DNA遗传标记教学内容

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。DNA遗传标记-DNA遗传标记特点：1.直接反映基因特征，非推测。2.基因座位数量多，无论表达与否。3.多态性程度高，等位基因多，鉴别能力强。4.适合于陈旧的样品，检测能力强。5.灵敏度高，有利于微量样品的检测。6.易于检测手段的自动化、标准化，重复性好。逐渐取代了蛋白质水平的检测方法。DNA基础DNA结构与特征DNA分子结构线性大分子-基本单位为脱氧核苷酸组成-碱基、脱氧核糖、磷酸差别-碱基：嘌呤碱腺嘌呤（A）与鸟嘌呤（G）。嘧啶碱胞嘧啶（C）与胸腺嘧啶（T）。结构：碱基+脱氧核糖=脱氧核苷-+磷酸=

2、脱氧核苷酸DNA理化性质DNA的变性变性（denaturation）:在一定条件下，DNA双链间氢键断裂，形成单链结构的过程。也称退火（annealing）。条件：A：温度上升-Tm值(meltingtemperature)50%DNA分子解链的温度。与GC/TA比值有关。1%GC-0.4。B：碱性升高-0.5NNaOH-完全解链。DNA的复性复性（renaturation）撤除变性条件后，变性的单链DNA根据碱基互补的原则，恢复成DNA双链的过程。条件：A：温度降低过低易错配。过高不易复性。B：高离子强度。DNA分子杂交杂交（hybridization）：来源不同的两条DNA单链根据碱基互补

3、的原则，形成双链杂种DNA的过程。基因基因与基因组基因（gene）：合成有功能的蛋白质多肽链或RNA所需的全部核苷酸序列。基因组（genome）:一个生物体的所有基因。核基因组：细胞核中23对染色体包含的所有基因。线粒体基因组：线粒体DNA中的所有基因。基因结构结构基因：能够编码产生蛋白质产物的基因。外显子（exon）：编码序列。内含子(intron)：非编码序列（间隔序列）。如珠蛋白-1700碱基（bp），编码146个氨基酸，3个外显子，2个内含子。基因突变突变（mutation）：DNA分子中的核苷酸序列的改变。1）点突变（pointmutation）：单碱基置换。同义突变（samesen

4、semutation）:简并密码，无突变效应。错义突变(missensemutation)：新密码子，氨基酸序列变化，产生突变效应。无义突变(non-sensemutation)：变成终止密码，合成不完整多肽，产生突变效应。终止密码突变（terminatorcodonmutation)：合成过长的多肽，产生突变效应。移码突变（frame-shiftmutation)：DNA链中插入1个或几个单碱对，使突变处以下部位密码发生变化，使合成的氨基酸种类或序列变化，产生突变效应。2）片段突变：DNA链中小片段单碱序列发生缺失、重复或重排，产生突变效应。DNA多态性的分类长度多态性：等位基因片段长度的个

5、体差别。由一特定序列，首尾相连串联重复次数不同产生的个体差别。可变数目串联重复（variablenumberoftandemrepeat,VNTR）短串联重复(shorttandemrepeat,STR)A：产生原因：DNA滑动与同源染色体不等交换。B：差别：VNTRSTR重复序列组成2-7bp7-数十bp重复序列数目2-10数个10数个-数百个鉴别能力高极高优势扩增现象不明显极明显检测灵敏度极高稍差片段总长度200-500bp数千以上bpC：STR的命名：非编码区-D3S1358D3第三号染色体S单拷贝（singlecopy）VNTR序列的发现序号编码区内含子-HumHPRTB次黄嘌呤磷酸核

6、糖转移酶基因（hypoxanthinephosphoribosyltransferase）序列多态性：DNA片段碱基排列顺序的个体差别。单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism,SNPs）原因：碱基的置换、插入、缺失。特点：多位于非编码区，选择压力。数量多，1/1000bp，300万二态性，2个等位基因，多态性程度较低。孤立事件，人类遗传学意义大。第二部分DNA置备核心与关键脑肺肌肉肾6pg/细胞理想DNA样品的要求纯度-RNA、蛋白质、多糖、脂类。完整性-DNA大分子。DNA量。g/指纹图；ng/PCR；pg/PCR经典DNA提取法在弱碱和螯合剂的条件下行组织

7、匀浆，溶解胞、核膜。去垢剂与蛋白酶消化蛋白，分离DNA。有机溶剂去除蛋白，萃取DNA。乙醇与盐类沉淀DNA。试剂的使用原理弱碱和螯合剂：Tris-HClpH8.0，DNA分子稳定。EDTA（乙二胺四乙酸）-抑制核酸酶。通过螯合镁离子。去垢剂与蛋白酶：SDS（十二烷基磺酸钠）增加膜通透性；促进DNA与蛋白质分解；促使核酸酶与蛋白质变性。蛋白酶K，酶解组蛋白。有机溶剂：酚-变性沉淀蛋白质，组蛋白、蛋白酶等。PH6.0，需Tris-HClpH8.0平衡。氯仿-变性沉淀蛋白质，除酚，水相分离。异戊醇-除酚，除泡沫。乙醇与盐类：DNA不溶于乙醇与盐类。基本步骤样品处理-分离细胞，低渗盐水或细胞悬浮液。1

8、0mmol/LTris-HClpH8.0,0.1mol/LEDTA,20mg/ml胰RNA酶,0.5%SDS.消化-TNE（15mmol/LTris-HClpH8.0,15mmol/LEDTA,5mmol/LNaCl）4ml，10%SDS0.45ml，10mg/ml蛋白酶K（终浓度，100g/ml），混匀，503h，45过夜。DNA提取-等体积饱和酚-等体积饱和酚/氯仿/异戊醇（25/24/1）-氯仿/异戊醇（24/1）。500r/min,10min.沉淀DNA-1/10体积3mol/LNaAc，2倍无水乙醇-70%乙醇。室温挥干。溶解DNA-适量TE（10mmol/LTris-HClpH8.

9、0,1mmol/LEDTA,长时间。五、其他方法1.Chelex-100提取DNA基本成分：含有亚氨基二乙酸盐离子的苯乙烯-二乙基苯共聚物。基本方法：沉淀细胞；5%试剂200l；560.5h以上；1008min；剧烈震荡；离心上清。注意：离心彻底。2.硅珠法提取DNA基本成分：GuSCN（硫氰酸胍，蛋白变性剂）与二氧化硅（硅珠，核酸吸附剂）。基本方法：血液（1-4l）TES（100l）SDS（20l）煮沸5min；300lGuSCN溶液与20l硅珠液保温15min；离心；离心加GuSCN溶液；离心加乙醇漂洗；TES5610min离心取上清。3.直接煮沸法，10010min六.注意事项如消化不完

10、全，可用TNE溶解后再重提。消化时间宜长不宜短。操作轻柔。混匀要充分。挥干不宜过度。七.不同生物性检材的DNA制备1.混合斑二步提取法（精液与阴道液）原理：精子细胞膜富含硫醇蛋白，包裹DNA的鱼精蛋白富含半光氨酸，二硫键丰富，可抵抗蛋白酶作用。二硫苏糖醇（DTT）可还原二硫键，使蛋白酶发生作用。方法；（1）分离细胞成分。（2）常规消化。（3）加10%SDS40l，1mol/LDTT16l，10g/l蛋白酶K4l，37过夜。（4）常规处理。2.八.DNA定量1.凝胶电泳半定量分析法标准参照分析。2.分光光度计分析原理：核酸于260nm波长为吸收峰，1OD值为50g/l双链核酸（40g/l单链核酸

11、），根据OD值可计算DNA含量。蛋白于280nm波长为吸收峰，260/280比检测核酸纯度。1.6-1.8九.DNA纯化第三部分聚合酶链式反应技术聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）在模板DNA和4种脱氧核苷酸存在的条件下，由一对特异性引物限定的靶DNA片段，经DNA聚合酶催化的体外合成过程。PCR的基本过程1.变性（denaturation）:在加热的条件下（94左右），模板DNA配对碱基间氢键断裂，DNA双链变成单链。2.退火（annealing）：在降温的条件下（55-62），引物与其互补的模板DNA结合形成杂交双链。3.延伸（extension）：在

12、合适的温度下（68-72），经DNA聚合酶催化4种脱氧核苷酸，由引物的3端为起始点，从5向3端延伸，合成新的与模板DNA互补的DNA链。每反应一个循环，靶DNA片段数量增加一倍，并以指数的量堆积，经30余次循环，产物量可达到2105-7个拷贝。几个循环后扩增产物作为模板。二、PCR反应的体系标准体系为50-100l，常用20l。DNA模板/DNA聚合酶/一对引物/4种脱氧核苷酸/缓冲液。反应条件：954-5min,9430s,55-6230s,7230-60s,30循环后725-10min。三、试剂的要求：1.引物：人工合成的单链DNA。A：长度15-30bp。Ln=2(G+C)+(A+T)1

13、000极强有力支持法医学专业硕士研究生面试题（专业笔试部分）1.阐述从事法医学专业工作应具备的基本素质。2.从事法医学鉴定应遵守的基本原则是什么。3.法医学工作的基本内容有那些。4.你认为法医学“死因鉴定”还存在哪些问题。在法医学研究领域还有哪些亟待解决的课题。法医鉴定学一、概述（一）法医鉴定学的概念1.法医鉴定学的定义法医鉴定学是为司法机关客观准确的判断案情提供客观依据，应用现代科学理论与技术研究法医学鉴定的原理、方法与程序的学科。在定义中包含以下内容：（1）目的：为司法机关客观准确的判断案情提供客观依据，重要的在于提供客观依据，通过“鉴定书”等形式，只有“依据”是客观、科学、准确的，才能保

14、证判断案情的客观、准确。使我国社会主义法制服务得到健全与巩固。（2）方法：现代科学理论与技术，研究的是理论与方法，但涉及的理论与技术学科广与新：自然科学（生物学、医学等）与社会科学（法律、逻辑、伦理）无所不及；最新的成果（如分子生物学技术）不断的应用。（3）研究内容：法医学的鉴定原理、鉴定方法、鉴定程序。保证鉴定结论客观、准确、科学、合法。2.鉴定及特性鉴定的字义解释：“鉴”为审视、审查、检测、检验、分析、鉴别等，是一个过程。“定”为认定、判定、确定、断定等，为得出结论。“鉴定”一般指受聘的专业人员应用掌握的专业知识通过对某客体检测、分析，就专门性问题作出判断的过程。一般特征有：（1）普遍适用

15、性：需要鉴定的专门性问题多，从古到今，增多趋势明显。必须鉴定。（2）科学客观性：科学性应为专家利用专业知识。客观性鉴定人与事件必须无关。（3）程序规范性：必须符合特定的程序，保证发挥社会效应。否则非鉴定。3.法医学鉴定法医学鉴定是要解决法律实践中有关医学问题的鉴定，随着我国社会主义法制建设的不断完善与改革开放与国际接轨形势的要求，法医学鉴定的内容、数量、质量、时限等要求越来越高。法医学鉴定自身特点：（1）法律法规依据：刑事诉讼法、民事诉讼法、行政诉讼法等有指派鉴定的相应规定，其他法律法规也有相应规定（如医疗事故处理条理）。（2）是诉讼或调查的程序之一，符合诉讼法或部门法相关规定。（3）法医学鉴

16、定结论是具有证据效力的法定证据之一。（二）法医鉴定学的任务1.科学完善法医学鉴定理论法医学鉴定涉及范围广，人体极其复杂，科学处于发展过程中。应系统鉴定理论。处理好表里、因果等关系，科学准确的得出结论。2.将最新的科技手段引入法医学鉴定领域，规范方法，保证结果客观。并提高鉴定水平与质量。提高案件处理率。3.完善法医学鉴定程序，提高鉴定结论的证据效率（四）法医鉴定学的历史与发展司法体制的建立顺应社会发展的需要，各级官员为行政人员，必须有相关的专业人员配合以保证提供处理案件作为依据的证据的准确。礼记。月令记载“命理瞻伤，察创，视折，审断，决狱讼必端平”。“理”为法医检验与鉴定的官员，并反映出检验与鉴

17、定是正确处理案件的必备程序。南宋（1247年）洗冤集录（宋慈）内容包括“检覆总说、疑难杂说、初检、复检、验尸、验骨、自缢、溺死、杀伤、火死、服毒、跌死、雷震死、蛇虫伤死”等53个检验项目。是世界上第一部系统全面的法医学检验鉴定古典巨著。秦朝既有“手足痕迹”检验用于侦破有关案件的记载（封诊式关于盗墓侦破记载）中国历史上“指纹”的应用。“滴血（骨）验亲”方法的开发应用等。近代，1562年法国医生巴雷经尸体解剖作出“升汞中毒”的结论。二、法医学鉴定体制（一）法医学鉴定机构（二）鉴定权1.鉴定决定权2.鉴定执行权3.鉴定管理权（三）法医学鉴定人1.法医鉴定人及地位2.法医鉴定人的条件与资格3.法医鉴定

18、人的权利4.法医鉴定人的义务（1）按时完成鉴定任务，时限的要求，特殊情况应向委托机关申请延期。（2）按鉴定要求出具鉴定书，标准格式，签名以示负责。（3）依法申请回避，当事人、其他讼诉成员、有亲属或利害关系者。（4）根据要求按时出庭举证，并接受相关人员质证，有正当理由经审判长批准可不出。（5）对违反法律的行为应承担法律责任。（四）鉴定形式的分类1.初次鉴定2.补充鉴定由原鉴定部门对已经得出的鉴定结论进行补充。（1）有新的材料与案情。（2）有新的鉴定要求。（3）原鉴定书表述不确切或不完全。3.从新鉴定对以有鉴定结论有疑义而委托新的鉴定单位对同样的专门性问题进行鉴定。4.联合鉴定对争议较大的出现不同结论的（或疑难的）案件，由鉴定部门聘请有权威的专家（不同部门）进行的鉴定。意见不同可分别出具鉴定书。三、法医学鉴定程序（一）现场勘验与样品的收集（二）鉴定的委托1.鉴定的决定案件涉及到专门性问题时，案件处理涉及到定性与定量的问题，应提请鉴定。2.鉴定项目的提出（1）鉴定项目是法律规定必须解决的专门问题。（2）鉴定项目是目前的科学技术能够解决的问题。（3）送检材料必须符合鉴定要求。3.鉴定机构与鉴定人的选择（1）鉴定人的资格。（2）鉴定人的