细菌药物敏感试验

1、细菌药物敏感试验第一节 临床常用抗菌药物抗菌药物 是指具有杀菌或抑菌活性的抗生素和化学合成药物。 前者是真菌、放线菌、细菌等的代谢产物，后者是经化学改造的半合成抗生素和化学合成药物。一、青霉素类抗生素：包括青霉素G、耐青霉素酶青霉素、 广谱青霉素(氨苄青霉素、美洛西林、哌拉西林 )等。二、头孢菌素类抗生素：第一代(头孢唑林、头孢氨苄、头 孢拉定 )、第二代(头孢孟多、头孢西汀，头孢呋新，头孢克 罗等 )、第三代 (头孢哌酮（先锋必）、头孢三嗪（菌必治）、 头孢噻肟钠、头孢他啶、头孢唑肟等) 。第四代如头孢地嗪、 头孢噻唑肟、头孢吡肟等。适用于多重耐 药G-杆菌严重 感染，对厌氧菌也有很好的抗菌

2、作用 三、其他内酰胺类抗生素 （一）单环内酰胺类抗生素: 主要有氨曲 南和卡芦莫南。 抗菌药物的分类（二）头霉素类和氧头孢烯类抗生素: 主要 有头孢西丁、头孢替坦、头孢美唑。（三）碳青霉烯类抗生素: 主要有亚胺培南、 米洛培南、必安培南、帕尼培南。（四）内酰胺类抑制剂: 主要有克拉维酸 舒巴坦和他唑巴坦。所有内酰胺类抗生素都能抑制细胞壁粘肽合成酶，即青霉素结合蛋白（penicillin binding proteins ，PBPs），从而阻碍细胞壁粘肽合成，使细菌胞壁缺损四、氨基糖苷类抗生素 可干扰细菌蛋白质合成,主用于对革兰氏阴性菌、绿脓杆菌等感染 的治疗 按其来源分为： 由链霉菌属发酵滤液

3、提取获得，有链霉素、卡那 霉素、妥布霉素、核糖霉素、巴龙霉素、新霉 素； 由小单胞菌属发酵滤液中提取，有庆大霉素、福 提霉素； 半合成氨基糖苷类，有阿米卡星、奈替米星、地 贝卡星等。 五、喹诺酮类抗生素 是一种DNA旋转酶抑制剂，它作用于细菌DNA旋转酶，干扰DNA超螺旋结构的解旋，从而阻碍DNA的复制。 第一代 为窄谱抗生素，有新恶酸、奈啶酸和恶 喹酸。第二代 为广谱类抗生素，抗菌强度依次为环丙 沙星、氧氟沙星、洛美沙星、氟咯沙星、 培氟沙星、诺氟沙星。第三代 为超广谱类抗生素，有司帕沙星、妥舒 沙星、左氟沙星等。 六、大环内酯类抗生素: 作用于核糖体50S亚基，抑制肽酰基转移酶，阻止转肽作

4、用和mRNA位移，抑制细菌蛋白质的合成。 常用的有：红霉素、柱晶白霉素、麦迪霉素、乙酰螺旋霉素。 七、四环素、氯霉素和林可酰胺类抗生素 （一）四环素为广谱抗生素，能特异性地与细菌核糖体30S亚基的A位置结合。抗菌活性的顺序 为米诺环素多西环素美他环素地美环素。（二）氯霉素类抗生素，包括氯霉素、 甲砜霉素。（三）林可酰胺类抗生素，主要有盐酸 林可霉素、克林霉素。八、糖肽类抗生素 常用的有万古霉素 和替卡拉宁 九、磺胺类药物及增效剂分三类： 用于全身感染的药物，分为短效、 中效、长效三类，有磺胺甲恶唑， 磺胺嘧啶、磺胺甲氧吡嗪； 肠道起作用的药物有柳氮磺胺啶银、 磺胺二甲氧嘧啶； 局部应用的药物有

5、磺胺米隆、磺胺 醋酰钠。十、其他合成抗菌药 用于肠道、尿路感染和 外用消毒 ，有呋喃坦啶和呋喃唑酮。 2.硝基咪唑类 对厌氧菌有抗菌作用，对 需氧菌无效，有甲硝唑和替硝唑。 第二节 抗菌药物敏感性试验 （AST）一、意义可预测抗菌治疗的效果， “敏感”治疗可能有效； “耐药” 肯定失败；指导医生选择使用抗生素，AST的结果为“耐药”，即应更换药物；提供所选择药物的依据；监测耐药性，分析耐药菌变迁，掌握耐药菌感染 病流行病学，控制和预防耐药菌感染发生和流行。二、试验常规抗菌药物选择 在临床上将试验药物分成A、B、C、U四组, A组 所列的抗生素为常规首选药敏试验药物,B组 为临床使用主要抗生素,

6、尤其在医院感染时使用的抗生素，可在下列情况下使用：对A组同类抗生素耐药；标本来源不同时，如三代头孢菌素使用于脑脊液中的肠杆菌，磺胺甲恶唑使用于尿道分离的细菌；多种微生物感染；多部位感染；感染流行的控制；对A组抗生素过敏、耐受或无反应。C组 药物用于对A组药物耐药的流行菌株或 对A组药物过敏的病人和某些不常见的 细菌（如肠外分离的沙门菌属或耐万 古霉素肠球菌）。U组 仅用于尿道中分离的细菌，不作为尿 道外分离菌的常规药敏试验。 建议非苛氧菌常规药敏试验和报告应考虑的抗菌药物分组细菌A组B组C组U组肠杆菌科氨苄西林头孢唑啉头孢噻吩庆大霉素阿莫西林/克拉维酸或氨苄西林头孢孟多或头孢呋辛头孢吡污头孢美

7、唑头孢哌酮头孢西丁头孢噻污环丙沙星或左氟沙星亚胺培南甲氧苄定氨曲南头孢他啶(可指示产ESBLs)氯霉素卡那霉素奈替米星四环素妥布霉素羧苄西林洛美沙星或氧氟沙星加替沙星氯碳头孢磺胺异恶唑甲氧苄啶呋喃妥因 建议非苛氧菌常规药敏试验 和报告应考虑的抗菌药物分组细菌A组B组C组U组 葡 萄 球 菌 属 细 菌苯唑西林青霉素阿奇霉素或克拉霉素或红霉素克林霉素万古霉素泰利霉素利奈唑胺环丙沙星或左氟沙星或氧氟沙星氯霉素庆大霉素利福平四环素罗美沙星或诺氟沙星磺胺异恶唑甲氧苄啶呋喃妥因(一）非苛养菌药敏试验抗生素的选用 A组一级试验并常规报告的抗微生物药 , 如葡萄球菌属用苯唑西林和青霉素。B组一级试验有选择报

8、告的抗微生物药 , 如肠球菌属用万古霉素 。C组补充试验有选择报告的抗微生物药， 如葡萄球菌属用氯霉素 。U组仅用于泌尿道的补充实验的抗微生物药，如葡萄球菌属用洛美沙星和诺氟沙星。(二）苛养菌药敏试验抗生素的选用A组一级试验并常规报告的抗微生物药, 如肺炎链球菌用红霉素和青霉素。B组一级试验有选择报告的抗微生物药, 如肺炎链球菌用头孢噻肟或头孢曲 松。C组补充试验有选择报告的抗微生物药， 如肺炎链球菌用头孢呋辛。 稀释法和纸片扩散法 稀释法是在体外定量检测抗菌药物抑制待测菌生长活性的方法,抗菌药物在液体或固体培养基中稀释. （一）液体稀释法 原理: 以MH（水解 蛋白）液体培养基将抗菌药物做不

9、同浓度的稀释，然后接种待测菌，定量测定抗菌药物抑制或杀死该菌的最低（或最小）抑菌浓度（minimal inhibitory concentration,MIC）。 三、药敏试验方法材料： 抗菌药物(配制见表) 培养基：一般采用MH液体培养基。 接种菌液的准备：8 cfu/ml ）标准，再用MH液体培养基进行1：200的稀释后，在15 min内用完。 无菌小试管：10-15支 无菌吸管： 35培养箱操作步骤：取10支小试管，除第一支外，其余每管加于MH培养基1ml.吸取抗菌药物原液（ 1000 g/ml）5.12ml,加入液体培养基，混合，吸出2ml加入第一和第二管中，每管加1ml，第二管混合后

10、取出1ml加入第三管，依次类推直至9管，吸取1ml去掉，各管抗菌药物的实际含量依次分别为512、256、128、64、32、16、8、4、2、1 g/ml ；另设培养液对照、待测菌生长对照、和质控菌生长对照。3. 将一定浓度的待测菌悬液依次加入上述各管中，每管，混匀。放入35培养箱12-18小时后观察结果。4. 结果判断：凡无肉眼可见细菌生长的药物最低浓度即为该待测菌的最低抑菌浓度（MIC）; 再以容量接种环无菌管中取出一环种于血平板作次代培养，经35培养过夜后，观察最低药物浓度能杀死99.9%原始种于的细菌者，即为该菌的最低杀菌浓度（MBC）。影响因素 1.培养基 pH、渗透压、电解质对结果

11、均有影响。在MH培养基上不生长的细菌除外，一般都用该培养基。 2.抗菌药物 必须采用标准粉剂。 3.结果观察时间，应在12-18小时之间观察。质量控制： 每次试验时应根据待测菌的不同而分别选用：金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠艾希菌ATCC25922、粪肠球菌ATCC29212和铜绿假单胞菌ATCC27853等标准菌株在同一实验条件下作平行试验。其结果（MIC）超过或低于预期值范围一个稀释度以上，不应向临床发出报告。 （二）琼脂稀释法 原 理 琼脂选择法是将药物混匀于琼脂培养基中，配制含不同浓度药物平板，使用多头接种器接种细菌，经孵育后观察细菌生长情况，以抑制细菌生长的琼脂平板所含药物浓

12、度测得 MIC。 结果判断 将平板置于暗色、无反光表面上判断试验终点，以抑制细菌生长的药物稀释度为终点浓度（磺胺可见少许散在细菌生长）。 结果报告 可用 MIC（g/ml）或用敏感S）、（中介（I）和耐药（R）报告。纸片琼脂扩散法 （一）试验原理 将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中水分溶解后不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内细菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈。 抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。 (二)材料1抗菌药物纸片 选择直径为635mm， 吸水量为20l

13、的专用药敏纸片用逐 片加样或浸泡方法使每片含药量达规 定所示。含药纸片密封贮存28 且不超过1周。2培养基 水解酪蛋白（MH）培养基是 兼性厌氧菌和需氧菌药敏试验标准培 养基，4保存。（三）方法： 1.用05麦氏比浊标准的菌液浓度，在琼 脂表面均匀涂片,在15min内接种完毕。 2.将含药纸片紧贴于琼脂表面, 35孵育18h后阅读结果。（四）结果判断和报告 用精确度为1mm的游标卡尺量取抑菌圈直径。根据NCCLS标准， 作出“敏感”,“耐药”和“中介”的判断。纸片法药敏试验抑菌圈直径与结果解释的标准抗菌药物与细菌 纸片含量 抑菌圈直径：mm 相应MIC g/ml 耐药 中介度 敏感 耐药 敏感

14、丁胺卡那霉素 30g 14 15-16 17 32 16 氨苄青霉素 测肠杆菌 10g 11 12-13 14 32 8 测葡萄球菌 10g 28 29 测嗜血杆菌 10g 19 20 4 0.25 测肠球菌 10g 16 16 2 E 试 验 （一）原理 E试条是一条 5mm50mm的无孔试剂载体，一面固定有预先制备的，浓度呈连续指数增长稀释抗生素，另一面有读数和判别的刻度。将E试条放在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育过夜，围绕试条明显可见椭圆形抑菌圈，圈的边缘与试条交点的刻度浓度即为抗生素抑制细菌的特定浓度,又称抑制浓度（IC），它与MIC呈高度相关。 （二）细菌接种和加样 使用厚度为4mm

15、MH琼脂平板，用0.5麦氏浓度的对数期菌液涂布，待琼脂平板完全干燥，用E试验加样器将试条放在已接种细菌的平板表面，试条全长应与琼脂平板紧 密接触，试条MIC刻度面朝上浓度最大处靠平板边缘。 （三）结果判断和报告 读取椭圆环与E试验试条的交界点IC值。 与NCCLS的稀释法MIC参考值高度相关。四、药物敏感试验结果解释 “敏感”即表示测试菌可被测定药物常规剂量 给药后在体内达到的血药浓度所抑制“耐药”即表示测试菌不能被在体内感染部位 可能达到的抗菌药物浓度所抑制，临 床治疗无效。“中介”者提示该细菌对常规用药体液或组织 中的药物浓度的反应率低于敏感株， 使用高于正常给药量有疗效。 五、自动化仪器

16、检测 ViterATB系统和Microscan是半自动或全自动细菌鉴定和药敏系统，通过系统中药敏专家系统可报告分离菌的药敏结果。 第三节 细菌耐药性和产生机制一、细菌的耐药性 对某种抗菌药物敏感细菌变成对该药物耐受称细菌耐药性。 它可分为天然耐药和获得性耐药，前者是通过染色体DNA突变而致，后者往往是由质粒、噬菌体及其他遗传物质携带外来DNA片段导致产生的耐药性。 突变可由细菌自发产生或在X线等物理因素或化学物质诱导产生，一般只对一种或两种相似药物耐药，在细菌耐药性上不占主要地位。 获得性耐药可通过接合、转化。转导、转换形式产生耐药 。二、细菌耐药性的生物化学机制 1. 产生内酰胺酶，水解药物

17、内酰 胺环而失去抗菌活性。2. 产生钝化酶使抗生素失活，钝化酶有三类： 氨基糖苷类钝化酶 ； 氯霉素乙酸转移酶； 红霉素酶和其他灭活酶。3.青霉素结合蛋白改变，导致对抗生素的 亲和力下降 。4.药物作用靶位的改变使抗生素不易结 合产生耐药性。5.抗菌药物渗透障碍，如外膜蛋白减少 和药物外排作用等。6.代谢途径的改变 。 第四节 细菌耐药性检测 一、特殊菌耐药性表型检测（一）耐药筛选试验：琼脂筛选试验 以单一药物单一浓度检测某种细菌的耐药性。 在含一定浓度测试药物的特殊培养上，点种0.5麦氏比浊度直接菌落配制细菌悬液，35孵育24h后观察平板上是否有菌落生长识要有1个菌落生长，均视为耐药。 临床

18、上常用于对耐甲氧西林葡萄球菌、耐 万古霉素肠球菌，对庆大霉素或链霉素高水平 耐药的肠球菌的检测。（二）折点敏感试验仅用特定抗生素浓度（敏感、中介或耐药折点MIC）而不使用测定MIC时所用系列对倍抗生素浓度测试细菌对药物的敏感性称折点敏感试验。当选择区分中介和耐药折点值药物浓度时，若两种抗药物浓度培养基均生长可判断为耐药；如在两种药物浓度均不生长则为敏感；仅在较低药物浓度培养基中生长提示为中介。（三）双相纸片试验度菌液。均匀涂布于MH平板。中央贴上阿莫西林/克拉维酸纸片，在距该纸片25mm处分别贴头孢噻肟或头孢曲松、头孢他啶和氨曲南等药敏纸片作为指示剂，35孵育18h观察结果。 若指示剂在朝向阿

19、莫西林/克拉维酸方向有抑菌圈扩大的现象（协同现象），则说明待检菌产生超广谱内酰胺酶。（四）自动化仪器 自动化仪器Microscan有测定抗菌药物抑菌的MIC值功能。 原理是先测定细菌对抗生素的MIC值，当头孢他啶与头孢他啶十克拉维酸的MIC比值或头孢噻肟与头孢噻肟十克拉维酸的MIC比值大于或等于8（即3个对倍稀释度）即判定为此细菌产生ESBL。二、 内酰胺酶检测 1.头孢哨噻吩滤纸片法 用接种环挑取受试菌于商品化头孢哨噻 吩滤纸片上，于10分钟内由黄色转变为 红色即阳性结果，示产色头孢菌素的 内酰胺环被酶打开。 2 .碘淀粉测定法 用接种环挑取受试菌混于青霉素溶液中， 室温下振摇30分钟。加入

20、淀粉液后，再加 入碘液，溶液变蓝，继续振摇。若检测菌 产生酶，则可水解青霉素内酰胺环变 为青霉素噻唑酸，后者与碘结合，使碘淀 粉复合物转变为无色，10分钟之内蓝色消 失者为产酶株。四、特殊耐药菌检测 （一）耐甲氧西林葡萄球菌检测1定义 对1g苯唑西林纸片的抑菌圈直径 10mm，或其MIC4gml的金黄色葡萄球菌； 对1g苯唑西林抑菌圈直径17mm，或MIC 05gml的凝固酶阴性葡萄球菌； 都称耐甲西林葡萄球菌（MRS）。2临床意义 MRS不论其体外药敏试验结果，所有的内酰胺类药物和内酰胺内酰胺酶抑制剂均无临床疗效； 绝大多数的MRS常示多重耐药，包括氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类。 （二）

21、耐青霉素肺炎链球菌检测1.定义 当对1 gml苯唑西林纸片抑菌 圈20mm或MIC006 gml互应视 为耐青霉素肺炎链球菌（PRSP）。2.临床意义PRSP对氨苄西林、氨苄西林 舒巴坦、头孢克肟、头孢唑肟，临床治 疗的疗效很低。但应检测对头孢曲松、 头孢噻肟和美咯培南的MIC以判断是否对 这些抗生素敏感。 （三）耐万古霉素肠球菌检测1定义 对 30g万古霉素纸片抑菌圈直 径 14mm或其 MIC32gml应视 为耐万古霉素肠球菌（VRE）。2临床意义 对青霉素敏感的VRE可用青霉 素和庆大霉素联合治疗，若对青霉素耐 药而不是高水平耐氨基糖苷类可用壁霉 素庆大霉素。 （四）超广谱内酰胺酶肠杆菌

22、科细菌检测 1定义 超广谱-内酰胺酶就是能水解青霉素、头孢菌素及单胺类的酶，主要由克雷伯菌和大肠埃希菌、肠杆菌等细菌产生。 初筛试验 使用1种以上药物，其抑菌环直径满足以下条件： 对 头孢泊肟、头孢他啶（10ug片）抑菌圈 22mm 或 氨曲南、头孢噻肟（30 ug片） 27mm 为初筛试验阳性即为产ESBL菌株。 确证试验 经头孢他啶（30ug片）、头孢他啶克拉维酸（3010ug）； 头孢噻肟30ug、头孢噻肟克拉维酸（3010ug） 两组中任何一组药物加克拉维酸与不加克拉维酸相比，其抑菌环增大5mm者，判断为产ESBL菌株。 同K-B法单纸片扩散法（初筛试验）将0.5麦氏单位的待检菌液涂抹

23、于MH琼脂平板上，稍干后，在琼脂培养基上贴头孢他啶(Ceftazidime,CAZ)、头孢噻肟(Cefotaxime,CTX)、头孢曲松(Ceftriaxone,CRO)、氨曲南(Aztreonam,ATM)、头孢泊肟(Cefprozil,CPD)纸片，置35过夜培养，若抑菌环直径CAZ22mm、CTX27mm、CRO25mm、ATM27mm、CPD22mm时可疑为产ESBLs菌株。 双纸片增效法（确认试验）将0.5麦氏单位的待检菌液涂抹于MH琼脂平板上，稍干后，在琼脂培养基上分别贴头孢他啶/克拉维酸、头孢噻肟/克拉维酸、头孢曲松/克拉维酸、氨曲南/克拉维酸、头孢泊肟/克拉维酸纸片，置35过夜

24、培养后量取抑菌环直径，与单纸片平皿对照，若加克拉维酸纸片较未加克拉维酸纸片抑菌环直径5mm，即为ESBL阳性。 3临床意义 产ESBL克雷伯菌和大肠埃希 菌不论其体外药物敏感试验结果如何， 对青霉素、头孢菌素和氨曲南治疗无 效。 第五节 抗分枝杆菌药物敏感性试验 一、抗分枝杆菌药物 第一线药物为异烟肼、利福平、吡酸胺、 乙胺丁醇和链霉素； 第二线药物包括对氨基水杨酸、乙硫异 烟胺、环丝氨酸、卷曲霉素、卡那 霉素、丁胺卡那霉素和利福布丁。 二、结核分枝杆菌和缓慢生长分枝杆菌体外抑菌试验 （一）结核分枝杆菌体外药敏试验指征 首次分离的分枝杆菌需做药敏试验，有助于合理用药和监测药物敏感性。 另外经过

25、三个月正规治疗，标本分离培养仍为阳性患者，或感染的严重疾患（如播散性结核病和结核性脑膜炎）以及来自高耐药流行区的患者，均须做体外药敏试验。1培养基 Middlebrook7H10琼脂添加油 酸、白蛋白、葡聚精触酶是慢生菌比例 法的推荐培养基；2药敏试验药物 抗菌药物直接来自厂商， 不能用治疗的抗结核药物作为试验用 药。药物原液浓度至少为1000g/ml， 20贮存期6个月。3细菌接种直接比例法药敏试验采用涂片阳性患者标本；接种物是充分消化、无杂菌污染的标本,接种菌液的稀释方法如下：抗酸染色（1000 ）未见细菌，荧光染色（450）25，菌液不稀释。抗酸染色（1000）l10，荧光染色（450）25250，菌液稀释或 101，102。观察含药琼脂格细菌生长情况用以4 表示：（：50100个菌落；2：100200个菌落；3：200500个菌落；4 ：500个以上菌落）。若测试菌生长数大于对照格菌落数1，即判读为耐药菌。 6质量控制结核分枝杆菌 H37RV ATCC 27294为一线、二线药的敏感质控菌株；H37RV ATCC35820为链霉素耐药质控菌株；H37RV ATCC35822为异烟耐药质控菌株；H37RV ATCC35826为环丝氨酸耐药质控菌株；H37RV ATCC35827为卡那霉素耐药质控菌株；三、快速生长分枝杆菌体外药敏试验