《食品安全监测技术》word版

1、第四章 食品安全检测技术研究进展第一节 三聚氰胺检测方法目前检测三聚氰胺的方法很多，HPLC，液质和气质联用是较常用的方法。本站收集部分国内相关文章，并整理如下。方法包括：GC-MS，Spectra-Quad线检测，超高效液相色谱_电喷雾串联质谱法，反相高效液相色谱法，高效液相色谱-二极管阵列法，高效液相色谱法HPLC，高效液相色谱-四极杆质谱联用，固相萃取与高效液相色谱联用，液相色谱串联质谱法LC- MS MS）等。液质，气质联用检测三聚氰胺1、超高效液相色谱2电喷雾串联质谱法测定饲料中残留的三聚氰胺饲料样品经1%三氯乙酸2二甲基亚砜提取,Wa te rs O as is MCX柱净化,超高

2、效液相色谱分离,最终采用电喷雾串联四极杆质谱进行检测。结果表明,三聚氰胺在饲料中的含量范围为105 000g / kg时,线性关系良好 r 0199 。在10100g / kg 的添加水平范围内的平均回收率为83%94%,相对标准偏差为412%615%。该方法的检出限为10g / kg.2、高效液相色谱- 四极杆质谱联用测定饲料中三聚氰胺含量试验采用自动固相萃取装置, 建立合适的过柱程序; 运用Agilent HP1100 高效液相色谱- 四极杆质谱联用仪, 优化质谱条件, 建立饲料中三聚氰胺残留检测方法。方法的线性范围为0.0100.500 g/ml, 相对标准偏差在3.2%7.7%之间,回

3、收率在72.4%91.2%之间, 具有较好的准确度和精密度。3、液相色谱串联质谱法LC - MS/MS分析宠物食品中三聚氰胺建立了液相色谱- 串联质谱LC - MS/MS用于宠物食品中三聚氰胺检测的方法, 并将其与美国食品药品监督管理局US FDA公布的气相色谱- 质谱GC - MS和液相色谱LC方法进行了对比,结果发现LC - MS/MS的方法, 前处理过程简单, 是一种高灵敏度、高选择性的分析方法。4、液相色谱2串联质谱法测定饲料中三聚氰胺残留应用液相色谱2串联质谱法测定饲料中三聚氰胺残留。试样用V 乙腈 V H2O = 11溶液,提取,高速离心后,供液相色谱2串联质谱仪定性定量分析。流动

4、相为V 乙腈 V H2O = 8020混合溶液。采用电喷雾离子源, 定性离子对为127. 2 /85. 2 和127. 2 /68. 2; 定量离子对为127. 2 /85. 2。在添加了0. 5 10. 0 mg/kg的三聚氰胺标准品时的回收率为92. 6%103. 2%;相对标准偏差RSD在0. 8% 2. 0%;检出限为0. 2 mg/kg。5、固相萃取一液相色谱一串联质谱法检测食品中的三聚氰胺样品经均质，1三氯乙酸溶液提取，用OASIS MCX固相萃取小柱净化，减压浓缩后以甲醇溶解定容，用Waters BEHC。柱分离，乙腈和水为流动相，经液相色谱一串联质谱法检测。三聚氰胺线性范围为0

5、1100mgkg，相关系数r为09999，平均回收率为71 95 ，相对标准偏差为456 一982n=6，方法的检出限为05 mgkg。Spectra-Quad在线分析三聚氰胺含量三聚氰胺含量的实验室检测方法存在检测结果受蛋白质分子中氮含量影响较大的问题，这种相似性会导致三聚氰胺的检测异常困难。赛默飞世尔科技（上海）有限公司提供的Spectra-Quad在线成分分析仪可以实现三聚氰胺含量的在线实时连续检测（见图1），并能较好的解决检测结果受蛋白质含量影响的问题。Spectra- Quad采用近红外线吸收检测技术，是一种无接触、无损伤和无危害的检测方法。传感器利用特定波长的近红外线照射样品，并对

6、反射光线进行分析，且 Spectra-Quad所用光线亮度非常低，不会加热或损伤样品。对于三聚氰胺来说，其含量越高所反射出的光线就越少。实际检测中，检测人员可以将 Spectra-Quad传感器固定到任何现有的传送装置上，通过使用粉末取样仪，实现对气动传输产品中三聚氰胺含量的连续检测，检测数据可以输出到某个工艺控制系统或PC机控制器内，从而确保产品免受三聚氰胺的污染。HPLC检测三聚氰胺1、反相高效液相色谱法测定饲料中三聚氰胺的含量2、高效液相色谱- 二极管阵列法测定高蛋白食品中的三聚氰胺建立用高效液相色谱- 二极管阵列法测定高蛋白食品中的三聚氰胺的检测方法。对不同样品采用不同的前处理方法,然

7、后用Agilent TC2C18 4. 6 250 mm色谱柱,柱温为40 ,流动相为0. 02 mol/L硫酸铵甲醇= 94 6 V V ,流速0. 8 mL /min,二极管阵列检测器于235 nm 波长下进行检测,并以保留时间和三维光谱图相似性系数进行定性,外标法定量。不同样品的加标回收率为98. 8% 101. 5% ,RSD小于1. 2%。方法线性范围为0. 1150g/mL,检测限为0. 01g/mL,相关系数R = 0. 999 9。3、高效液相色谱法HPLC测定饲料中三聚氰胺的含量本文建立了饲料中三聚氰胺的HPLC测定方法。该法采用Symmetry C18柱为分离柱,二极管阵列

8、紫外检测器进行样品检测max = 236nm 。方法简单、快速、重现性好,平均回收率大于90% , RSD小于3. 0% ,线性范围为1mg/L - 100mg/L。4、固相萃取与高效液相色谱联用测定宠物食品中三聚氰胺利用阳离子交换2反相萃取柱净化样品提取液,结合高效液相色谱对宠物食品中三聚氰胺进行测定,获得较满意的结果。复杂基质中154种农药残留量的分析2006年日本推出了肯定列表制度，针对800种农药设置了残留限量，使农药残留分析成为当前研究的热点，目前用于农药残留分析的主要技术为气相色谱/单四杆质谱的选择离子扫描技术（SIM）1-2离子阱质谱多选择反应监测技术（MRM）3和全扫描的计算机

9、辅助技术4-5。单四极杆的选择离子技术采集的质谱信息少，选择性较差，结果存在很大的不确定性。离子阱质谱二级质谱技术为时间上的串联，因此对于多组份化合物同时分析存在扫描速度受限的问题。本文采用Thermo推出的最新一代气相色谱/三重四极杆串接质谱（TSQ Quantum GC），通过其高通量离子传输的性能、碰撞室零串扰技术和高选择性反应监测技术（H-SRM），实现了一针进样同时对154种化合物的同时分析，整个分析过程可在在22min内完成，保证结果准确的同时大幅度提高了分析效率。实验部分以下为实验中使用的色谱、质谱仪器、操作条件。表1为Quantum GC 质谱部分的分段扫描程序。气相色谱：TR

10、ACE GC ultraColumn：Rti-5MS （Restek）15m0.25 mm I.D. df=0.25mInjection mode：Splitless Injection Temp：220Transferline Temp：280Oven Temp：70（1 min）25/min13015/min160 5/min210 25/min290（5 min）Flow：constant flow 1.0 ml/min质谱：Ion Source Temp，250Emission Current：50AIonization mode：EIIon volumn：Closed EIAnaly

11、tical mode:H-SRM （High Selected Reaction Monitoring）Scan width：0.002 m/zScan Time：0.025 secPeak Width for H-SRM：Q1，0.4Da；Q3，0.7DaCollision Gas Pressure：1.5 mTorr （Ar）结果与讨论扫描分段程序（Segment）的建立随着待检测项目的逐渐增多，分析方法的效率和准确度成为影响实验室检测能力的主要因素之一。TSQ Quantum GC具有高通量离子传输性能和碰撞室零串扰技术特点，本方法凭借这一特点成功实现了一次进样，22分钟之内对154种农

12、药的准确的定性、定量分析。众所周知，使用一根毛细管色谱柱对百种以上化合物实现色谱上完全分离是非常困难的1，本方法为了提高分析效率，缩短分析时间，使用15 m的色谱柱。在此条件下，154种化合物的保留时间分布非常紧凑，在某些保留时间处，会出现34个化合物同时出峰的结果。这就要求质谱必须具有高通量的离子扫描功能，以保证所有化合物均能够被准确、快速检测。TSQ Quantum GC是当前具有最高通量离子传输效率的三重四极质谱，正是基于这一特点，本方法可实现对154种化合物的一次进样同时连续分析。图1为韭菜中添加浓度为1 ppb农药的色谱图，从图中可以看出使用TSQ Quantum GC按照表1所列条

13、件进行分析，获得了超高灵敏度，具有很好的定量结果。零串扰功能的使用对于多组份化合物同时分析，碰撞池的离子间串扰是影响分析结果的另一主要因素。对于三重四极杆质谱在进行SRM扫描的过程中，当后一组离子进入碰撞池时，前一组离子若仍然存在，便会有产生离子串扰的可能，导致第二组离子产生错误的色谱图，当两组不同SRM事件具有相同“子”离子时，这一问题会更为严重。在进行超过百种化合物的一针进样同时检测分析时，不可避免地在一个窗口中会放入多组离子进行同时的SRM分析，如果仪器中存在交叉干扰，会导致最终的结果失去准确性。TSQ Quantum 三重四极杆质谱采用直角碰撞池设计，可有效地消除离子串扰，此设计被称为

14、无离子串扰技术。通过这种“无离子串扰技术”有效地消除了由仪器检测所产生假阳性的可能，从而保障了TSQ Quantum 对154种化合物同时进行分析的准确性。高选择反应检测有效去除基质干扰复杂基质中多组份残留物分析，排除基质干扰准确对目标化合物进行定量是另一主要难点。对于三重四极杆质谱，选择反应监测（SRM）是目标化合物定量分析中最为基本的扫描技术。然而以单位质量分辨选择母离子，往往会受到来自于生物体自身和环境基质的干扰。而高选择性反应监测（H-SRM）通过在Q1上使用分辨增强峰，获得耐受性更强的母离子，可有效增加待测化合物分析的选择性。TSQ Quantum GC是唯一具有H-SRM功能的气相

15、色谱/三重四极杆质谱仪。图2为使用TSQ Quantum GC对韭菜中添加1ppb 甲基苯噻隆采用SRM（Q1，0.7 FWHM）扫描和高选择H-SRM（Q1，0.4 FWHM）扫描采集的色谱图。分析图2A可以看出采用SRM扫描时，恰好在待测目标化合物（6.80 min）处存在较大干扰，无法对目标化合物进行定量分析。图B为Q1采用0.4分辨进行H-SRM扫描得到的色谱图，从中可以看出来自基质的干扰被有效地去除，得到了理想的待测化合物色谱峰。比较A、B两图，H-SRM更为有效地去除了基质干扰，提高了方法的检测下限。图3为韭菜中添加1ppb的各种农药采用H-SRM扫描的色谱图，各化合物均获得了理想

16、的灵敏度。结论在22min内，凭借TSQ Quantum GC超高的离子传输效率、通过设定多个时间段（Segment）和扫描通道可一针进样同时分析154种农药成分。通过TSQ Quantum GC 的高选择反应检测扫描（H-SRM），可有效去除基质干扰，与离子阱和单四极质谱相比，更为有效地排除假阳性，进一步地保证定量和定性的准确性。本方法具有较高灵敏度，部分农药在复杂基质中的检测下限可达到0.5ppb，完全满足肯定列表等国际法规对检测的要求。食品基质中403种农药残留的测定复杂食品基质（如谷物、蜂蜜、苹果、肉类）中痕量农残的分离检测非常复杂，本文建立了使用Agilent 快速高分离度液相色谱（

17、RRLC）与三重串联四级杆质谱 (QQQ)联用的方法，实验得到了良好的线性关系和重复性。与常规HPLC相比，显著改善了复杂样品的分离度，极大地提高了检测灵敏度和分析通量，在复杂食品基质中痕量组分中有着广阔的应用前景。仪器和主要试剂Agilent 1200 RRLC快速高分离度液相色谱；Agilent 6410 QQQ（三重串联四极杆质谱）；振荡仪；氮气吹干仪。所有试剂均为色谱纯，购自Sigma公司；C18 SPE柱（Supelclean LC-18，3ml Tubes，Supelco）；微孔滤膜过滤：0.45m（Supelco）；所有农药标准品购自Sigma Inc.。标准溶液的制备标准储备溶

18、液：分别精确称取5.0mg分别置于10ml容量瓶中，根据标准物质的溶解度选甲醇、乙腈等溶剂溶解并定溶至刻度。混合标准溶液（混合标准溶液A、B、C、D、E和F）：按照农药及相关化学品的性质和保留时间，将403种农药及相关化学品分成A、B、C、D、E、F六个组。依据每种农药的分组，移取一定量的单个农药的标准储备液于100ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，所有被分析物的线形浓度范围0.5500ng/ml。混合标准溶液避光4保存，可使用一个月。样品的提取与净化称取10g样品至300ml三角瓶中，加入100ml乙腈并震摇30min，过滤乙腈提取液至100ml梨形瓶中，于40水浴浓缩至5ml左右。 100m

19、l 4%氯化钠水溶液分三次溶解浓缩液，并将其全部转移至分液漏斗中，加入50ml二氯甲烷震荡提取10min（重复二次）。下层有机相过装有无水硫酸钠的漏斗于100ml梨形瓶中，40水浴旋转浓缩蒸干后用5ml甲醇溶解，上C18 SPE柱（Supelclean LC-18，3ml Tubes，Supelco；SPE柱预先用5ml甲醇洗脱，然后用5ml洗脱进行预处理），用5ml甲醇洗脱，全部甲醇洗脱液在氮气下吹干，残留物用甲醇：水（15：85）定容至1ml，0.45m微孔滤膜过滤后供LC-QQQ分析。操作条件色谱条件谱柱：Agilent SB-C18，2.1100mm，1.8m；柱温：50；进样量：20

20、l；流动相及流速见表1；后运行时间：8min。质谱条件电离源模式：电喷雾离子化；电离源极性：正模式；雾化气：氮气；雾化气压力：40psi；离子喷雾电压：4000V；干燥气温度：350；干燥气流速：10L/min；分辨率：Q1（unit）Q3（unit）。样品分析定性测定：在相同实验条件下进行样品测定时，如果样品中检出色谱峰的保留时间与基质标准中某种农药及相关化学品色谱峰的保留时间一致，并且在扣除背景后所选择的二对离子及丰度比也一致，则可判定为样品中存在这种农药残留。定量测定：本方法中LC-QQQ采用外标校准曲线法定量测定。为减少基质对定量测定的影响，定量用标准溶液采用基质混合标准工作溶液绘制，

21、并且所测样品中农药残留的响应值均在线性范围内。平行试验：按以上步骤对同一试样进行平行试验。空白试验：除不称取试样外，均按上述步骤进行。结果计算：LC-QQQ测定采用标准曲线法定量，标准曲线法定量结果由Mass Hunter定量软件Quantitative Analysis计算生成。结果403种农药的线形浓度范围0.5500ng/ml，线形关系良好，R值均大于0.99。谷物样品中农药残留的总离子流图（TIC）见图1、图2。结论本文所建立的方法具有出色的检测灵敏度、良好的线性关系和重复性，非常适用于复杂食品基质中痕量农残的分离检测。Agilent快速高分离度液相色谱（RRLC）与三重串联四级杆质谱

22、（QQQ）的联用，不仅显著改善了复杂样品的分离度、而且极大提高了检测灵敏度和分析通量。新型持久性有机污染物PBDEs分析方法多溴联苯醚(PBDEs) 是一种新型持久性有机污染物，在环境及生物体内普遍存在且污染呈增长趋势，并对动物及人类健康造成潜在的危害。本文介绍了PBDEs的结构、性质、对环境的污染情况、分析方法等。文/多溴联苯醚（polybrominated diphenyl ethers, PBDEs）是一类广泛使用的溴代阻燃剂。由于其热稳定性好，阻燃效率高，被广泛应用于纺织、家具、建材和电子等产品当中。由于其为一种添加型阻燃剂，没有化学键的束缚，PBDEs易于从其应用产品（如电子产品）中

23、向环境中释放。PBDEs化学性质稳定，在环境中难以降解，具有高亲脂性，并且能随食物链产生生物富集和放大效应。毒理学研究表明PBDEs是一种致癌性并且具有内分泌干扰毒性的有毒物质。作为新型持久性有机污染物，PBDEs已经成为当前环境科学的研究热点。化学结构及应用PBDEs的分子式为C12H（0-9）Br（1-10）O，化学结构见图1。PBDEs有209种同系物，遵循同多氯联苯一样的IUPAC编号命名系统，其中二位单取代的同系物命名为BDE-1，而取代位全被溴原子取代的同系物命名为BDE-209。根据溴原子取代个数的不同，209种PBDEs 同系物分为10个同系组。PBDEs的沸点为310425，

24、具有蒸汽压低、热稳定性高的特点，在环境中难以降解。实验表明PBDEs的蒸汽压比多氯联苯的蒸汽压低，并且随取代溴原子个数的增加其蒸汽压降低。四溴联苯醚同系物的辛醇水分配系数logKow为5.96.2，五溴联苯醚为6.57.0，八溴联苯醚为 8.48.9，十溴联苯醚为10，表现出较强的亲脂疏水性，并且容易在生物体内的脂肪和蛋白质中富集并通过食物链放大。高温分解时PBDEs会生成剧毒物多溴二苯并二恶英（PBDDs）及多溴二苯并呋喃（PBDFs）。商业PBDEs产品主要包括五溴联苯醚、八溴联苯醚和十溴联苯醚。五溴联苯醚作为纺织品、聚氨酯泡沫的添加阻燃剂应用于家具、床垫等行业。八溴联苯醚产品常被作为聚碳

25、酸酯、热固树脂、ABS工程塑料的阻燃剂并应用于电子产品领域。十溴联苯醚作为大多数合成材料的阻燃剂常被应用于印刷电路板、纺织品等领域。五溴联苯醚和八溴联苯醚是由多种PBDE同系物组成的混合物，其组成成分随生产商的不同而有所变化。生物体内PBDE的污染状况从首次在环境中发现PBDEs至今已有20多年的历史。1979年，美国一家PBDEs生产企业周围的土壤和污泥中首次检测到了BDE-209的存在。1987年，在北冰洋、波罗的海和北海的海洋哺乳动物组织中检测到PBDEs，由此显示PBDEs已成为一类全球性的环境污染物。目前研究表明包括空气、土壤、底泥、野生动物以及人体血液、母乳中都有PBDEs的检出。

26、瑞典检测了39名分娩母亲母乳中PBDEs的浓度水平，发现母乳中PBDEs浓度水平与母亲年龄、电脑使用频率、饮酒等因素不相关。对日本母乳的研究发现摄入鱼类较多的女性其母乳中PBDEs的浓度（1.34 ng/g （脂肪含量）高于摄入鱼类较少的女性母乳（0.71 ng/g 脂肪含量）。瑞典在19951997年，检测了77人的脂肪组织中BDE-47的浓度，所有的样品中全部检测出PBDEs。研究表明19702001年三十年时间段内，北美、欧洲以及日本人体血液、母乳及组织中PBDEs的浓度增加了100倍，每隔5年浓度增加一倍。北美地区人体内的PBDEs污染水平明显高于欧洲地区，日本人群所处的环境中，PBD

27、E的含量比欧洲要低，而北美的浓度明显偏高，为35ng/g （脂肪含量）。职业暴露人群体内以高溴代的BDE-183、 BDE-209为主。与十溴联苯醚接触的工人体内血清中BDE-209的含量明显高于普通人，一项针对19名计算机工厂全职工人的研究表明工人血清中 BDE-153、-183和-209的含量比常人高5倍，说明多溴联苯醚的逸出是造成职业人员体内浓度偏高的主要原因。在野生动物体内中也检测到了PBDEs。通过19812000年对美国五大湖地区的污染水平比较发现，银鸥蛋中PBDEs每隔3年浓度增加一倍。同时研究发现19702001年加拿大北极地区的水生哺乳动物体内的PBDEs浓度非常低，为5ng

28、/g （脂肪含量），但是每隔大约7年浓度增加一倍。世界上其他地区的水生哺乳动物体内PBDEs每隔大约5年浓度加倍。瑞典一些鸟蛋中污染水平也非常高（脂肪含量为2000 ng/g），并且每隔6年浓度加倍。我国PBDEs的相关研究起步较晚，但是最近几年研究发展非常迅速。初步结果表明PBDEs的含量在我国还处于相对较低的水平。对 20042005年珠江河口生物样品中PBDEs的检测表明鱼类（鱼、大黄鱼、银鲳、舌鳎、龙头鱼）、虾类（刀额新对虾、近缘新对虾）及虾蛄类生物样品肌肉组织中10种PBDEs的含量分别为37.8407.1 ng/g （脂肪含量）、49.0239.1 ng/g （脂肪含量）和1424

29、44.5 ng/g （脂肪含量），所有样品中，BDE-47相对含量最高。对中国南方某城市21对婴儿脐带和母亲静脉血样的分析结果显示BDE-47和BDE-153为最主要的同系物，总PBDEs的浓度范围为1.517 ng/g，远低于美国所报道的水平。分析方法PBDEs的分析方法主要借鉴多氯联苯的检测方法。目前各实验室所用的方法主要是依据美国EPA1614（草稿）方法进行改进。主要步骤包括样品提取、净化、分离和检测。对于液体样品，一般用液液萃取、固相萃取以及连续液液萃取等方法，固体样品常用的提取方法有超声萃取、索式提取、加速溶剂萃取（ASE）、微波辅助萃取等。萃取溶剂可选择二氯甲烷、正己烷、丙酮以及

30、甲苯等有机溶剂。在样品净化步骤，对于不同的样品需要去除不同的杂质以保证仪器分析的准确性。对于生物样品和植物样品，需要去除脂肪和色素等杂质。而对于底泥和土壤样品则需要去除硫。浓硫酸或酸性硅胶能有效去除样品中的脂类、色素等干扰物质，凝胶渗透色谱（GPC）除了能去除大分子干扰物外，还可以去除小分子物质硫的干扰。凝胶渗透色谱主要是靠体积的差异排除大分子，目前主要应用为玻璃填充柱和仪器自动凝胶渗透色谱。铜粉可以去除硫干扰物，但是使用前铜粉需用酸活化。先用以上步骤去除大部分杂质之后，则需要用复合硅胶柱对样品进行进一步的被分析物的分离和净化。而对于基质特别复杂的样品，如污水处理厂的终端产物活性污泥，则需要多

31、次复合硅胶柱净化过程。其他常用的净化方法包括弗罗里土柱、氧化铝柱等净化方法。PBDE的仪器检测方法有GC-ECD、GC-LRMS、GC- HRM S、GC-ICP-MS、HPLC-MS等方法。但是主要应用为GC-MS的方法，质谱的电离方式为电子轰击（EI）或负离子化学电离源（NECI）。 CI比EI灵敏度高，但是EI可以使用同位素稀释的方法定量，这使得超痕量分析更加准确。气相色谱进样装置可以采用常规分流/不分流进样，程序升温蒸发，加压无分流、冷柱头进样、以及大体积进样等方法以提高仪器的灵敏度和检测限。而所使用的柱子主要型号为DB-5HT、DB-XLB等。近年来，高分辨气相色谱-高分辨质谱的方法

32、被应用于检测PBDEs，这种方法使得检测的灵敏度和选择性达到更高的水平。分析过程中，样品中含有的多氯联苯会干扰多溴联苯醚的检测，必须引起足够的重视。另外，高溴代的PBDEs同系物在色谱柱上的保留时间较长，实际分析时一般采用较短的气相色谱柱，例如分析BDE-209一般采用15m的色谱柱。这样就可以防止其在柱子上保留时间过长而导致其在柱子上热降解而导致分析不准。总结作为新型持久性有机污染物，PBDEs已经造成全球性的环境污染，在环境及生物体内普遍存在且污染呈增长趋势，并对动物及人类健康造成潜在的危害。为此欧洲等一些发达国家已禁止生产和使用五溴、八溴联苯醚，并禁止含此类化合物的产品进入欧盟市场，而我

33、国由于对PBDEs的研究开展较晚，相关报道较少，缺乏对该类污染物的防治措施。今后，我国应大力加强该污染物在生物体内的长期毒性、暴露途径、环境及人体内的分布及迁移转化、修复方法等方面的科学研究，并积极寻找替代品，为制定合理的环境政策提供依据和数据支持关于废水pH的测定?pH为水中氢离子活度的负对数。pH=lgaH+在非常稀的溶液中，氢离子活度等于氢离子的浓度。pH是化学中常用的和最重要的检测项目之一，可间接地表示水的酸碱程度。pH等于7时，溶液为中性；大于7时，溶液为碱性；小于7时，溶液为酸性。用玻璃电极法测定废水的pH。其原理是：以饱和甘汞电极为参比电极，以玻璃电极为指示电极组成电池，在25摄

34、氏度、101.3kpa大气压时，溶液每变化1个pH，电位差改变59.1毫伏，将伏特计的刻度改为pH刻度，便可直接读出溶液的pH值。工具与材料酸度计（简称pH计），玻璃电极，饱和甘汞电极，磁力搅拌器，烧杯，容量瓶，烘箱，温度计。配制pH标准溶液的标准物质，蒸馏水。活动过程1pH标准溶液的配制。根据待测废水的pH的大致范围，从中选择pH接近的相应物质，配制相应的标准溶液。2根据仪器使用说明书的要求，打开pH计的电源开关，预热半小时。3用pH标准液校正仪器刻度。用温度计测定环境温度，然后把仪器的温度补偿器旋钮调至该温度处。用蒸馏水冲洗两电极，用滤纸吸干上面残存的水。把甘汞电极的下端和玻璃电极的玻璃泡

35、浸入pH标准溶液中，用磁力搅拌器搅拌1min。调整仪器指针，使其位于标准溶液的pH处。4废水pH的测定。用蒸馏水缓缓淋洗两电极35次，再用待测废水淋洗35次。然后将它们插入装有2550mL废水的烧杯中，电极浸入水中，搅拌，待读数稳定后，读pH。说明与延伸1玻璃电极在使用前应在蒸馏水中浸泡24min以上。用毕，冲洗干净，浸泡在水中。2空气中的二氧化碳会影响测定结果，因此测定时不宜提前打开废水水样的瓶塞。3测定时，玻璃电极的玻璃泡应完全浸入溶液中，并稍高于甘汞电极的陶瓷芯端，以免搅拌时碰破。4为消除误差，必须使用与被测废水pH相接近的标准溶液校正仪器。5测定废水时，电极用水淋洗后，还需要用被测废水

36、淋洗，避免产生误差。植物、烟草、作物植株全氮磷钾测定方法 待测液的制备（H2SO4H2O2消煮）试剂：浓H2SO4、30%H2O2方法：称取植株样品0.3000g置于100ml开氏瓶中，先用水湿润样品，然后加浓H2SO4 5ml，轻轻摇匀（最好放置过夜），瓶口放一漏斗，在消化时先低温加热，待浓硫酸分解冒白烟逐渐升高温度。当溶液全部呈棕黑色时，取下冷却加30%H2O210滴，并摇动，以利反应充分进行。在加热至沸腾后，稍冷后再加30%H2O210滴，如此反复23次。直至消煮液呈无色或清亮后，再加热510分钟，以除尽过剩的双氧水。取出开氏瓶冷却，用少量水冲洗漏斗，洗液洗入瓶中。将消煮液用水定容至10

37、0ml供测N、P、K的测定。消煮时同时做空白试验以校正试剂的误差。植株全氮的测定：（H2SO4H2O2消煮，奈氏比色法）试剂：100g/L酒石酸钠溶液、100g/LKOH溶液、奈氏试剂（溶解HgI245.0g和KI35.0g于水中，将此溶液洗入1000ml容量瓶中，加入KOH 112g，加水至800ml，摇匀，冷却定容，放置数日以后装入棕色瓶中备用）、100ug/mlN（NH4+-N）标准液（称取烘干NH4Cl0.3817g溶于水中，定容为1000ml，此为100ug/mlN（NH4+-N）贮备液。用时吸上述溶液50ml，稀释至500ml，即为10ug/mlN（NH4+-N）工作液）操作步骤：

38、取上述待测液5ml置于50ml容量瓶中加100g/L酒石酸钠溶液2ml，充分摇匀，再加入100g/LKOH溶液中和溶液中的酸（取一份待测液，以酚酞作指示剂，测定中和这份溶液所需KOH的ml数），加水至40ml，摇匀，加奈氏试剂2.5ml，用水定容后充分摇匀。30分钟后用分光光度计比色，波长420nm。同时做空白。标准曲线的制作：分别吸取10ug/mlN（NH4+-N）标准液0、2.50、5.00、7.50、10.00、12.50ml至于50ml容量瓶中，显色步骤同上样品测定。浓度溶液分别为0、0.5、1.0、1.5、2.0、2. 5ug/ml N（NH4+-N），在420nm波长处比色。以空白

39、消煮液显色后调零点。结果计算：N（%）=Vts10-4/m显色液N（NH4+-N）的质量浓度ug/ml V显色液体积(ml) ts分取倍数m干样品质量(g)104将mg/L浓度单位换算为百分含量的换算因数植物全磷的测定(H2SO4H2O2消煮,钒钼黄比色法)试剂:钒钼酸铵溶液(25.0g钼酸铵(NH4)6Mo7O244H2O分析纯溶于400ml水中，另将1.25g偏钒酸铵(NH4VO3，分析纯)溶于300ml沸水中，冷却后加入250ml浓HNO3(分析纯)。将钼酸铵溶液缓缓注入钒酸铵溶液中，不断搅匀，最后加水稀释到1L，贮入棕色瓶中)、6mol/LNaOH溶液（24gNaOH溶于水，稀释至10

40、0ml）、0.2%二硝基酚指示剂（0.2g2，6二硝基酚或2，4二硝基酚溶于100ml水中）、磷标准液50mg/LP（0.2195g干燥的KH2PO4(分析纯)溶于水，加入5ml浓H2SO4，于1L容量瓶中定容，装入塑料瓶中低温保存。 操作步骤：吸取定容后的消煮液10.00ml放入50ml容量瓶中，加2滴二硝基酚指示剂，滴加6mol/LNaOH中和至刚呈黄色，加入10.00ml钒钼酸铵试剂，用水定容50ml。15分钟后在波长450mm处进行测定，以空白溶液(空白试验消煮液按上述步骤显色)调节仪器零点。 标准曲线：准确吸取50ug/LP标准液0、1、2.5、5、7.5、10、15ml分别放入50

41、ml容量瓶中，按上述步骤显色，即得0、1.0、2.5、5.0、7.5、10、15ug/ml P的标准系列溶液，与待测液一起测定，读取吸光度，然后绘制标准曲线或求直线回归方程。结果计算：P（%）=Vts10-4/m显色液P的质量浓度ug/ml V显色液体积(ml) ts分取倍数m干样品质量(g)104将ug/L浓度单位换算为百分含量的换算因数植物全钾的测定(H2SO4H2O2火焰光度法)试剂:K标准溶液100ug/L（0.1907gKCl，在105110干燥2h，溶于水，于1L容量瓶中定容，存于塑料瓶中）操作步骤：吸取定容后的消煮液10.00ml放入50ml容量瓶中，用水定容50ml。直接在火焰

42、光度计上测定，读取检流计读数。标准曲线：准确吸取100ug/L标准溶液0，0.5，1.0，2.5，5.0，10，20ml，分别放入50ml容量瓶中，加入定容后的空白消煮液5或10ml(使标准溶液中的离子成分和待测液相近)，加水定容。即得0，1，2，5，10，20，40ug/mlK的标准系列溶液。以浓度最高的标准溶液定火焰光度计检流计的满度,然后从稀到浓依次进行测定，记录检流计读数，以检流计读数为纵坐标绘制标准曲线。结果计算：全K（%）=Vts10-4/m显色液P的质量浓度ug/ml V显色液体积(ml) ts分取倍数m干样品质量(g)104将甲醛的测定GB/T 5009.49-2003 发酵酒

43、卫生标准的分析方法1范围本标准规定了发酵酒中各项卫生指标的分析方法。本标准适用于以含糖或淀粉的物质为原料，经糖化发酵后不经蒸馏而制成的酒中各项卫生指标的分析。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB 2758 发酵酒卫生标准GB/T 5009.12 食品中铅的测定GB/T 5009.22 食品中黄曲霉毒素B1的测定GB/T 5009.26 食品中N-亚硝胺类的测定

44、GB/T 5009.34 食品中亚硫酸盐的测定GB/T 5009.35 食品中合成着色剂的测定3 感官检查3.1 量取30mL样品,置于50mL清洁干燥无色玻璃烧杯中，观察其颜色，应透明无沉淀，无杂质。3.2 尝其味应有该种酒特有的芳香味和滋味，不应有霉味、酸味、异味。应符合GB 2758 的规定。4 理化检验4.1 铅按GB/T 5009.12 操作。4.2 黄曲霉毒素B1 按GB/T 5009.22 操作。4.3 二氧化硫按GB/T 5009.34 操作。如果加四氯汞钠吸收的溶液有色，可加人少量活性炭脱色，过滤，滤液备用。4.4 N-亚硝胺类（啤酒）按GB/T 5009.26 操作。4.5

45、 着色剂按GB/T 5009.35 操作。4.6 甲醛 原理甲醛在过量乙酸胺的存在下，与乙酰丙酮和氨离子生成黄色的3,5-二乙酰基-1,4-二氢吡啶化合物。在波长415nm 处有最大吸收，颜色的深浅与甲醛的含量成正比，相应可得出试样中甲醛的含量。4.6.2 试剂4.6.2.1 乙酰丙酮溶液：称取0.4g新蒸馏乙酰丙酮和25g 乙酸铵、3 mL乙酸溶于水中，定容至200mL 备用。（用时配制）GB/T 5009.49-2003 4.6.2.2 百分之36-百分之35甲醛。4.6.2.3 0.1000 mol/L 硫代硫酸钠标准溶液。4.6.2.4 0.1 mol/L 碘标准溶液。4.6.2.5

46、50g/L 淀粉指示剂。4.6.2.6 1 mol/L 硫酸溶液。4.6.2.7 1 mol/L 氢氧化钠溶液。4.6.2.8 200 g/L 磷酸溶液。4.6.2.9 甲醛标准溶液的配制和标定：吸取百分之36-百分之38甲醛溶液7.0 mL，加人0.5mL 1 mol/ L硫酸，用水稀释至250 mL 。吸此溶液10.0mL于100mL容量瓶中，加水稀释定容。再吸10.0 mL稀溶液于250 mL 碘量瓶中，加90mL水；20mL 0.1 mol/L的碘溶液和15mL 1mol/L 氢氧化钠溶液，摇匀，放置15 min 。再加人20mL 1 mol/L 硫酸溶液酸化，用0.1000 mol/

47、L 硫代硫酸钠标准溶液滴定至淡黄色，然后加约1mL 5 g/L 淀粉指示剂，继续滴定至蓝色褪去即为终点。同时做试剂空白试验。甲醛标准溶液的浓度按式（l）计算：X 等于（V1-V2） X c1 X 15 （1） 式中：X 甲醛标准溶液的浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）； V1 空白试验所消耗的硫代硫酸钠标准溶液的体积，单位为毫升（mL）； V2 滴定甲醛溶液所消耗的硫代硫酸钠标准溶液的体积，单位为毫升（mL） , c1 硫代硫酸钠标准溶液的浓度，单位为摩尔每升（mol/L）； 15 与1.0mL 碘标准溶液（1.000 mol/L）相当的甲醛的质量，单位为毫克（mg）。用上述己标定甲醛浓度的

48、溶液，用水配制成含甲醛1 ug/mL 的甲醛标准使用液。4.6.3 仪器4.6.3.1 分光光度计4.6.3.2 水蒸气蒸馏装置。4.6.3.3 500mL 蒸馏瓶。4.6.4 分析步骤4.6.4.1 试样处理吸取已除去二氧化碳的啤酒25mL 移入500mL 蒸馏瓶中，加20mL 200 g/L 磷酸溶液于蒸馏瓶，接水蒸气蒸馏装置中蒸馏，收集馏出液于100mL容量瓶中（约100mL）冷却后加水稀释至刻度。4.6.4.2 测定精密吸取0.00 , 0.50 , 1.00 , 2.00 , 300 , 4.00 , 8.00 ml , l ug/mL的甲醛标准溶液于25mL比色管中，加水至10mL

49、 。吸取样品馏出液10mL移入25mL比色管中。标准系列和样品的比色管中，各加人2mL乙酰丙酮溶液，摇匀后在沸水浴中加热10 min ，取出冷却，于分光光度计波长420nm 处测定吸光度，绘制标准曲线。从标准曲线上查出试样的含量。4.6.5 结果计算见式（2）： X 等于 A/V（2）式中：X 试样中甲醛的含量，单位为毫克每升（mg/L）； A 从标准曲线上查出的相当的甲醛的质量，单位为微克（ug）； V 测定样液中相当的试样体积，单位为毫升（mL）。土壤微生物测定方法1 微生物纯培养传统的土壤生态系统中微生物群落多样性及结构分析大多是将微生物进行分离培养，然后通过一般的生物化学性状，或者特定

50、的表现型来分析，局限于从固体培养基上分离微生物。随着人们对土壤中微生物的原位生存状态研究，越来越发现常规的分离培养方法很难全面地估价微生物群落多样性。从土壤中简单提取和平板培养计数不能得到土壤微生物在土壤生态系统中的生活特征和生态功能1的信息。纯培养方法和原理大多从医药微生物引过来的，有些方法对土壤微生物研究并不很适合，譬如在自然土壤生态环境下许多土壤微生物处于贫营养，而在实验室用营养丰富的牛肉汁蛋白胨来测定土壤活细菌的总数，大量的贫营养微生物不适宜生长，测定结果误差大；一般实验室在分离培养土壤细菌时通常只是在28 下培养。尽管土壤中存在高温型细菌，但土壤中的低温型细菌则被忽视了。由于传统的平

51、板培养方法只能反映极少数微生物的信息，这些研究不能充分了解土壤微生物生态功能，也埋没了大量有很大应用价值的微生物资源。2 土壤酶用生物化学技术能快速地检测土壤酶活性，使土壤酶学研究在60年代后期至80年代比较热门，其中尿酶2、磷酸酶3、脱氢酶4在土壤中的含量和变化规律研究较多。但土壤酶测定方法用于土壤微生物研究的一个致命弱点是不能直接的反映土壤实际微生物状况。Visser 等对酶检测用于土壤微生物群落和土壤质量评价提出了怀疑5。Skujins(1978)认为脱氢酶本身的生物化学特征决定了它不可能以胞外酶状态存在于土壤中6。为了解决土壤酶测定中的评判问题，Beck（1984）提出了土壤微生物如微

52、生物量（microbialbiomass）、还原酶（reductase）、水解酶（hydrolase）的适宜指标，然而，这些指标从来没有被广泛采用。Beck（1984）和Trasar-Cepeda et al.（1998）认为把酶用于土壤质量评价指标是值得怀疑的，而且缺乏常规可行的酶测定手段，存在药品昂贵等问题7，8。Community-level physiological profiling (CLPP)是由Garland and Mills （1991）提出的另一种酶分析方法9，微生物群落降解95种不同单一碳源的能力可一次分析，其中BIOLOG GN微平板较多应用于研究土壤和环境微生物区

53、系。作者采用BIOLOG GN微平板培养分析施用生态有机肥对土壤微生物多样性和番茄青枯病的影响，结果表明，连作地施用生态有机肥后，番茄青枯病显著降低，土壤微生物多样性显著提高10。由于真菌、放线菌的代谢反应不能分解四氮叠茂，此方法只能检测微生物群落细菌（主要是革兰氏阴性菌）中快速生长的那部分微生物信息。不同的微生物对同一碳源的利用能力是有差异的，微生物对不同单一碳源的代谢指纹差异并不能简单地归纳为微生物群落数量和结构的差异，而且土壤微生物在BIOLOG系统中生长时，由于温育环境的改变引起微生物对碳底物实际利用能力的改变，同时在温育过程中存在适应性问题如代谢补偿、代谢适应等。但CLPP方法因快速

54、、简便而受到人们的欢迎，因而有专用于土壤和环境微生物生态研究的生态微平板（EcoPlates）（Insam，1997）11。土壤酶测定方法至今没有一个标准的参数和测定标准，不能对土壤微生物生态功能一个准确的答案，若要充分分析土壤特征，了解不同土壤之间的差异，一定要与其他的方法相配合。3 流（fluxs）土壤微生物是土壤生态系统中库（pool）和流的一个巨大的原动力。土壤酶测定一般要在适宜的条件下测定，不能作为土壤物流的原位评价。库和流的计算对土壤微生物学家来说很重要，测定土壤微生物呼吸（CO2的释放量），是较好的微生物群落总代谢活性指标12。N、NO3输入引起土壤酸化，甚至引起地下水的N污染。

55、氮的分配（N2O、NO等）对气候变化和臭氧层破坏有极大影响，生物固氮对缓解矛盾有重要的意义，同时也提高农作物产量和减少人类饥饿。从1970年以来，共生和非共生固氮研究很热烈。土壤微生物学家应用分子生物学技术在转基因作物和转基因工程菌方面研究，大大提高了生物固氮效果。许多传统方法，如N矿化测定，硝化潜力或用于反硝化测定的乙炔抑制方法仍然广泛使用。应用15N放射性标记方法可详细地了解土壤中或土壤微生物群落中的N分配和去向。土壤具有复杂的空间异质性，大多数养分流测定方法不适于田间测定，局限于实验室模拟，目前有较好的地理信息系统软件来统计和分析这些数据。Bruckner等（1999）测定土壤理化和生物

56、指标，研究了温带松果类森林土壤的的空间差异，发现土壤中某些养分转化过程需要在一定的生态点进行，如仅在一定团粒粒级范围内进行13。Rasiah等（1999）研究发现不同农业措施会引起土壤紧实度、质地和有机质特性变化14。Stenberg等（1998）研究26种不同性质土壤的微生物状况，也证明土壤有巨大的异质性15。4 库(pools)在生物地球化学循环中，常用“库”表示物质在生态系统中的滞留，生物量（如植物根系和动物区系生物量）和其它有机物（动植物凋谢物，土壤有机质）都是土壤生态系统最重要的“库”。土壤微生物生物量和土壤微生物区系、土壤呼吸强度、土壤酶活性、土壤微生物多样性等，常被研究者进行比较

57、研究。随着研究的深入，土壤学者发展了一系列的土壤微生物量测定方法，如直接镜检法、ATP分析法、熏蒸培养法、熏蒸提取法、底物诱导呼吸法。其中直接镜检法是在显微镜下计数一定面积下的微生物个数、体积及密度（一般采用1.18 g/cm3），计算出单位干土质量中所含的微生物生物量。该法的主要缺陷是技术难度大，误差大，操作复杂、不适合批量分析。Jenkinson（1976）提出了一种间接微生物量测定方法，即氯仿熏蒸杀死和溶解土样中微生物，重新培养土壤10 d，然后测定土壤呼吸。根据熏蒸与未熏蒸土样释放CO2量的差值，计算土壤微生物量C，此方法称为熏蒸培养法（fumigationincubation，FI）

58、16。但测定要花10 d，不适用于风干土样，对钙质土、淹水土壤，其结果均不可靠。Brookes et al.（1982，1985）提出了一种更直接的估计微生物P、N的方法（FE），土样经氯仿熏蒸后，用硫酸钾溶液浸提，从而测定微生物P、N，也可测定微生物C、S。此方法是目前较好的微生物量测定方法，FE方法针对不同的土壤、不同的要素制定不同的参数，这些参数的确定要慎重。此方法适合批量测定，适用土壤范围广，但值得一提的是熏蒸后氯仿必须被抽尽，否则，氯仿本身的C素被作为微生物C提取，使结果偏高。Anderson and Domsch（1978）提出了另一种微生物分析方法底物诱导呼吸方法（substra

59、te-induced respiration，SIR）17，此方法起源于纯培养研究，微生物对易利用底物的反映强度与微生物量存在线性关系，可用于土壤微生物量的测定。但计算参数目前还存在争议18。目前FE和SIR方法作为一些国家（如德国）土壤普查的标准方法。生态系统演替过程中的能量最优化性是生态系统进化的Odum理论的主要精髓（Odum，1969）11，根据此理论，系统的成熟程度增加，生态系统的呼吸效率/生物量的比值随之相应降低。既然所有初级生产力C最终都进入土壤C库，土壤微生物库的大小可作为土壤质量的一个可靠指标；可用于土壤长期和短期的养分动力学研究，其中微生物生物量是强有力的指标，它具有快速、

60、重复性好等优点；可通过微生物总量比较而认识农业措施和污染对土壤质量的影响；但它仍存在缺陷，只能反映部分功能和专性微生物，在一定程度上土壤生态系统物流能流或者微生物群落库的组成需进一步详细调查。5 生物标记物（biomakers）尽管企图测定库和流来反映土壤微生物状况，但土壤及其微生物仍是一个黑箱，只有少量的窗口（如可分离、培养、鉴定的微生物）打开，其微生物总量和物流的决定因子还不清楚。不同的生物体，其细胞壁和原生质的组成成分不一样，通过测定土壤中某些特有成分的含量，就有可能估价出土壤中微生物的生物量，如Jenkinson and Ladd指出22，所测定的成分必须符合4个条件，才能用于估算土壤