物的内部环状的特定序列以及同轴堆积现象也参与了Dicer切割位点的选择。 3. Dicer的结构与作用机制 Dicer的多肽结构决定了它特异性功能的发挥。在Dicer中存在着两个催化区，从结合细菌全酶二聚体界面存在的两

55、个催化区可以推测出Dicer全酶的二聚体结构。从Dictyostelium（网柄菌）中纯化的双链核糖核酸酶与Dicer很相似，它的大小约为450kD。假设在非常见结构和/或相关多肽缺失的情况下，它的结构大小和同源二聚体的大小相似，也有可能两个催化区分子内的联系提供了一种dsRNA粘连的裂缝，从而避免了必需的分子间的连接。 A. Dicer类似于细菌RNase，因为它们都可以分解明显的非特异性的dsRNA序列，产生具有2核苷酸3突出端，5磷酸盐以及3羟基末端的siRNA。B. 根据蛋白功能区的特性，产物末端的类型以及所需要的二价金属离子，人们推测Dicer对磷酸二酯键的水解作用与细菌RNase的

56、水解作用相同。C. 在真核细胞中，21bp大小的siRNA足以满足针对靶序列所需要的特异性互补条件。现在人们已经认识了siRNA的结构特征与其发挥作用的重要性，在对果蝇胚胎溶解产物的分析中，发现具有2核苷酸3突出端的siRNA能有效地履行RNAi的功能，而且对核糖并没有什么严格要求。4.RNAi效应复合体的组装 : RISC组装的关键步骤是将siRNAs和miRNAs小分子两条链中的一条选择进入该复合体，目前RISC复合体的体外研究只在Drosohaila得到研究。 果蝇中，siRNAs和miRNAs小分子是由不同的Dicer酶类进行加工的:A. Dcr-1（线虫中的Dicer）酶产生miRN

57、As小分子，而 Dcr-2酶（果蝇中的Dicer）产生siRNAs小分子;B. Dcr-2酶还指导siRNAs小分子的一条链进入RISC复合体。C. 人类中的Dicer酶也可能有指导siRNAs小分子进入RISC复合体的功能，因为Dicer酶缺失的人类细胞中siRNAs小分子并不能诱导产生RNA沉默。5.植物中的三种RNA沉默途径A. 细胞质siRNA沉默。这条途径可能在病毒感染植物细胞中起重要作用，其中dsRNA可能作为复制媒介或具有单链病毒RNA的二级结构特点。在植物DNA病毒中，dsRNA可能通过重叠互补转录本的退火而形成。B. 通过miRNAs沉默内源mRNA。miRNAs可能来源于具

58、有部分双链区域的反向重复前体RNA分子，它们通过与互补的单链mRNA相互作用而起作用。C. 通过DNA甲基化抑制转录而起作用。这条途径的最初证据是在植物中发现转基因及病毒RNA指导特异的核苷酸DNA甲基化。最近研究发现植物中siRNA指导的DNA甲基化与组蛋白修饰有关。6. 哺乳动物细胞中RNA干扰:A. siRNAs的设计： siRNAs的设计根据 Elbashir (2001)描述的方法，带3突出的两个U。候选的siRNAs序列分别位于mRNA靶的3 5以及中部，从而验证不同的区域是否对siRNA介导的降解更为敏感。候选序列在人类基因组数据库中Blast以避免和其他基因的同源性，最后每个目

59、标靶基因选出对应的4个siRNAs。 B. siRNA合成： 分别用化学合成的方法和试剂盒(酶法)制备siRNAs并用常规方法定量。 C. 转染： 哺乳动物细胞（Hela）在不含抗生素的完全培养基中生长至 40-70%，分别将每个siRNAs（分别以不同的浓度），转染试剂和Opti-MEM (Invitrogen)-一种多用途培养基混合，室温下孵育1520分钟，加入siRNAs转染混合物并适当调整培养基的体积。温育48小时后收获细胞，分别进行RNA水平分析 和蛋白表达分析。 D. RNA纯化和分析： 常规试剂盒抽提总RNA，以分光光度剂定量。目标靶mRNA的表达水平通过Northern或者是定

60、量RT-PCR（ ABI7700）双标探针检测。E. 蛋白表达分析： 目标靶基因和无关对照的蛋白表达水平通过Western方法检测。或者用免疫荧光法检测。F. 对照： 对于全部样品，在分析目标靶mRNAs和蛋白表达水平的同时，至少有一个不相关基因的mRNA水平和蛋白表达水平同时进行分析作为对照 九、RNase的起源 人们推测RNase可能起源于细菌，并且通过水平传递进入到了早期的真核细胞 十、真核基因表达调控真核基因表达调控 Control of gene expression in eukaryote 引 言 在高等真核生物中，各种细胞表型的差异很大程度上取决于那些由RNA聚合酶转录的可编码